Soutenance mémoire
Généralités sur les algues
Définition et structure d’une algue
Les cotes marines ainsi que les océans possèdent les plus grandes richesses sur cette terre parmi lesquelles les algues. Ces entités constituent exclusivement la masse végétale des eaux marines. Elles sont définies comme étant des organismes photosynthétiques simples, typiquement autotrophes, pluri ou unicellulaires et sont considérées comme source de vie dans l’océan puisqu’elles y produisent l’oxygène. Elles sont considérées parmi les organismes végétaux les plus anciens sur ce monde.(Cabioc’H J. 1992) .
Elles peuvent se développer dans l’eau ou dans des milieux très humides. En effet, elles habitent tous les écosystèmes aquatiques, tels que des océans, des lacs, des rivières et même des glaciers, ainsi que des systèmes terrestres y compris les roches et autres surfaces dures.(Floc’h J. Y. 2010) Pour survivre et se développer les algues ont besoin de lumière afin de réaliser la photosynthèse, d’eau pour leur nutrition ainsi que leur reproduction sexuée, d’éléments nutritifs, du dioxyde de carbone, de l’azote, du phosphate ainsi que du fer. (Raven P. H. 2007) Une cellule algaire est composée par une paroi partiellement cellulosique, un petit noyau et des plastes pigmentés qui confèrent au thalle de l’algue sa couleur rouge, brune, verte oubleue.(Garon-Lardiere S. 2004) Les algues sont caractérisées par leur thalle, qui est un appareil végétatif uni- ou pluricellulaire, ne possédant ni racine, ni tige et ni feuille. Ces thalles présentent une taille variable de moins d’un micromètre comme pour l’algue bleue Prochlorococcus à plusieurs dizaines de mètres dans le cas des Macrocystis. On distingue donc les macros et les micros algues. (Floc’h J. Y. 2010; Garon-Lardiere S. 2004) .
Les macroalgues sont au nombre de 25 000 espèces dont seulement 50 sont exploitées à ce jour. Elles possèdent généralement un appareil végétatif clairement distinguable à l’œil nu et sont fixées sur un substrat rocheux à travers des crampons qui sont souvent recouverts de sécrétions riches en polysaccharides, Ces macroalgues peuvent, elles-même, constituer un substrat pour de nombreuses communautés animales. La partie foliacée du thalle des macroalgues appelée fronde peut être sous forme de filaments, cordons ou lanières.(Floc’h J. Y. 2010) (Faller H. 2011) Par opposition aux macroalgues, les microalgues sont microscopiques. Sous ce terme on peut regrouper des organismes variés à savoir des procaryotes ou des cyanobactéries et des eucaryotes.
Les microalgues vivent dans des milieux fortement aqueux, la plupart d’entre elles peuvent posséder un ou plusieurs flagelles lui conférant ainsi une mobilité flagellaire., Elles peuvent aussi former une fine pellicule gluante ou biofilm, constitué par des algues, des sécrétions adhésives et des microorganismes.(Reinjenders M. 2014) (Faller H. 2011) .
Classification des algues
Les algues sont très diversifiées et constituent un ensemble hétérogène dans la mesure où elles n’appartiennent pas toutes à une même voie d’évolution mais à des groupes phylogénétiques très différents. (Cabioc’H J. 1992) Cette diversification est illustrée par les variations importantes dans leurs physiologie et métabolisme, reflet d’une grande diversité génétique. (Floc’h J. Y. 2010) De ce fait, on distingue les organismes eucaryotes uni- ou pluricellulaires avec une pigmentation rouge relative aux algues rouges, une pigmentation jaune relative aux algues brunes, les algues vertes à pigmentation verte et les organismes procaryotes à savoir les bactéries bleues ou cyanobactéries communément appelées algues bleues. Seulement 3 types de pigments donnent aux algues leurs couleurs : les chlorophylles, les caroténoïdes et les phycobiliprotéines.(Floc’h J. Y. 2010; Garon-Lardiere S. 2004) .
Les algues vertes
Les algues vertes ou ulvophytes sont un ensemble d’algues dont les pigments essentiels à la photosynthèse sont les chlorophylles a et b. Les plastes de ces algues sont colorés en vert par ces pigments, auxquels des caroténoïdes sont quelquefois associés. Elles regroupent des organismes variés n’appartenant pas à un même groupe évolutif. Elles sont présentes en majorité dans les eaux douces et dans les mers et les océans cependant quelques espèces peuvent être retrouvées sur terre. Les algues vertes sont très riches en calcium et en protéines, possèdent un pouvoir nutritionnel élevé en plus de la présence de vitamines et d’antioxydants. Elles possèdent aussi un pouvoir gélifiant important.(Garon-Lardiere S. 2004; Laplace C. 2015) .
Toutefois, tous les végétaux aquatiques de couleur verte ne doivent obligatoirement pas être catalogués comme des algues vertes.
Les algues rouges
Appelées aussi Rhodophytes, les algues rouges représentent un taxon très varié. Elles sont généralement pluricellulaires et sont retrouvées en milieu marin.
Ces algues sont colorées en rouge du fait de la présence dans leurs plastes d’un pigment appelé la phycoérythrine. Ce pigment s’associe à d’autres pigments comme la chlorophylle a « le centre réactionnel de la photosynthèse », la phycocyanine et l’allophycocyanine. (Cabioc’H J. 1992; Perez R. 1997) La pigmentation est aussi fonction de la longueur d’onde de la lumière absorbée par l’algue. Ainsi, l’abondance des algues rouges en profondeur est expliquée par la capacité de la phycoérythrine à absorber la lumière à cette profondeur. Ces algues sont riches en substances gélifiantes telles que les carraghénanes largement utilisés dans l’ industrie.(Floc’h J. Y. 2010) .
Les algues brunes
Elles sont aussi nommées Phaeophyceae ou Phéophycées. Il existe 1500 espèces différentes d’algues brunes; ce sont les algues marines les plus abondantes. On les retrouve surtout au niveau des côtes rocheuses à faible profondeur. Elles possèdent toutes une structure pluricellulaire et leur couleur jaunâtre à brune est due à l’abondance de la xanthophylle et de la fucoxanthine, qui dominent les autres pigments comme la chlorophylle a et c. Elles sont riches en alginates et en phlorotanins à propriétés antioxydantes.(Garon-Lardiere S. 2004; Wijesinghe W.A.J.P. 2011) .
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Table des matières
Introduction générale
Etude Bibliographique
I- Généralités sur les algues
1. Définition et structure d’une algue
2. Classification des algues
2.1. Les algues vertes
2.2. Les algues rouges
2.3. Les algues brunes
3. Les algues marines : applications
II- Ulva Rigida
1. Identification et caractéristiques
a- Classification
b- Description
c- Habitat et Distribution
d- Reproduction
2. Composition Biochimique
2.1. Les protéines et aminoacides
2.2. Les lipides et acide gras
2.3. Les polysaccharides et fibres alimentaires
2.4. Les vitamines et les minéraux
2.5. Les pigments et les composés phénoliques
2.6. L’eau
2.7. La cendre
3. Applications et effets biologiques
3.1. Utilisation alimentaire
3.2. Utilisation thérapeutique
a- Activité anti-hyperglycémiante
b- Antigenotoxicité in vivo et in vitro
c- Activité antimicrobienne et antifongique
d- Activité immunomodulatrice
e- Activités préventives anti-obésité, anti-athérosclérose et anti-hypercholestérolémie
f- Activités antioxydante et anticytotoxique
3.3. Possibilité de nanofibres
3.4. Production de biocarburants
3.5. Autres utilisations
III- Le stress oxydatif
1. Définitions
2. Les oxydants et leur origine
3. Les antioxydants
3.1. Le système à enzymes
a- La superoxyde dismutase (SOD, EC : 1.15.1.1)
b- La catalase (CAT, EC 1.11.1.6)
c- La glutathion péroxydase (GPx, CE 1.11.1.9)
3.2. Les antioxydants non enzymatiques
a- Les piégeurs de radicaux libres : antioxydants
b- Les substances regénérantes
4. Conséquences du stress oxydant
4.1. Conséquences sur les lipides et les acides gras
4.2. Conséquences sur la mitochondrie et Apoptose
4.3. Oxydation des protéines
4.4. Dénaturation de l’ADN
5. Les radiations UV-B
IV- Les astrocytes
1. Caractéristiques morphologiques et anatomiques des astrocytes
2. Les fonctions astrocytaires
2.1. La microarchitecture du système nerveux central
2.2. Contrôle de l’homéostasie ionique et métabolique
2.3. Contrôle de la synaptogenèse et maintien des synapses
2.4. L’angiogenèse, l’induction de la barrière hémato-encéphalique et leur maintien
2.5. Gliotransmission et modulation de la neurotransmission
3. Astrocytes et pathologies
V- Protection cellulaire : système à protéines
1. La cystéine synthase
2. La calmoduline
3. L’actine
4. Les HSP
5. Rôle des peptides et des acides aminés dans la protection cellulaire
VI- La protéomique
1. Différentes méthodologies de la protéomique
2. La spectrométrie de masse
3. Implication de la protéomique dans l’étude du stress oxydatif
Objectifs du travail
Matériel et méthodes
I- Optimisation de l’extraction et évaluation de l’activité antioxydante
1. Récolte de l’algue
2. Identification de l’algue
3. Préparation des extraits
3.1. Méthode de lyophilisation
3.2. Méthode de séchage à l’étuve
3.3. Méthode de séchage au soleil
3.4. Méthodes d’extraction
3.4.1. Précipitation des protéines à l’éthanol absolu
3.4.2. Précipitation des protéines au sulfate d’ammonium
3.4.3. Précipitation des protéines au DOC/TCA
4. Détermination de la quantité en protéines et de leur profil électrophorétique
4.1. Détermination de la quantité totale en protéines
4.2. Détermination du profil protéique par électrophorèse
4.2.1. Electrophorèse monodimensionnelle
4.2.2. Révélation au nitrate d’argent
5. Détermination de l’activité anti-oxydante
5.1. La capacité de neutralisation des radicaux libres (DPPH scavaging assay)
5.2. Dosage du pouvoir réducteur
II- Evaluation de l’effet protecteur de l’extrait sur les cultures d’astrocytes
1. Conditions d’utilisation des animaux
2. Culture cellulaire d’astrocytes corticales de rat
3. Irradiation
4. Test de survie
5. Test de Lactate déshydrogénase (LDH)
6. Mesure des marqueurs du stress oxydatif
6.1. Récupération des protéines intracellulaires
6.2. Dosage des activités enzymatiques antioxydantes
6.3. Dosage de la peroxydation lipidique
6.4. Dosage du peroxyde d’hydrogène
6.5. Mesure du taux de calcium
III- Evaluation de l’implication de la fraction protéique de l’extrait dans la protection cellulaire et investigation protéomique
A- Evaluation de l’implication de la fraction protéique de l’extrait dans la protection cellulaire
1. Dénaturation de l’extrait
1. 1. Traitement thermique
1.2. Digestion aux Hydrolases
1.3. Digestion par la protéase
B- Analyse Protéomique
1. La méthode Label Free
1.1. Concentration des protéines sur gel SDS-PAGE et coloration au bleu de coomassie
1.2. Préparation des échantillons à la spectrométrie de masse
1.3. Etape de la LC-MS/MS
IV- Purification et identification
1. Electrophorèse monodimensionnelle
2. Fractionnement de l’extrait selon le poids moléculaire
3. Détermination des bandes actives
3.1. Electroélution des protéines
3.2. Dialyse et Vérification de la pureté par SDS PAGE
3.3 Test d’activité
4. Dosage de la concentration en protéines dans l’éluat
5. Identification de la protéine par spectrométrie de masse
6. Alignement de la protéine identifiée avec la commerciale
7. Verification de l’identité de la protéine
7.1. Western blot
7.2. Immuno-précipitation
8. Application sur des cultures d’astrocytes
9. Evaluation de l’effet neuroprotecteur sur une culture des neurones en grain
Analyse statistique
Résultats
Conclusion générale
