Défis technologiques associés au développement des cultures probiotiques

Le microbiote intestinal

Selon la définition de Isolauri et al. (2002), la flore intestinale normale est une collection complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement le tractus gastrointestinal et remplissant un rôle dans la nutrition, la physiologie et le contrôle du système immunitaire de l‘hôte Après une colonisation complète, la microflore intestinale est considérée comme un organe acquis après la naissance (Bruno, 2012). Il est constitué d‘une grande diversité d‘espèces microbiennes assurant différentes fonctions pour l‘hôte. La microflore du tractus gastro-intestinal a été estimée à près de 1013-1014 cellules microbiennes représentant 400 à 600 espèces et sous espèces (Bäckhed et al., 2004). Cette microflore représente environ 10 fois le nombre total de cellules du corps humain. La prévalence des bactéries dans le tractus gastro-intestinal dépend des conditions régnant dans le compartiment du tractus. Deux catégories de bactéries ont été identifiées : les bactéries autochtones ou indigènes se trouvant dans des niches particulières, et les bactéries allochtones ou transitoires (comme les probiotiques) rencontrées dans d‘autres habitats du tractus (Bäckhed et al., 2004).

La majorité des bactéries pathogènes sont allochtones et vivent normalement en harmonie avec l‘hôte, excepté lorsque l‘équilibre du système est rompu. Du point de vue microbiologique, comme le montre la figure 4, l‘environnement gastro-intestinal comprend trois régions principales qui offrent des conditions très différentes pour la survie des différents microorganismes. Dans le premier compartiment, l‘estomac, la prolifération microbienne est fortement réduite par la présence d‘oxygène apporté par la déglutition (29% de la teneur en oxygène de l‘air) ainsi que par la présence d‘une forte acidité. De ce fait, l‘estomac héberge sélectivement les microorganismes acidotolérants et anaérobies facultatifs comme les lactobacilles, streptocoques, levures, etc. Dans le deuxième compartiment qui est le petit intestin, la microflore est constituée essentiellement de bactéries anaérobies facultatives tels que les lactobacilles, les streptocoques et les entérobactéries, et anaérobies strictes notamment les bifidobactéries, les bactéroides et les clostridies. La teneur en oxygène du petit intestin est de 4.6%. Dans le dernier compartiment qui est le côlon, le transit digestif est plus lent et la flore microbienne est plus abondante, représentant 35 à 50% du volume du contenu du colon humain (Cummings et al., 1989) La microflore du colon est très complexe et dominée par les bactéries anaérobies strictes (Bacteroides spp., Clostridium spp., Bifidobacterium spp., Atopobium spp…). Tandis que les bactéries anaérobies facultatives sont moins nombreuses et représentées par les lactobacilles, les entérocoques, les streptocoques et les Enterobacteriaceae. Les levures (ex. Candida albicans) sont assez faiblement représentées. La charge microbienne dans les différents compartiments a été estimée à environ : 104, 103-4, 105-7, 107-8 et 1010-11 (ufc)/g dans l‘estomac, le duodénum, le jéjunum, l‘iléon et le colon respectivement (Ouwehand and Vesterlund, 2003). Les principaux composants de la flore du colon ainsi que leurs effets sur l‘hôte sont présentés dans la figure 6.

Taxonomie

Les bifidobactéries ont été découvertes pour la première fois dans les fèces infantiles nourris au lait maternel par Tissier (1900), qui a isolé une bactérie avec une forme étrange et caractéristique de Y et l’a appelée Bacillus bifidus. Cette bactérie était anaérobie, Gram positive et n’a pas développé de gaz pendant sa croissance. Depuis leur première description, la classification de ces bactéries n’a cessé d’être révisée passant du genre Bacillus, à celui de Bacteroïdes (Castellani et Chalmers, 1919), Lactobacillus (Hollande ,1920), Bifidobacterium (Orla-Jensen ,1924), Bacterium (Lehmann et Neumann, 1927), Tissieria (Pribram, 1929), Nocardia (Vuillemin, 1931), Actimomyces (Nannizzi, 1934), Actinobacterium (Puntoni, 1937) et Corynebacterium (Olsen, 1949). En raison des similitudes entre les bifidobactéries et les bactéries du genre Lactobacillus, ils ont été inclus dans ce genre comme classifier dans la 7e édition du manuel de Bergey de la bactériologie déterminative (Breed et al., 1957). Dehnert (1957) a décrit l’existence des biotypes multiples des bifidobactéries et a proposé un arrangement pour la différenciation entre les souches basées sur leurs modèles de fermentation d’hydrate de carbone. Durant la même année Cummins et ses collaborateurs ont examiné la composition de la paroi cellulaire de plusieurs souches de bifidobactéries et ont conclu que ces bactéries sont différentes de toutes les bactéries Gram positifs précédemment examinées (Cummins et al., 1957)

La classification taxonomique des bifidobactéries était donc à revoir et le sujet a été relancé de nouveau à l‘investigation. En 1963, Reuter a effectué des tests biochimiques et sérologiques sur des souches de bifidobactéries isolées des fèces d’enfants et d‘adultes et a proposé l’arrangement suivant pour l’identification de ces bactéries: des bactéries aux formes bacillaires ,anaérobie , Gram positif, ressemblaient à des lactobacilles, excepté la variabilité morphologique, elles fermentent le glucose en produisant de l’acide acétique et de l’acide lactique d’un rapport 2:1 et fermentent 11 sucres additionnel des sucres déjà étudiés. Sur cette base il conclut que ces bactéries devraient être classées dans la tribu Lactobacilleae, famille Lactobacillaceae dans le genre Bifidobacterium. Scardovi et Trovatelli (1965) et De Vries et al. (1967) ont découvert une nouvelle voie de fermentation des hexoses chez les bifidobactéries, qui ne se trouve pas dans aucune des espèces du genre Lactobacillus. L’enzyme principale de cette voie est une fructose-6- phosphate phosphoketolase qui clive le fructose-6-phosphate en érythrose-4-phosphate et en acétyle phosphate (figure 8).

En 1970, Scardovi et ces collaborateurs ont commencés a appliqué intensivement le procédé d’hybridation ADN-ADN afin d’évaluer la validité des espèces de bifidobactéries précédemment décrite et pour identifier de nouveaux groupes de séquences ADN homologique parmi les souches qu’ils isolaient dans des diverses niches écologiques. Cette technique d‘identification est une avance significative en bactériologie déterminative et a aidé à résoudre une grande partie de la confusion précédemment rencontré quand a la différenciation d’espèce de Bifidobacterium qui a été faite principalement sur le profil fermentaire d’hydrate de carbone. Dans la 8e édition du manuel de Bergey du déterminatif de la bactériologie (Rogosa, 1974), les bifidobactéries ont été classifiées dans le genre Bifidobacterium en utilisant le même nom proposé par Orla-Jensen. Le genre a comporté huit espèces; il a été inclus dans la famille des Actinomycetaceae d’ordre Actinomycetales. Une autre correction à la classification a été apportée après l’introduction de l’électrophorèse des protéines cellulaires solubles sur le gel de polyacrylamide comme critère d’identification d’espèce (Biavati et al., 1982). La nouvelle description d’espèce et les remises en ordre apportées à la classification précédente ont contribué à l’identification de 24 espèces rapportées dans la première édition du manuel de Bergey de la bactériologie systématique (Scardovi, 1986). Stackebrand et al. (1997), par l’analyse de ARNr16s, ont proposé une structure hiérarchique rassemblant le genre Bifidobacterium avec le genre Gardnerella dans une seule famille Bifidobacteriaceae dans l‘ordre de Bifidobacteriales. De nos jours cette famille comporte 6 genres: Aeriscardovia, Alloscardovia, Bifidobacterium, Gardnerella, Parascardovia et Scardovia (Euzéby, 2007).

Ecologie des bifidobactéries

Les bifidobactéries ont été isolées à partir de trois niches écologiques: l’ organisme humain, l’organisme animal et l’environnement. Chez les humains, les bifidobactéries se retrouvent majoritairement dans l’ intestin (la partie distale de l’iléon et le colon). Cependant, ces microorganismes ont été identifiés dans le vagin et la cavité buccale. La composition de la flore dominante chez l’humain change au cours des différents stades de vie. Chez un jeune enfant nourri au lait maternel, la flore intestinale est composée de 85-99 % de bifidobactéries et les principales espèces retrouvées sont Bifidobacterium infantis et Bifidobacterium bifidum (Rasic et Kurmann, 1983). La flore des enfants sevrés représente une transition entre la flore infantile et la flore adulte. Plusieurs espèces telles que les bactéroïdes, et les clostridies apparaissent dans la flore fécale. Les bifidobactéries deviennent moins prédominantes (Rasic et Kurmann, 1983). La flore adulte devient plus complexe et la flore dominante est composée de bactéroïdes. Bien que les bifidobactéries ne soient plus prédominantes, elles demeurent un des groupes les plus importants de la flore intestinale. Les espèces de bifidobactéries les plus retrouvées chez l’adulte sont Bifidobacterium adolescentis et Bifidobacterium longum (Tamime et al., 1995). Dans le règne animal, la présence des bifidobactéries a été constatée majoritairement dans le tube digestif des mammifères (Mitsuoka et Kaneuchi, 1977). Cinq espèces de Bifidobacterium ont été détectées chez la volaille (B. animalis, B. galinarum, B. pseudolongum, B. pullorum et B. thermophilum) ( Yaeshima et al., 1992 ; Watabe et al., 1983 Mistuoka et al., 1969). Scardovi et Trovatelli (1969) et Biavatti et collaborateurs (1982) ont identifié trois espèces de Bifidobacterium, B. asteroides, B. coryneforme et B. indicum chez les abeilles (Biavati et al., 1982 ; Sardovi et Trovatelli, 1969). Trois espèces de bifidobactéries ont été isolées à partir des eaux usées: B. minimum, B.subtile et B. thermacidophilum (Dong et al.,2000 ; Biavati et al., 1982).

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I : Etude bibliographique
1. Produits laitiers fermentés
1.1. Lait fermenté
1.1.1. L‘ben
1.1.2. Raïb
1.2. Fromage
1.3. Yaourt
1.4. Laits fermentés aux bifidobactéries
2. Ecosystème gastro-intestinal
2.1. Anatomie du système digestif
2.2. Description générale du système digestif
2.3. Implantation du microbiote intestinal
2.4. Le microbiote intestinal
3. Probiotiques
3.1. Historique de la définition des probiotiques
3.2. Propriétés et critères de sélection des souches probiotiques
3.2.1. Résistance à l'acidité gastrique
3.2.2. Résistance aux sels biliaires
3.2.3. Adhésion aux cellules épithéliales
3.2.4. Production de substances antimicrobiennes
3.2.5. Résistance aux antibiotiques
3.2.6. Critères technologiques
3.3. Effets bénéfiques des probiotiques sur la santé humaine
3.3.1. Soulagement de la constipation
3.3.2. Amélioration de l'utilisation du lactose par l'organisme
3.3.3. Prévention ou le raccourcissement de la durée des diarrhées
3.3.4. Contrôle des infections intestinales par Helicobacter pylori
3.3.5. Activité antivirale
3.3.6. Diminution des allergies alimentaires
3.3.7. Réduction du taux de cholestérol sanguin
3.4. Production et maintenance de la viabilité des bactéries probiotiques
3.4.1. Emploi des bactéries probiotiques dans les produits laitiers
3.4.2. Viabilité des bactéries probiotiques
3.5. Défis technologiques associés au développement des cultures probiotiques
3.5.1. Méthodes de production
4. Les bifidobactéries
4.1. Taxonomie
4.2. Les espèces du genre Bifidobacterium
4.3. Ecologie des bifidobactéries
4.4. Caractéristiques morphologiques, physiologiques et biochimiquesdes bifidobactéries
4.4.1. Morphologie
4.4.2. Physiologies des bifidobactéries
4.4.3. Biochimie des bifidobactéries
4.5. Génétique des bifidobactéries
4.5.1. Le chromosome bactérien
4.5.2. Les plasmides
4.5.3. Identification génotypique des bifidobactéries
CHAPITRE II : Matériel et méthodes
1. Provenance des souches
1.1. Les souches industrielles
1.2. Les souches indigènes
1.3. Les souches pathogènes
2. Milieux de culture
2.1. Milieu de culture pour les bifidobactéries
2.2. Milieux de culture pour les souches pathogènes
3. Isolement et purification des bifidobactéries
4. Pré identification des bifidobactéries
4.1. Etude macroscopique
4.2. Etude microscopique
5. Identification du genre
5.1. Recherche de la catalase
5.2. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose
5.3. Recherche de citrate perméase
5.4. Mise en évidence de l‘uréase
5.5. Mise en évidence de la production d‘indole
5.6. Protéolyse de la gélatine
6. Caractérisation des espèces
7. Conservation des Souches
8. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de bifidobactéries
8.1. Mise en évidence des propriétés technologiques
8.1.1. Croissance en présence de l‘oxygène
8.1.2. Croissance en 43°C
8.1.3. Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C
8.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C
8.1.5. Influence des arômes sur la viabilité
8.1.6. Cinétique de croissance et d‘acidification dans milieu lait
8.1.7. Activité protéolytique
8.1.8. Activité lipolytique
8.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques
8.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées
8.2.3. Mise en évidence de l‘activité antibactérienne
8.2.4. Résistance aux antibiotiques
8.2.5. Traitement statistique des résultats
CHAPITRE III : Résultats et discussion
1. Pré-identification des souches
1.1. Aspect macroscopique
1.2. Aspect microscopique
2. Identification du genre
2.1. Recherche de la production de CO2 à partir du glucose
2.2. Mise en évidence des autres enzymes
3. Caractérisation des espèces
4. Etudes des propriétés technologiques et probiotiques des souches de bifidobactéries
4.1. Mise en évidence des propriétés technologiques
4.1.1. Croissance en présence de l‘oxygène
4.1.2. Croissance en 43°C
4.1.3. Viabilité pendant l‘entreposage à 4°C
4.1.4. Suivi de la post-acidification du lait fermenté entreposé à 4°C
4.1.5. Influence des arômes sur la viabilité
4.1.6. Cinétique de croissance et d‘acidification dans milieu lait
4.1.7. Activité protéolytique
4.1.8. Activité lipolytique
4.2. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques
4.2.1. Résistance aux conditions gastro-intestinales simulées
4.2.2. Activité antibactérienne
4.2.3. Résistance aux antibiotiques
DISCUSSION
1. Isolement et identification des bifidobactéries
2. Etudes des propriétés téchnologiques des souches de bifidobactéries
3. Mise en évidence in vitro des propriétés probiotiques des bifidobactéries
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Références bibliographiques
ANNEXES

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