De la synthèse des acides gras à celle des glycérolipides chez les organismes photosynthétiques

Télécharger le fichier pdf d’un mémoire de fin d’études

L’organisme eucaryote pluricellulaire photosynthétique : la plante supérieure

Le deuxième organisme d’étude de ce projet de thèse est l’angiosperme modèle Arabidopsis thaliana, dont le génome a été entièrement séquencé en 2000 (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). De plus, des banques de données en génétique et en protéomique sont facilement accessibles, et les méthodes de clonage sont connues et maitrisées, ce qui en fait un organisme d’intérêt scientifique. Les plantes supérieures, comme décrit précédemment, dérivent des algues vertes, donc les chloroplastes ont la même structure avec deux membranes entourant les thylakoïdes. Malgré encore quelques zones d’ombres dans la compréhension complète des mécanismes moléculaires de la plante, la majorité des métabolismes est connue, avec les systèmes de régulation et les protéines impliquées, ce qui donne des premières hypothèses de travail pour comprendre ces métabolismes dans les microalgues.

Le phosphate, un nutriment essentiel pour le développement des plantes et des algues

Dans le milieu naturel, les organismes, plantes et microalgues, sont soumis à des stress biotiques, comme l’agression de pathogènes (champignons, bactéries, insectes…) mais également à des stress abiotiques dus à des facteurs environnementaux comme la sécheresse, le froid, la carence nutritionnelle. Parmi les macronutriments nécessaires au bon développement de l’organisme, le phosphate (P) et l’azote (N) sont des éléments essentiels (Hecky and Kilham, 1988; Mills et al., 2004; Moore et al., 2013). En effet, le phosphate est retrouvé dans la constitution de nombreuses molécules du vivant, par exemple, dans l’ADN, les protéines, mais participe également aux réactions de photosynthèse et de transfert d’énergie dans la cellule (Better Crops With Plant Food: Phosphorus for Agriculture, 1999; Wang et al., 2019; Wu et al., 2003). Quant à l’azote, il est également retrouvé dans la composition de l’ADN, mais est aussi un constituant principal des acides aminés et donc des protéines. En carence d’azote, les protéines photosynthétiques du chloroplaste, comme les photosystèmes, sont dégradées (Masclaux-Daubresse et al., 2010). Également, la chlorophylle est dégradée, réduisant l’efficacité de la photosynthèse (Zhao et al., 2017). De ce fait, à long terme, une carence d’un de ces deux nutriments peut causer la mort de l’organisme. Pour pallier à cela, les organismes développent des stratégies d’adaptation, comme l’arrêt de la croissance et de la division cellulaire, pour limiter l’utilisation des protéines et stopper la réplication de l’ADN, et le remodelage moléculaire (Abida et al., 2015; Alipanah et al., 2018; Elser et al., 2007; Falciatore, 2000; Wu et al., 2003). En effet, ces stratégies pourraient permettre à l’organisme d’augmenter l’absorption du nutriment, de réduire sa consommation, et de remobiliser les réserves.
Ce projet de thèse se concentre spécifiquement sur la compréhension du remodelage lipidique en carence de phosphate. En effet, de nombreuses études observent et décrivent ce remodelage de lipides (Abida et al., 2015; Hildebrand et al., 2012; Jouhet et al., 2004; Liang et al., 2019). Chez les plantes, les lipides phosphorés, les phospholipides, contiennent jusqu’à un tiers du phosphate intracellulaire (Poirier et al., 1991), constituant une source non négligeable de phosphate pour la cellule pour le maintien de son activité. Chez les plantes et les algues, les précédentes études observent une dégradation des phospholipides au profit d’une synthèse de lipides non-phosphorés (Figure 3), permettant de remobiliser le phosphate vers les molécules vitales (protéines, coenzymes, ATP, …). Mais ce remplacement ne peut pas se faire de manière aléatoire, car les lipides n’ont pas le même rôle et la même structure dans la membrane. Le but de ce projet de thèse était donc de comprendre l’impact des remaniements lipidiques qui ont lieu en carence de phosphate sur l’architecture cellulaire, en étudiant les propriétés physicochimiques des lipides et leur organisation membranaire par une approche biophysique.
Dans ce travail de thèse, l’architecture membranaire de la plante et des microalgues a été analysée, avec respectivement comme modèles Arabidopsis thaliana et les microalgues brunes Phaeodactylum tricornutum et Microchloropsis gaditana, par deux approches distinctes. La première utilise une technique physique, l’analyse structurale par diffraction de neutrons, sur des lipides isolés organisés en membranes biomimétiques, apportant une réponse sur les propriétés biophysiques des lipides, et ainsi comprendre les remaniements lipidiques observés en carence de phosphate. Des analyses réalisées sur des membranes constituées de lipides purs, permettent de renseigner les caractéristiques précises sur le lipide étudié (taille de la bicouche, limite de gonflement de la membrane, forces de répulsion des têtes polaires…), et ainsi apporter des connaissances sur leur rôle in vivo lorsqu’ils sont en mélange avec d’autres lipides.
Le deuxième axe de recherche, restreint aux microalgues, était une étude plus spécifique du rôle des lipides in vivo, par la formation de mutant Knock Out (KO) pour l’enzyme de synthèse du lipide concerné. Une analyse du profil lipidique des mutants obtenus et cultivés en carence de phosphate ou non, ainsi que les paramètres cellulaires, comme la croissance, l’activité photosynthétique et l’architecture des membranes par microscopie, étaient initialement prévus. Malheureusement, du fait de problèmes rencontrés lors du criblage des transformants et du contexte sanitaire, cette étude n’a pas abouti. La méthode utilisée est présentée dans la partie matériels et méthodes de ce rapport.
Une étude bibliographique est réalisée, afin de rappeler les bases sur le métabolisme des lipides, leurs propriétés biophysiques, et décrire quelques techniques physiques utilisées pour déterminer ces propriétés. Ensuite, ce rapport de thèse est construit en quatre chapitres, les deux premiers portant sur l’étude des lipides des microalgues et les deux suivants sur celle des lipides de plantes.

Les acides gras : un marqueur de la localisation de la synthèse des lipides chez les organismes photosynthétiques

Les lipides des membranes des plantes sont composés de deux longueurs d’acides gras principales, les C16 et les C18, synthétisés dans le chloroplaste. La désaturation des acides gras en 16:0 conduit à la formation des 16:3, et celle des 18:1, aux 18:3. A l’extérieur du chloroplaste, seules les désaturations des acides gras à 18 carbones se produisent (Heemskerk et al., 1991). Le premier précurseur de la biosynthèse des lipides est l’acide phosphatidique (PA), composé d’un squelette glycérol-3-phosphate sur lequel sont estérifiés deux acides gras en position sn-1 et sn-2. Chez les plantes, la longueur de la chaine carbonée en position sn-2 indique le lieu de synthèse du squelette diacylglycérol (DAG). En effet, deux voies de synthèse se distinguent : la voie « procaryotique » et la voie « eucaryotique ». La voie « procaryotique », ou plastidiale, commence par la synthèse du PA dans l’enveloppe du chloroplaste par l’action séquentielle de l’acyl-ACP/glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT, ou ATS1) et de l’acyl-ACP/acide lysophosphatique acyltransférase (LPAAT, ou ATS2) (Kang et al., 2020). Ces enzymes produisent presque exclusivement du PA 18:1/16:0 (Frentzen et al., 1983). Ceci est en accord avec la découverte que le chloroplaste isolé (dans lequel seule la voie procaryotique peut opérer) synthétise du PA, du DAG, du PG et des glycolipides avec un acide gras en C16 en position sn-2 (Heinz’ and Roughan, 1983; Roughan et al., 1980). La voie « eucaryotique » se déroule dans le réticulum endoplasmique, et la synthèse du PA est réalisée par les isoenzymes acyltransférases microsomales, glycérol-3-phosphate acyltransférase (GPAT9) (Shockey et al., 2016; Singer et al., 2016) et acide lysophosphatidique acyltransférase (LPAAT2 à 5) (Kim and Huang, 2004; Körbes et al., 2016; Yu et al., 2004). Les lipides contiennent alors un acide gras C18 en position sn-2 du squelette glycérol et un acide gras en C16 ou C18 en position sn-1 (Frentzen et al., 1983).
Chez Arabidopsis thaliana, les deux signatures procaryotes et eucaryotes sont retrouvées dans les galactolipides synthétisés dans le chloroplaste. Un trafic du squelette DAG se produit donc du réticulum endoplasmique (RE) vers le chloroplaste, apportant la signature C18 en position sn-2. Le transporteur trigalactosyldiacylglycérol (TGD) est essentiel dans ce transport (Xu et al., 2010), mais la nature de la molécule transférée (PA, DAG, ou PC) reste encore en débat (Block and Jouhet, 2015). La Figure 6 résume ces informations (Figure 6.A).
Chez les microalgues, la synthèse des acides gras se produit également dans le chloroplaste, mais certaines différences sont notables. Chez les microalgues d’eau douce, comme la microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii, la longueur des acides gras est identique à celle trouvée chez la plante, mais les lipides plastidiaux n’ont pas d’acide gras en C18 et seulement du C16 en position sn-2, suggérant l’absence du trafic du squelette DAG entre le RE et le chloroplaste. Cependant, une étude a identifié une acide lysophosphatidique acyltransférase dans le RE capable d’estérifier un acide gras C16 en position sn-2 (Kim et al., 2018). De plus, la machinerie TGD est présente chez les algues vertes (Warakanont et al., 2015), rendant possible l’existence du trafic du squelette DAG du RE vers le chloroplaste dans ces organismes. Les algues vertes possèdent également en grande quantité un acide gras typique en 16:4 sur le monogalactosyldiacylglycérol (MGDG), produit par la désaturase Δ4 dans le chloroplaste (Giroud et al., 1988; Zäuner et al., 2012) (Figure 6.B). Les microalgues marines sont riches en acides gras polyinsaturés à longues chaines (Li-Beisson et al., 2019). Par exemple, le 20:5 est trouvé en position sn-1 des glycolipides chez la diatomée Phaeodactylum tricornutum, alors que du C16 se trouve en position sn-2, suggérant une origine plastidiale du squelette DAG. Cependant, la synthèse du 20:5 ne se déroule pas dans le chloroplaste, mais est obtenue par élongation et désaturation dans le RE, probablement à partir du 16:0 par la voie oméga (voie ω) avant de retourner dans le chloroplaste (Petroutsos et al., 2014; Smith et al., 2021). A l’heure actuelle, ce trafic reste encore inconnu. Contrairement à Arabidopsis thaliana, il n’y a pas d’évidence de la synthèse du 18:0 dans le chloroplaste (Zulu et al., 2018), et le 16:1 est produit par désaturation du 16:0 dans le plaste avant d’être exporté à l’extérieur, vers les autres membranes (Smith et al., 2021) (Figure 6.C).
Figure 6. Représentation schématique de la diversité des acides gras et leur localisation dans la cellule, selon la voie « procaryotique » dans le chloroplaste (en vert) ou la voie « eucaryotique » dans le réticulum endoplasmique (en bleu). Les lipides synthétisés dans le compartiment cellulaire sont représentés en jaune, alors que les lipides exportés sont en gris. Les acides gras de la signature « procaryotique » ou « eucaryotique » sont en position sn-2 et en rouge. Exemple d’acides gras présents chez (A) la plante supérieure, Arabidopsis thaliana, (B) la microalgue verte, Chlamydomonas reinhardtii, et (C) la diatomée, Phaeodactylum tricornutum, dont le chloroplaste est entouré par quatre membranes. Chez Chlamydomonas reinhardtii, le transporteur TGD est présent, mais les lipides du chloroplaste ne portent pas la signature de la voie « eucaryotique ». Chez Phaeodactylum tricornutum, aucun homologue la machinerie TGD n’a été trouvé. TGD : trigalactosyldiacylglycérol (transporteur).

La synthèse des glycérolipides et leurs propriétés biophysiques

Chez ces organismes, il existe une douzaine de classes de glycérolipides regroupées en sous-groupes selon leur tête polaire en position sn-3 du motif glycérol : les phospholipides, les galactolipides et les bétaines lipides présents uniquement chez les algues. La localisation des lipides est intimement liée à leur lieu de synthèse, à savoir, le chloroplaste, le système endomembranaire, la mitochondrie. De manière générale, les phospholipides et les bétaines lipides composent majoritairement les membranes extra-plastidiales, alors que les galactolipides constituent les membranes du chloroplaste (Cook et al., 2021; Dorne et al., 1990; Harwood, 2004). La synthèse du diphosphatidylglycérol (DPG), ou cardiolipine, est réalisée dans la mitochondrie (Frentzen and Griebau, 1994).

Les phospholipides

Les phospholipides sont reconnaissables par la présence d’un groupement phosphate dans la composition de la tête polaire. La diversité des groupements alcool attachés au phosphate forme la diversité des phospholipides. Parmi eux, la phosphatidylcholine (PC), le phosphatidylglycérol (PG) et la phosphatidyléthanolamine (PE) sont majoritaires par rapport à la phosphatidylsérine (PS), au phosphatidylinositol (PI) et à l’acide phosphatidique (PA), dont les structures sont présentées ci-dessous (Figure 7). Les phospholipides composent en grande quantité les membranes extra-plastidiales, mais de la PC, du PG et du PI sont aussi retrouvés dans la composition des membranes du chloroplaste (Block et al., 2007; Douce et al., 1973).

Propriétés physicochimiques des glycérolipides

Les lipides possèdent des propriétés physicochimiques qui leur sont propres et qui vont influencer la structure et les propriétés de la membrane. Une étude sur des membranes composées de lipides pures, apporte des réponses sur les propriétés physicochimiques du lipide étudié, et ainsi aide à la compréhension des propriétés observées pour des membranes complexes, composées de plusieurs lipides.
Une membrane est polarisée du fait de la différence de concentration des ions entre l’intérieur et l’extérieur des compartiments cellulaires. Chez les plantes, il existe des « territoires électrostatiques de membrane » formés par le gradient électrostatique de la membrane plasmique au tonoplaste (membrane autour de la vacuole). Par exemple, la membrane plasmique est plus électronégative alors que les compartiments dérivés du RE sont électriquement neutres (Platre et al., 2018; Simon et al., 2016). Les charges en surface des membranes des compartiments cellulaires jouent un rôle important dans le contrôle de la localisation de nombreuses protéines. Les lipides anioniques sont des régulateurs majeurs des processus fondamentaux cellulaires, comme la signalisation, la division cellulaire, les trafics de membrane, l’expression des gènes, comme le décrivent Noack et Jaillais dans leur revue (Noack and Jaillais, 2020).
Parmi les classes de lipides présentées précédemment, la majorité des phospholipides sont anioniques, dû à la charge négative portée par le groupement phosphate. En revanche, seuls PE et PC sont zwitterioniques par la présence de la charge positive portée par le groupement ammonium qui compense donc la charge négative du phosphate. Alors que les galactolipides (MGDG et DGDG) ne sont pas électriquement chargés, les sulfolipides (SQDG et ASQD) sont négativement chargés dû à la charge portée par le groupe sulfate. Enfin, les bétaines lipides, présents dans les plantes inférieures et les algues, sont zwitterioniques avec la charge négative portée par le groupe carboxyl et la charge positive sur le groupement amine.
En plus de la charge du lipide, l’encombrement stérique de la tête polaire, la longueur et les insaturations des acides gras ont également un rôle essentiel dans la structure de la membrane. La section suivante présente différentes techniques d’analyse pour visualiser l’organisation de la membrane et obtenir des informations importantes comme la taille de la bicouche.

Méthodes d’analyses des propriétés physicochimiques des glycérolipides

Les domaines membranaires sont caractérisés par une composition distincte en protéines et/ou lipides. Ces domaines confèrent des propriétés spécifiques à la membrane, conduisant à des structures et des fonctions originales. Les membranes sont qualifiées de mosaïque fluide en référence à l’état de la phase lipidique. Les membranes lipidiques sont capables de s’ajuster en fonction des paramètres environnementaux, afin de maintenir l’homéostasie de la cellule (Martonosi et al., 1985; Shinitzky, 1984). De plus, les lipides sont capables de former des structures en bicouche, donnant différents types de phases, lamellaires ou cubiques bicontinues, mais également autres que des bicouches, telles que des micelles directes ou inversées, ou des cylindres. Cette section décrit quelques méthodes pour explorer les propriétés physicochimiques des acides gras et des lipides.

Techniques de visualisation des membranes

C’est en 1855, que les premières descriptions de la membrane plasmique sont faites par Nägeli et Cramer, suite à des observations au microscope optique. Ils décrivent la membrane plasmique comme étant une simple barrière physique capable d’échanger de l’eau entre le cytoplasme et l’extérieur de la cellule (Nägeli and Cramer, 1855). Les scientifiques améliorent leurs connaissances sur les membranes et proposent quelques hypothèses sur leur structure et la présence de protéines autour. L’histoire des découvertes des membranes est très bien décrite dans la revue de Lombard (Lombard, 2014).
Un premier modèle complet de la bicouche a été décrit en 1957 par Fernandez-Moran et Finean, après leurs études sur la gaine de myéline en utilisant les techniques de microscopie électroniques et la diffraction de rayons X (Fernández-Morán and Finean, 1957). C’est finalement en 1972 que Singer et Nicolson décrivent le modèle de mosaïque fluide comme étant une bicouche de lipides contenant des protéines plus ou moins ancrées dans cette membrane (Singer and Nicolson, 1972). Ce modèle membranaire devient par la suite le modèle de référence pour les prochaines études sur les membranes. Comparée au passé, la résolution des techniques de visualisation des membranes s’est significativement améliorée. Cette partie présente une liste non-exhaustive de techniques biophysiques couramment utilisées pour déterminer les propriétés biophysiques des membranes.

Technique de microscopie optique, confocale et électronique à transmission

Comme mentionné précédemment, les premières découvertes des membranes plasmiques sont faites à l’aide de microscopes optiques, mais les études plus détaillées de la membrane sont réalisées par microscopie électronique. La résolution des microscopes varie en fonction de la technique utilisée. Par exemple, la résolution de la microscopie optique est de 0,2 µm, alors que pour la Microscopie Electronique à Transmission (MET) elle est autour de 0,1 nm, grâce à l’utilisation des électrons et non des photons.
En microscopie optique, la lumière est dirigée sur un objet plat dont la résolution ne pourrait pas être faite avec les yeux. Par addition d’un laser qui émet à une longueur d’onde spécifique, la microscopie en fluorescence permet de visualiser un colorant fluorescent dans la cellule. Cette technique peut notamment permettre de résoudre la localisation de protéines ou de lipides à l’intérieur de la cellule (Calvez et al., 2019). D’autres techniques couramment utilisées en biologie sont la microscopie confocale et le MET. La première peut analyser des coupes transversales sans aucun impact de la lumière émise en dehors du plan focal. Après reconstitution 3D des plans focaux, l’objet apparait donc en trois dimensions. La microscopie confocale est souvent couplée à la microscopie de fluorescence. La technique du MET consiste en un objet très fin placé sous un flux d’électrons. Ensuite, la capture électronique est convertie en image. Une reconstruction 3D de l’objet est possible après analyse par microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM) où le faisceau d’ions coupe l’objet et le faisceau d’électrons visualise la coupe. Grâce à ces techniques de microscopie, les structures, les sites de contact entre les organelles, la localisation des protéines peuvent être visualisés.
Les études portant sur le chloroplaste sont un exemple d’application utilisant les techniques de microscopie. La structure du chloroplaste a été découverte par Hugo von Mohl par microscopie optique (Staehelin, 2003). Les techniques de microscopie électronique ont été l’outil principal pour la compréhension de l’architecture des thylakoïdes et de leur organisation fonctionnelle. La résolution élevée permet de mesurer la taille des thylakoïdes, de compter le nombre de grana, et de mesurer l’épaisseur du stroma. Aussi, les deux membranes du chloroplaste peuvent être distinguées. En utilisant les reconstructions 3D, les structures à l’intérieur des organelles et les sites de contact entre différents organites peuvent être compris. Plus récemment, grâce à la microscopie confocale à laser, Johnson et ses collaborateurs ont examiné les changements dans la réorganisation structurale des membranes photosynthétiques pendant la mise en place des fonctions de photoprotection (Johnson et al., 2011).

Technique de cryo-microscopie électronique

Le développement de nouvelles techniques de préparation des échantillons et de traitement du signal de plus en plus puissantes, comme en cryo-microscopie électronique (cryo-ME) permet d’établir des structures avec une résolution similaire à celle de la cristallographie aux rayons X, de l’ordre de l’Angström (Å), donc meilleure que les autres techniques de microscopie électronique. Contrairement à la méthode de préparation pour l’analyse par microscopie électronique nécessitant la fixation de l’échantillon dans de la résine, les échantillons analysés par cryo-ME doivent être refroidis à l’état vitreux avant la visualisation (cryofixés) (Lepault et al., 1985). La cryo-ME est couramment utilisée pour étudier la structure de protéines à l’échelle atomique dans une membrane. Il est donc possible, grâce à cette technique, de déterminer la structure d’une protéine, la lamellarité des liposomes, leur taille, leur forme et leur ultrastructure (Mio and Sato, 2018). Demurtas et ses collaborateurs ont utilisé la cryo-ME pour visualiser et comprendre la structure de la phase cubique des lipides dans un contexte d’applications de systèmes d’administration de médicaments (Demurtas et al., 2015).

Microscopie électronique par cryofracture

La microscopie électronique par cryofracture est une méthode pour l’étude de structures d’échantillons biologiques à petite ou moyenne résolution (20 Å) (Gulik-Krzywicki, 1997). Cette technique est utile pour examiner les structures des lipides, ou l’insertion des protéines dans la membrane. Par exemple, il est possible de distinguer la phase lamellaire de la phase ondulée (Figure 11), mais seulement avec des acides gras ordonnés. En effet, avec des chaines d’acides gras désordonnées, les structures lipidiques ne sont pas bien préservées après congélation. La revue de Meyer et Richter décrit quelques structures avec ou sans protéines (Meyer and Richter, 2001). L’architecture de la membrane cubique a aussi été étudiée par cette technique (Delacroix et al., 1993).
La préparation consiste à congeler très rapidement l’échantillon à très basse température dans de l’azote liquide (-170°C) ou du propane liquide (-200°C). Ensuite, le bloc de glace est fracturé par un choc, toujours à basse température et sous pression. La fracture qui en résulte apparait le long d’une ligne avec le moins de résistance. Par exemple, pour une cellule ou une vésicule, deux types de fractures existent : (1) la fracture peut apparaitre au milieu de la cellule ou de la vésicule, montrant l’intérieur de l’échantillon, ou (2) la fracture sépare la bicouche en deux monocouches, montrant le centre de la membrane. Les protéines ne peuvent pas être coupées et restent intactes (Shechter, 1984).

Table des matières

Introduction générale du projet
1 Contexte de l’étude
2 Les organismes d’étude
2.1 Les organismes unicellulaires eucaryotes photosynthétiques : les microalgues
2.2 L’organisme eucaryote pluricellulaire photosynthétique : la plante supérieure
3 Le phosphate, un nutriment essentiel pour le développement des plantes et des algues
Données bibliographiques
1 De la synthèse des acides gras à celle des glycérolipides chez les organismes photosynthétiques
1.1 La synthèse des acides gras et leurs propriétés physiques
1.1.1 Les acides gras : un rôle majeur dans la structure des membranes
1.1.2 Les acides gras : un marqueur de la localisation de la synthèse des lipides chez les organismes photosynthétiques
1.2 La synthèse des glycérolipides et leurs propriétés biophysiques
1.2.1 Les phospholipides
1.2.2 Les galactoglycérolipides
1.2.3 Les bétaines lipides
1.2.4 Propriétés physicochimiques des glycérolipides
2 Méthodes d’analyses des propriétés physicochimiques des glycérolipides
2.1 Techniques de visualisation des membranes
2.1.1 Technique de microscopie optique, confocale et électronique à transmission
2.1.2 Technique de cryo-microscopie électronique
2.1.3 Microscopie électronique par cryofracture
2.1.4 Microscopie à force atomique (AFM)
2.2 Mesure de la température de transition de phase des acides gras
2.2.1 Calorimétrie différentielle à balayage (DSC)
2.3 Résonance magnétique nucléaire à l’état solide (SS-RMN)
2.3.1 Spectroscopie par résonance de spin électronique (ESR)
2.3.2 Anisotropie de fluorescence
2.4 Les membranes : des structures organisées
2.4.1 Analyses par diffraction de neutrons et rayons X
2.4.3 Simulations de membranes par dynamique moléculaire
Matériels et méthodes
1 Organismes d’étude et méthodes de culture
1.1 La plante Arabidopsis thaliana
1.1.1 La souche Col-0
1.1.2 Condition de culture d’Arabidopsis thaliana
1.2 La diatomée Phaeodactylum tricornutum
1.2.1 La souche Pt1 8.6
1.2.2 Milieu de culture ESAW et conditions de culture
1.3 L’eustigmatophyte Microchloropsis gaditana
1.3.1 La souche CCMP526
1.3.2 Milieux de culture F/2 et conditions de culture
1.4 La bactérie compétente Escherichia coli DH5α
1.4.1 La souche de Escherichia coli DH5α
1.4.2 Milieux de culture de Escherichia coli
2 Méthodes de biologie moléculaire
2.1 Préparation de l’insert pour la transformation de Microchloropsis gaditana
2.1.1 Transformation de Escherichia coli DH5α
2.1.2 Extraction du plasmide des bactéries
2.1.3 Linéarisation du plasmide
2.2 Amplification, séparation et purification de fragments d’ADN
2.2.1 Amplification par PCR sur colonies de Microchloropsis gaditana
2.2.2 Séparation sur gel d’agarose
2.2.2.1 Pour un produit de digestion
2.2.2.2 Pour une amplification par PCR
2.2.3 Extraction d’ADN sur gel d’agarose
2.2.4 Concentration d’ADN par précipitation
2.3 Séquençage d’un fragment d’ADN
3 Transformation des microalgues
3.1 Transformation de Phaeodactylum tricornutum par CRISPR-cas9
3.2 Transformation de Microchloropsis gaditana par recombinaison homologue
3.2.1 Les gènes ciblés
3.2.2 Le gène de résistance à la zéocine
3.2.3 Commande des plasmides
3.2.5 Sélection des transformants par PCR sur colonies
4 Méthodes d’analyses biochimiques des lipides
4.1 Les lipides synthétiques
4.2 Méthode d’extraction de lipides
4.2.1 Extraction des lipides d’Arabidopsis thaliana
4.2.2 Extraction des lipides de Phaeodactylum tricornutum et Microchloropsis gaditana
4.3 Séparation des lipides par chromatographie
4.4 Extraction des lipides de la silice
4.5 Analyse de la composition en acides gras des classes de lipides
4.5.1 La méthanolyse des lipides
4.5.2 Quantification des acides gras méthylés par GC-FID.
4.6 Analyse de la pureté et de la composition des lipides par MS type trappe
5 Méthodes d’analyses physiques des lipides
5.1 Calorimétrie différentielle à balayage (DSC)
5.1.1 Formation de vésicules mono-dispersées
5.1.2 Cycles de DSC
5.2 La diffraction de neutrons
5.2.1 Préparation des échantillons
5.2.2 Solvants de contraste
5.2.3 Contrôle de l’humidité relative dans la chambre
5.2.3.1 Mise en place de l’échantillon dans la chambre d’humidité
5.2.3.2 L’humidité relative (RH) dans la chambre
5.2.3.3 La pression osmotique ℿ
5.2.4 Géométrie et paramètres de l’instrument D16
5.2.4.1 Pour l’expérience de diffraction de neutrons
5.2.4.2 Diffusion aux petits angles (SANS)
5.2.5 Réduction des données
5.2.6 Profils de densité de longueur de diffusion des neutrons (NSLD)
5.2.6.1 Construction du profil NSLD
5.2.6.2 Calculs des épaisseurs de bicouche et de couche d’eau
6 Analyse phylogénique l’enzyme de synthèse du DGTS
6.1 Ensemble de données pour l’analyse phylogénique
6.2 Alignement des séquences de l’ensemble des données
6.3 Construction des arbres phylogénétiques
Résultats
PARTIE 1 : Etudes des lipides des microalgues chez Phaeodactylum tricornutum et Microchloropsis gaditana
Chapitre 1 : Etude des bétaines lipides dans les membranes des microalgues
1 Préambule
2 Résultats préliminaires sur les lipides naturels
2.1 Composition en acides gras du DGTS, du DGTA et de la PC
2.2 Organisation des membranes de bétaines lipides
2.3 Périodicité des membranes
3 Résultats de l’étude des membranes de DPPC et de DP-DGTS
4 Conclusion
Chapitre 2 : Etudes des lipides exotiques dans les membranes des microalgues
1 Préambule
2 Etude de l’organisation de la PC 22:6/22:6 par diffraction de neutrons
2.1 Résultats
2.2 Discussion et perspectives
3 Etude de l’organisation de l’ASQD de Phaeodactylum tricornutum
3.1 Résultats
3.1.1 Organisation lamellaire des membranes
3.1.2 Epaisseurs de bicouche et de couche d’eau des membranes
3.1.2.1 Comparaison des expériences à 100 % et 8 % D2O
3.1.2.2 Profils NSLD et épaisseurs
3.2 Conclusion et perspectives
PARTIE 2 : Etudes des lipides des plantes supérieures chez Arabidopsis thaliana
Chapitre 3 : Comparaison des propriétés biophysiques du PG et du SQDG 
1 Préambule
2 Résultats de l’étude des membranes de PG et de SQDG
Chapitre 4 : Etude de l’architecture de l’enveloppe du chloroplaste chez les plantes supérieures en carence de phosphate
2 Résultats
2.1 Organisation des membranes
2.2 Périodicité des membranes
2.3 Epaisseurs des bicouches et des couches d’eau entre membranes
2.4 Rigidité des membranes
3 Conclusion et perspectives
Discussion générale et perspectives du projet
1 Rôle des bétaines lipides dans le remplacement de la phosphatidylcholine des membranes des microalgues
2 Organisation des lipides exotiques des microalgues
3 L’interchangeabilité du PG et du SQDG chez Arabidopsis thaliana
4 Rôle du DGDG dans la déformation de l’enveloppe du chloroplaste
5 Perspectives d’étude des lipides par une approche biochimique
Annexes
Références bibliographiques

Télécharger le rapport complet