Soutenance mémoire
TESTS PHYTOCHIMIQUES
1. Matériel végétal : La plante codée MAJ31 appartenant à la Famille des MELIACEES est l’objet de notre étude. Cette plante a été collectée dans la région nord de Madagascar
2. Préparation du matériel végétal : Après séchage à l’ombre, les feuilles de la plante ont été broyées et la poudre obtenue a été soumise aux tests phytochimiques.
2-1. Préparation de l’extrait brut : Cinq cent grammes de poudre de feuilles sèches de la plante ont été trois fois macérés à froid avec du méthanol pendant 72heures, le solvant étant renouvelé toutes les 24 heures et filtrés sur du papier Whatman n°1. Chaque filtrat obtenu a été évaporé sous vide au Rotovapor BÜCHI L 131 à 37°c pour avoir un mélange concentré qui est l’extrait méthanolique. L’extrait méthanolique sec ainsi obtenu a été pesé et le rendement a été calculé suivant une formule
3. Criblage phytochimique de l’extrait brut méthanolique (FONG et coll., 1977) : Le but de ce criblage a été de déterminer qualitativement les principales familles chimiques présentes dans l’extrait brut méthanolique de MAJ31. La détermination des familles chimiques a été effectuée à l’aide des réactifs spécifiques et leur présence a été mise en évidence par l’apparition de précipité ou le changement de couleur.
Diarrhée provoquée par l’huile de ricin
L’huile de ricin a été administrée chez des souris mâles ou femelles pour évaluer l’activité anti sécrétoire de l’extrait (AKAH, 1996). Les animaux ont été répartis en cinq lots de six. Les souris du lot témoin ont reçu du véhicule c’est-à-dire un mélange éthanol- eau (5/95) alors que ceux des lots traités ont reçu par voie orale différentes doses de l’extrait brut méthanolique de MAJ31 soit 200, 300, 400 et 500 mg/Kg. Trente minutes après l’administration des produits, 0,1ml d’huile de ricin a été administré par voie orale à chaque animal (ZAVALA, 1998 et VITALI, 2005). Les animaux ont été répartis dans des cages à métabolisme. Des papiers transparents ont été mis au fond des cages d’observation afin de compter le nombre de fèces émis. Quatre heures après l’administration de l’huile de ricin, le nombre de fèces émis par chaque lot a été compté et comparé avec celui des témoins montrant 100% de diarrhée. Les résultats obtenus sont ensuite exprimés sous forme de pourcentage d’inhibition de la diarrhée sécrétoire.
Tests in vitro
Ces tests ont été effectués pour étudier l’activité spasmolytique de l’extrait brut méthanolique et des fractions obtenues vis-à-vis des effets contractiles des médiateurs tels que l’acétylcholine et l’histamine sur les muscles lisses intestinaux. Le duodénum a été choisi pour sa richesse en récepteurs cholinergiques de type muscarinique et l’iléon pour les récepteurs histaminiques de type H1. Le protocole décrit par HAMMAD a été utilisé pour mettre en évidence l’activité de l’extrait méthanolique et des fractions sur le duodénum isolé de rat et l’iléon isolé de cobaye. (HAMMAD, 1997). Les animaux utilisés ont été mis à jeun 24h avant les tests tout en recevant de l’eau à volonté.
Prélèvement, préparation et montage des organes L’animal a été sacrifié puis exsanguiné par section des deux carotides et placé ensuite dans le bac à dissection (décubitus dorsal). Après une laparotomie médiane, le duodénum de rat proche du pylore ou l’iléon de cobaye a été prélevé et placé dans une boîte de pétri contenant une solution de Tyrode thérmostatée à 37°c, dont la composition en mM est la suivante : Na Cl 26,48 ; K Cl 5,36 ; Mg Cl2 4,23 ; Na H CO3 20 ; Ca Cl2 2,5 ; KH2 PO4 0,92 ; glucose 11,49 et de l’eau distillée. Les mésentères, les tissus conjonctifs et les tissus adipeux ont été enlevés ainsi que le contenu intestinal. Un segment d’organe de 2cm de long, bien nettoyé, a été monté dans la cuve à organe isolé d’une capacité de 20ml, contenant la solution de Tyrode maintenue à 37°c et aérée avec du carbogène (95% d’O2 et 5% de CO2) (EMENDÖRFER, 2005). L’organe a été soumis à une tension isotonique de 1g pour le duodénum et 0,5g pour l’iléon. La tension développée a été détectée à l’aide de capteur tension de type UGO BASILE relié à un enregistreur de même marque. Après soixante minutes d’équilibration entrecoupée de lavages d’organe toutes les quinze minutes, la capacité contractile de l’organe a été testée avec une concentration finale dans le bainde 10-5M d’acétylcholine pour le duodénum et 5.10-6 M d’Histamine pour l’iléon, le volume de la cuve égal à 20 ml.
Test sur duodénum isolé de rat et iléon isolé de cobaye Trente minutes après la sensibilisation de l’organe, le duodénum a été contracté avec des concentrations croissantes et cumulatives d’acétylcholine allant de 10-8 M à 10-3 M dans le bain en absence ou en présence de l’extrait brut méthanolique aux concentrations allant de 0,01 à 0,05mg/ml préincubés quinze minutes dans le bain avant l’addition de l’acétylcholine. Alors que l’iléon a été contracté avec des concentrations croissantes et cumulatives d’histamine allant de 10-9 M à 10-5 M dans le bain en absence ou en présence de l’extrait méthanolique aux concentrations allant de 0,01 à 0,05 mg/ml, préincubé quinze minutes dans le bain avant l’addition d’Histamine. Les deux manipulations, en absence ou en présence d’extrait, ont été séparées par des périodes de lavages et de repos de quinze minutes.
Paramètres pharmacologiques calculées Les amplitudes de contraction, produites par les agonistes (acétylcholine ou histamine) en absence ou en présence des extraits ont été mesurées (mm). Les effets des extraits testés ont été exprimés en pourcentage d’inhibition des réponses contractiles de l’acétylcholine ou de l’histamine sur le muscle lisse intestinal. Puis, les valeurs des CI50 (concentration de l’extrait qui inhibe 50 % l’effet maximal de l’Ach ou Hist) ont été calculées par régression linéaire.
Test pharmacologique des fractions obtenues à partir de l’extrait brut méthanolique
Le test utilisé a été l’inhibition de l’effet contractile de l’acétylcholine sur le duodénum isolé de rat. Toutes les fractions ont été testées avec la même concentration de 0,05mg/ml dans le bain de capacité de 20ml. Trente minutes après sa sensibilisation, le duodénum a été contracté avec des concentrations croissantes et cumulatives d’acétylcholine allant de 10-8 M à 10-3 M dans le bain en absence ou en présence des fractions étudiées avec la même concentration de 0.05mg/ml pré incubées quinze minutes dans le bain avant l’addition de l’acétylcholine. Les effets des fractions testées ont été exprimés en pourcentage d’inhibition des réponses contractiles de l’acétylcholine sur le muscle lisse intestinal.Après les CCM de regroupement et les tests pharmacologiques, F2, F3, F4 ont été regroupées pour donner F2+3+4, F5 et F6 ont été rassemblées pour donner F5+6., ceci dans le but de poursuivre le processus de séparation.
Criblage phytochimique de la fraction active
Pour pouvoir identifier les familles chimiques présentes dans la fraction active, des chromatographies sur couche mince ont été réalisées. La cuve chromatographique a été rempli avec un mélange de solvants : Dichlorométhane et méthanol (98/2) puis recouvert afin que l’atmosphère dans la cuve saturée de vapeurs d’éluant. Le gel de Silice 60 a été utilisé comme phase stationnaire, adhéré sur une surface plane de feuille plastique. Sur cette plaque chromatographique dont la dimension est de 20x20cm, un trait horizontal a été tracé au crayon à 1cm environ au bord inferieur. Ce trait ne doit pas tremper dans le solvant d’élution contenu dans la cuve. Sur le trait à l’aide d’un capillaire, une goutte de la fraction active diluée dans un mélange de Dichlorométhane et méthanol (98/2) a été déposée et laissée sécher. Ensuite, la plaque a été déposée verticalement dans la cuve recouverte. Lorsque le solvant atteint environ 1cm du bord supérieur de la plaque, celle-ci a été sortie de la cuve et le front du solvant a été immédiatement marqué. La plaque sèche a été analysée sous lumière UV (254 et 365 nm), puis la révélation a été faite par pulvérisation des spots avec la solution révélatrice spécifique de chaque famille chimique à identifier (MERCK E., 1980 et WAGNER H., 1984). Le tableau ci-dessous montre la liste des révélateurs utilisés pour pouvoir identifier les familles chimiques présentes dans la fraction active.
Etude de la fraction F2+3+4
F2+3+4 a été obtenue après le regroupement de F2, F3 et F4 et le fractionnement (par chromatographie sur gel de Sephadex) de ce mélange a permis d’obtenir cinq nouvelles fractions dont les effets sur la contraction produite par l’acétylcholine sur le duodénum isolé de rat sont représentés sur la figure 6 sous forme de pourcentages d’inhibition.
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Table des matières
INTRODUCTION
MATERIELS ET METHODES
I. TESTS PHYTOCHIMIQUES
1. Matériel végétal
2. Extraction de l’extrait brut
3. Criblage phytochimique de l’extrait brut méthanolique
II. TESTS PHARMACOLOGIQUES
1. Animaux d’expérience
2. Substances utilisées
3. Tests in vivo
3-1. Diarrhée provoquée par l’huile de ricin
3-2. Diarrhée provoquée par le Sulfate de magnésium
3-3. Test sur le transit intestinal
4. Tests in vitro
4-1. Prélèvement, préparation et montage des organes
4-2. Test sur duodénum isolé de rat et iléon isolé de cobaye
4-3. Paramètres pharmacologiques calculées
5. Tests de toxicité aiguë
6. Analyse statistique
III- DETERMINATION DE LA FRACTION ACTIVE
1- Analyses chromatographiques de l’extrait brut méthanolique
1-1. Chromatographie sur couche mince
1-2. Analyse par chromatographie sur colonne
1-3. Test pharmacologique des fractions obtenues à partir de l’extrait brut méthanolique
2- Analyses chromatographiques de F2+3+4 et F5+6
3- Criblage phytochimique de la fraction active
RESULTATS
I. RESULTATS DES TESTS PHYTOCHIMIQUES
1. Rendement de l’extraction
2. Criblage phytochimique
II. RESULTATS DES TESTS PHARMACOLOGIQUES
1. Test anti diarrhéique in vivo
1-1. Effet inhibiteur de l’extrait brut méthanolique sur la diarrhée osmotique
1-2. Activité inhibitrice de l’extrait brut méthanolique sur la diarrhée sécrétoire
1-3. Effet inhibiteur de l’extrait brut méthanolique sur le transit intestinal
2. Tests sur organes isolés
2-1. Effet spasmolytique de l’extrait brut méthanolique vis-à-vis de l’acétylcholine sur le duodénum isolé de rat
2-2. Activité spasmolytique de l’extrait brut méthanolique vis-à-vis de l’histamine sur l’iléon isolé de cobaye
3. Tests de toxicité aiguë
III. DETERMINATION DE LA FRACTION ACTIVE
1. Analyse de l’extrait brut méthanolique de MAJ31
2. Etude de la fraction F2+3+4
3. Etude de la fraction F5+6
4. Criblage phytochimique de la fraction active
DISCUSSION
CONCLUSION
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