Soutenance mémoire
Cycle de développement des Plasmodiums humains
Ce cycle est complexe et comprend schématiquement trois étapes dont deux se déroulent exclusivement chez l’homme (haploïde et asexué) alors que la troisième commence dans l’organisme humain mais ne peut se poursuivre que chez l’Anophèle femelle (diploïde et sexué), vecteur exclusif du paludisme humain (Golvan, 1978). Afin que le cycle complet puisse s’accomplir, il doit y avoir adéquation entre le parasite et son hôte vertébré, ainsi qu’entre le parasite et le moustique vecteur.
Cycle chez l’Anophèle
Lorsque l’Anophèle femelle pique une personne infectée, il puise dans son sang des Plasmodiums. Toutes les formes circulantes sont tuées et digérées à l’exception des gamétocytes. Ceux-ci vont subir quelques modifications dans l’estomac du moustique pour donner des gamètes males et femelles (Golvan, 1978). Le gamétocyte femelle s’arrondit et devient un gamète femelle. Le gamétocyte male divise son noyau et subit un phénomène de l’exflagellation c’est à dire qu’il donne naissance à une dizaine d’éléments allongés et mobiles qui sont les gamètes males. La fécondation a lieu et donne ainsi un œuf qui est le seul stade diploïde de tout le cycle. L’œuf est mobile d’où son nom d’ookinéte. Il traverse la paroi de l’estomac du moustique et s’immobilise sous la membrane qui tapisse sa paroi externe. Il prend alors le nom d’oocyste. Cette brève phase diploïde s’achève par une division méiotique et est suivie par plusieurs milliers de mitoses qui conduisent au développement de sporozoites. L’éclatement de l’oocyste libère ces éléments mobiles et haploïdes (sporozoites) dans l’hémolymphe. Les sporozoites gagnent préférentiellement les glandes salivaires du moustique où ils seront inoculés à l’homme lors d’une prochaine piqûre avec la salive. L’ensemble de ce cycle se déroule chez le moustique entre 10 à 40 jours en fonction de la température et les espèces en cause (Golvan, 1978).
Cycle chez l’homme
Il comporte deux étapes qui sont toutes les deux des multiplications asexuées ou schizogonies. La première se déroule dans les hépatocytes (schizogonie exo érythrocytaire) et la seconde dans les hématies (schizogonie intra érythrocytaire). Au cours de la première phase, le parasite n’élabore pas de pigments palustres. Sur le plan clinique, cette multiplication intra hépatique est complètement muette. Au cours de la seconde où le parasite utilise l’hémoglobine du globule rouge, il laisse un résidu pigmentaire, l’hémozoine. C’est le déversement de ce pigment dans le sang qui cause la fièvre.
Cycle exo érythrocytaire
Les sporozoites sont injectés dans un capillaire par l’Anophèle lors d’une piqûre. Ils transitent dans la circulation générale et, en quelques minutes, ils envahissent les hépatocytes grâce à une interaction spécifique entre la protéine majeure de surface du sporozoite (Cercum Sporozoite Protein : CSP) et un récepteur spécifique situé sur la membrane plasmique de l’hépatocyte du coté de l’espace de Disse, espace directement en contact avec le sang circulant. Les sporozoites vont se transformer en trophozoites : éléments arrondis de quelques micromètres (µm) de diamètre uninucléés. Chaque trophozoite va s’accroître, son noyau va se diviser plusieurs fois et autour de chaque noyau fils se produit une condensation cytoplasmique. Après 1 à 2 semaines des schizontes murs ou corps bleus multi nucléés sont formés (Golvan, 1978). Ces schizontes conduisent à la libération de plusieurs dizaines de milliers de mérozoites dans la circulation. Cette phase de multiplication est asymptomatique et dure 8 à 15 jours selon les espèces. Ces mérozoites peuvent, au moins chez P. vivax, P. ovale et P. malariae, et peut être même rarement chez P. falciparum, envahir des hépatocytes neufs. Cette schizogonie intra hépatique sera à l’origine des rechutes qui peuvent se produire parfois très longtemps après l’épisode initial.
Cycle intra- érythrocytaire
Une partie des mérozoites (ou peut être la totalité dans le cas de P. falciparum) va passer dans le sang et pénétrer les hématies. Seule cette phase sanguine est responsable des symptômes qui peuvent être d’intensité variable. Le mérozoite, par son pôle apical, va pénétrer par endocytose dans une hématie et se divise au sein de la vacuole parasitophore en anneau, puis en tropohozoite, stade à partir duquel une intense phase réplicative commence. Ce trophozoite se nourrit de la substance même du globule rouge (Golvan, 1978). Il grandit et son noyau se multiplie plusieurs fois de même que son cytoplasme pour donner un schizonte. Celui-ci après segmentation montre une forme caractéristique de rosace, puis libère 8 à 32 mérozoites qui, rapidement, réinfectent des érythrocytes sains. L’intervalle de temps qui sépare deux accès correspond à la durée nécessaire pour que le mérozoite atteigne le stade de corps en rosace (Golvan, 1978). Cet intervalle est de 48 heures chez P. falciparum. L’apparition des gamétocytes a lieu en général la deuxième semaine qui suit l’infection et ces formes peuvent persister plusieurs semaines après la guérison. Les gamétocytes males et femelles (au dimorphisme sexuel marqué) sont ingérés pendant le repas sanguin par le moustique (Golvan, 1978).
Ultrastructure du mérozoite et processus d’invasion de l’érythrocyte
Ultrastructure du mérozoite
La structure des mérozoites de P. falciparum a été décrite par Langreth en 1978. C’est une petite cellule polarisée de forme ovoïde de 1,5µm de long et 1µm de large. Comme tous les apicomplexa, cette forme parasitaire possède plusieurs types d’organes apicaux : les rhoptries, les micronémes et les granules denses. Ceux-ci sont impliqués, de manière séquentielle, dans le processus d’invasion de l’érythrocyte. Le mérozoite est recouvert d’un manteau, sous lequel, en plus de la membrane plasmique, se trouvent deux autres membranes connectées par un important matériel fibrillaire et relié au cytosquelette.
Processus d’invasion de l’érythrocyte
Le processus d’invasion de l’érythrocyte par le mérozoite se déroule en plusieurs étapes : reconnaissance et attachement à la membrane de la cellule cible, réorientation du mérozoite, formation de la jonction serrée, puis formation de la vacuole parasitophore et, enfin, internalisation du parasite. P. falciparum utilise comme récepteur de surface sur le globule rouge, les résidus d’acide sialique présents sur les molécules de glycophorine A ou de glycophorine B ou C. L’un des principaux ligands de P. falciparum est EBA-175 qui est localisé dans les micronémes, dont l’exocytose est responsable de la formation de la jonction serrée. Après la formation de la jonction serrée entre le parasite et le globule rouge, celle-ci se déplace de part et d’autre du point initial d’interaction, entraînant l’internalisation du mérozoite par un système de motilité lié à l’actine. Au moment de la formation de la jonction serrée, le parasite libère le contenu des rhoptries pour former la vacuole parasitophore. Ensuite les granules denses apicaux et latéraux sont déchargés dans la vacuole parasitophore.
Modes de transmission du paludisme
Les vecteurs du paludisme
Les vecteurs du paludisme sont des Arthropodes appartenant à la classe des Insectes, à l’ordre des Diptères, au sous-ordre des Nématocères, à la famille des Culicidae, à la sousfamille des Anophelinae et au genre des Anopheles. Les Culicidae regroupent l’ensemble des insectes connus sous le nom de moustique. Comme tous les Diptères, ce sont des holométaboles, c’est à dire qu’ils présentent des métamorphoses complètes et passent, au cours de leur vie, par quatre stades successifs : œuf, larve, nymphe et adulte ou imago. Les trois premiers stades sont aquatiques mais les adultes mènent une vie aérienne. Les males se nourrissent uniquement de sucs végétaux, ils ne piquent pas. Les femelles ont, elles, besoin de sang de vertébrés, dont l’homme, pour le développement de leurs œufs. C’est à l’occasion de la prise de ces repas sanguins qu’elles ingèrent puis transmettent des germes pathogènes, dont ceux du paludisme. Elles piquent la nuit entre 23 heures et 4 heures du matin. Des piqûres peuvent survenir plutôt (dés 18-19 heures) mais elles proviennent surtout des jeunes femelles peu infectantes. Tous les vecteurs du paludisme appartiennent au genre Anopheles mais tous les anophèles ne sont pas des vecteurs. Sur environ 400 espèces d’anophèles répandues dans le monde, seulement une soixantaine sont des vecteurs du paludisme et une vingtaine sont responsables de la plupart des cas (Diagne et al., 1994). Au Sénégal, vingt espèces d’anophèles sont actuellement connues (Faye et al., 1995). Mais, comme dans les autres régions de l’Afrique subsaharienne, les principaux vecteurs du paludisme sont Anopheles gambiae s.l et An. funestus. An. gambiae s.l est un complexe de six espèces jumelles parmi lesquelles, An. gambiae et An. arabiensis sont les vecteurs les plus efficaces et les plus répandus. La distribution des espèces du complexe An. gambiae au Sénégal est classique. An. gambiae s.s et An. arabiensis sont sympatriques dans tout le pays et leur fréquence relative est fonction des conditions climatiques. La reproduction des anophèles exige du sang, de l’eau et de la chaleur. Le cycle « gonotrophique » qui va du repas sanguin à la ponte puis à la recherche d’un nouvel hôte va durer 48 à 72 heures en moyenne en zone tropicale (Faye et al., 1995). Les anophèles sont thermophiles et anémophiles. On les retrouve dans les crevasses des roches et des sols, des terriers, à l’envers des feuilles d’arbres et des plantes basses et des habitations surtout aux coins sombres.
Types de transmission
Le paludisme peut être considéré comme :
– épidémique quand on observe des augmentations brutales du nombre de cas (morbidité et mortalité)
– endémique : selon la définition de l’OMS, le paludisme est dit endémique lorsqu’on constate une fréquence appréciable des cas et la persistance de la transmission naturelle pendant plusieurs années consécutives (OMS, 1974). L’indice plasmodique (IP) qui est le pourcentage de sujets examinés qui présentent des hématozoaires dans le sang peut être utilisé pour déterminer l’endémicité palustre. Classiquement l’IP des enfants de moins de 10 ans permet le classement des différentes zones en :
– zone hypo-endémique : IP < 25%
– zone méso-endémique : 25% < IP < 50%
– zone hyper-indémique : 50% < IP < 75%
– zone holo-endémique : IP > 75%.
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Table des matières
INTRODUCTION
CHAPITRE I : GENERALITES
I- Epidémiologie
I-1 Agents pathogènes
I-1-1 Classification
I-1-2 Génome de l’agent pathogène
I-1-2-1 Structure et composition
I-1-2-2 Structure des chromosomes
I-1-3 Protéines de l’agent pathogène
I-1-4 Ploïdie génomique
I-2 Cycle de développement du Plasmodium
I-2-1 Cycle chez l’Anophèle
I-2-2 Cycle chez l’homme
I-2-2-1 Cycle exo érythrocytaire
I-2-2-2 Cycle intra érythrocytaire
I-3 Ultrastructure du mérozoite et processus d’invasion de l’érythrocyte
I-3-1 Ultrastructure du mérozoite
I-3-2 Processus d’invasion de l’érythrocyte
I-4 Modes de transmission du paludisme
I-4-1 Les vecteurs du paludisme
I-4-2 Types de transmission
I-4-3 Les faciès épidémiologiques
I-4-4 Les modes de contaminations
I-4-5 Facteurs favorisants la transmission
II- Manifestations cliniques
II-1 Les accès simples
II-2 Les accès pernicieux et accès graves ou compliqués
III- Immunité anti-palustre
III-1 Caractéristiques de l’immunité anti-palustre
III-2 Bases cellulaires et moléculaires de l’immunité
III-2-1 La réponse immune dirigée contre les formes pré érythrocytaires
III-2-2 La réponse immune dirigée contre les formes érythrocytaires
III-2-3 L’immunité bloquant la transmission
IV- Diagnostics biologiques
IV-1 Méthodes directes
IV-1-1 Frottis sanguin et goutte épaisse
IV-1-2 La PCR ou Polymerase Chain Reaction
IV-1-2-1 Définition de la PCR
IV-1-2-2 La technique de la PCR
* Principe
* Composantes de la réaction
i- L’ADN
ii- L’ADN polymérase
iii- Les nucléotides
iv- Les amorces
v- Le tampon, sa composition
vi- L’eau
IV-1-2-3 Les étapes de la réaction
* Dénaturation
* Hybridation
* Extension
IV-1-2-4 Détection et analyse des produits de PCR
* Electrophorèse
* La révélation des produits de PCR
* La détermination de la taille des fragments
IV-1-2-5 Les contaminations en PCR
IV-1-2-6 Effets de la congélation et de la décongélation des acides nucléiques
IV-2 Méthodes indirectes
IV-2-1 Les tests rapides de diagnostic du paludisme
IV-2-2 Le QBC ou le « Quantitative Buffy Coat »
IV-2-3 Méthodes immunologiques
V- Traitements du paludisme
VI- Caractéristiques génétiques et antigéniques de MSP1 et MSP2
VI-1 MSP-1 (Merzoite Surface Protein ou Protéine de Surface des Mérozoites)
VI-2 MSP-2
VII- Diversité de Plasmodium falciparum
VII-1 Description du polymorphisme parasitaire
VII-2 Polymorphisme chromosomique
VII-3 Polymorphisme allélique étendu
VII-4 Reproduction sexuée
VII-5 Variation antigénique
CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES
I- Cadre et population d’étude
I-1 Caractères géo climatiques de Pikine
I-2 Population de Pikine
I-3 Endémisme paludéen à Pikine
II- MATERIELS
II-1 Matériel biologique
II-2 Matériels et réactifs de laboratoire
II-2-1 Matériels de laboratoire
II-2-2 Réactifs de laboratoire
III- METHODES
III-1 Critères d’inclusion et d’exclusion
III-2 Procédures de consentement
III-3 Détermination de la parasitémie
III-4 Traitement
III-5 Prélèvement sanguin
III-6 Principe de l’extraction de l’ADN parasitaire
III-7 Méthodes d’extraction de l’ADN parasitaire
III-7-1 Extraction d’ADN de Plasmodium falciparum à partir de papier filtre
III-7-2 Extraction d’ADN de Plasmodium falciparum à partir du sang total
III-8 Amplification des gènes MSP-1 et MSP-2
III-8-1 Amplification du gène MSP-1
III-8-2 Amplification du gène MSP-2
III-9 Mode opératoire
III-9-1 La première et la deuxième amplification
III-9-2 Révélation des produits de PCR
III-9-3 Préparation de la solution de migration et la visualisation
III-10 Analyse statistique
CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION
I- Caractéristiques de la population d’étude
I-1 Caractéristiques démographiques de la population d’étude
I-2 La température corporelle et les densités parasitaires de la population d’étude
I-3 Relation entre l’âge et la densité parasitaire
II- Résultats du génotypage des gènes MSP-1 et MSP-2
II-1 Génotypage du gène MSP-1
II-1-1 Répartition allèlique du gène MSP-1
II-1-2 Combinaisons des allèles du gène MSP-1
II-2 Génotypage du gène MSP-2
II-2-1 Répartition allèlique du gène MSP-2
II-2-2 Combinaison des allèles du gène MSP-2
II-3 Fréquence de clones multiples à Pikine
II-3-1 Evolution de l’infection à Pikine
II-3-2 Relation entre l’infection multiple et l’âge
Discussion
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques
