Culture tropicale clef de l’économie mondiale

Culture tropicale clef de l’économie mondiale

Matériels et méthodes

Objectifs

Encore peu adopté en champ, le principe de « stimulation des défenses naturelles » (SDN) semble constituer une alternative sérieuse à l’utilisation des nématicides dans les bananeraies et les cultures d’ananas de Martinique. La compréhension des mécanismes physiologiques et biochimiques de défense des plantes face aux microorganismes pathogènes paraît donc cruciale pour l’optimisation de la réponse des végétaux et ainsi améliorer le rendement des plantes cultivées tout en limitant les intrants dangereux pour l’environnement. Ainsi un double intérêt se dégage : -mieux comprendre la nature des mécanismes de défense mis en œuvre par l’ananas ou le bananier et évaluer leur efficacité -pouvoir stimuler ces mécanismes par des pratiques culturales adaptées La conduite des essais est motivée par trois objectifs principaux: -montrer que des traitements du sol au Stifénia® sont capables de mettre en place une résistance systémique (stimulation des défenses naturelles) chez le bananier (comparaison avec 5 autres éliciteurs potentiels) -montrer que ces traitements induisent une diminution de la population en nématodes chez des plants de bananiers et d’ananas préalablement traités -montrer que les traitements au Stifénia® ont un effet sur la croissance de jeunes plants de bananiers et d’ananas. L’étude est composée de deux essais distincts : -La systémie de la résistance est observée à l’aide du dispositif appelé « split root » où les racines de jeunes bananiers sont séparées en deux pots distincts (traité ou non traité par Stifénia®). Après 3 traitements éliciteurs dans la partie traitée, les activités enzymatiques de 8 enzymes (PPOX, POD, PAL, LOX, CAT, APX, GST et SOD) impliquées dans les mécanismes de résistance systémique sont mesurées au niveau des racines non traitées.
-Afin de montrer que l’élicitation réduit les populations de nématodes, des jeunes plants d’ananas et de bananiers cultivés en serre sont traités par le Stifénia® puis inoculés par une population connue en nématodes (Pratylenchus coffeae sur bananiers et Rotylenchulus reniformis sur ananas). Après le temps nécessaire à l’installation du parasite au niveau du système racinaire, une extraction et un comptage des nématodes est effectué. Les effets du Stifénia® sur la croissance sont mis en évidence par des mesures de plusieurs indicateurs (masse fraîche des parties aériennes et racinaires, hauteur de la partie aérienne) sur les jeunes bananiers et jeunes ananas ayant subit les traitements éliciteurs. Les effets sur la teneur en chlorophylle est également évaluée.

Matériel végétal

Deux variétés d’ananas et une variété de bananier ont été étudiées (figure 11). Les ananas provenaient de rejets de multiplication végétative produit par des planteurs martiniquais des communes de Basse-Pointe et d’Ajoupa-Bouillon. La variété `MD2´présente une résistante contre les nématodes alors que la `Cayenne lisse´ est sensible. La variété de bananier utilisée pour l’étude est la ‘Cavendish 902’. Il s’agit d’un clone de grande naine (annexe I [5]). Cette variété provenait d’un producteur de jeunes plants de bananiers situé à Saint-Esprit en Martinique. Le bananier ‘Cavendish 902’ présente une sensibilité aux nématodes. Classe Angiospermes Angiospermes Sous-classe Monocotylédones Monocotylédones Famille Broméliacées Musaceae Genre Ananas Musa Espèce A. comosus Musa acuminata (AAA) Variété (cultivar) `MD2´ `Cayenne lisse´ `Cavendish 902 C. Mise en évidence de la systémie de la résistance après élicitation par
le Stifénia® chez le bananier : essai « split-root »

Plan d’expérimentation

Quarante-neuf jeunes plants de bananiers ‘Cavendish 902’ au stade 3-4 feuilles ont été transplantés en système de « split root » dans une terre naturelle préalablement stérilisée. Pour ce faire, les racines des plants ont été nettoyées et séparées en deux parts égales puis plantées dans deux pots distincts (figure 12) Les plants ont été maintenus en culture en intérieur devant une fenêtre éclairée par la lumière du jour (température d’environ 26°C). Les arrosages ont été effectués manuellement tous les deux à trois jours. Un traitement foliaire a du être effectué contre acariens et des apports en engrais ont été faits régulièrement pour s’assurer que les plants bénéficiaient d’une alimentation minérale suffisante.

Elicitation des plants de bananiers

L’élicitation a été faite 27 jours après rempotage au niveau du pot réservé aux traitements (figure 12). L’élicitation est faite trois fois à raison d’un traitement tous les 5 jours. Les plants de bananes ont été soumis à 7 traitements différents à raison de 7 plants traités (répétitions) par traitements. Pour des raisons indépendantes de notre volonté, nous n’avons pas de témoin traité à l’eau (tableau 5). Afin de permettre une meilleure installation du champignon et des vers de terre, les traitements P et Tr ont été effectués une fois de plus que les autres traitements 13 jours avant.Abréviation Traitement Mode de traitement Quantité (concentration) S Stifénia® solution versée

Récolte des racines de bananiers

Cinq jours après le dernier traitement, les racines ont été lavées et coupées, en prenant bien soin de séparer distinctement les parties traitées et non traitées. Les racines de chacune des parties ont été ensachées, étiquetées puis congelées à -20°C pour conservation avant analyses enzymatiques (figure 13). Les échantillons de racines récoltées sont ainsi restés intacts en stoppant toute activité enzymatique.

Extraits enzymatiques bruts des racines de bananiers

Des extractions enzymatiques ont été effectuées à partir des racines de la partie non traitée de 4 plants de bananiers par traitement (SA, MeJa, Tr, P, P+Tr+S, Lam, et S). Le protocole d’extraction a été élaboré d’après les travaux de [128], [129] et [130] et les différentes solutions ont été préparées selon les indications de [131]. Toutes les étapes de l’extraction se sont déroulées à basse température (4°C) afin de préserver l’activité des enzymes. Un échantillon d’environ 2,5 g de racines a été coupé en petits morceaux, puis broyé grâce à un broyeur à mortier (Pulverisette, FRITSCH, Allemagne) dans la solution d’extraction contenant 20 ml de tampon phosphate Les échantillons de racines d’ananas ont pu être passés à l’Ultra-Turrax® (IKA®, USA) pour améliorer le broyage lorsque c’était nécessaire. Le broyat a ensuite été centrifugé pendant 30 min à 14000 tours par minute (MR23i Jouan, France). Le surnageant a été filtré sous vide (grade n°1, ø 47 mm, Whatman, Angleterre), puis conservé dans la glace dans un pot enveloppé dans de l’aluminium (évite l’oxydation des polyphénols à la lumière).

Mesure des activités enzymatiques

Les extraits enzymatiques étant très fragiles (perte d’activité), les mesures d’activité enzymatique ont du être faites directement après l’extraction. a. Dosage de l’activité des polyphénoloxydases (PPOX) Le protocole de mesure des PPOX a été mis au point à partir de la méthode de [100] et [101]. Le substrat utilisé lors de la réaction est le pyrocathécol qui s’oxyde en o-quinone. Ce dernier
absorbe à 420 nm et la cinétique est suivie au spectrophotomètre pendant 4 minutes dans une cuve PMMA (Plastibrand, 2,5 ml macro, Allemagne). Le blanc évoluant au cours du temps, l’utilisation d’un spectrophotomètre UV-visible double faisceau (Carry 100 Scan, Varian, Australie) a permis la lecture des deux cuves simultanément afin de recalibrer la mesure de l’essai en fonction de la valeur du blanc. L’activité a été obtenue en A420nm.min-1 : calcul de la pente de la partie montante de la courbe

Dosage de l’activité des peroxydases (POD)

Le protocole de mesure des POD a été inspiré de la méthode mise en place par [114]. Ces enzymes oxydent les phénols (gaïacol) en présence de peroxyde d’hydrogène (H2O2). La cinétique de cette réaction est suivie dans une cuve PMMA pendant 4 minutes à 470 nm avec un spectrophotomètre UV-visible simple faisceau (Carry 50 Scan, Varian, Australie). Les extraits enzymatiques ont été dilués au 1/10e, 1/20 e ou au 1/100 e en fonction de l’activité de l’échantillon. Les mélanges réactionnels des cuves ‘essai’ et ‘blanc’ sont réalisés d’après le tableau 6. L’activité a été donnée en A470nm.min-1.

Dosage de l’activité de l’ascorbate peroxydase (APX)

Le protocole de mesure de l’APX a été réalisé à partir de la méthode de [117] modifiée par [118]. L’activité de cette enzyme est déterminée en mesurant la réduction de l’acide ascorbique en ascorbate, en présence de peroxyde d’hydrogène pendant 4 minutes dans des cuves en quartz au spectrophotomètre UV-visible double faisceau à 290 nm. Les cuves ‘essai’ et ‘blanc’ ont été préparées selon le tableau 6. L’activité de l’enzyme en A290nm.min-1, déterminée par la disparition de l’acide ascorbique, prendra des valeurs négatives.

Dosage de l’activité de la catalase (CAT)

Le protocole de mesure de la CAT a été réalisé à partir de la méthode de [117]. La décomposition du peroxyde d’hydrogène par la catalase est suivie dans des cuves en quartz au spectrophotomètre UV-visible double faisceau. La consommation du substrat est observée pendant 4 minutes à 240 nm. Les cuves ‘essai’ et ‘blanc’ ont été réalisées d’après le tableau 6. La courbe de cinétique en A240nm.min-1, suit la disparition du substrat et prendra, par conséquent, des valeurs négatives.

Dosage de l’activité de la lipoxygénase (LOX)

Le protocole de mesure est inspiré d’une méthode utilisée au PARM (Pôle Agroalimentaire Régional de la Martinique). L’étude de la cinétique enzymatique de la LOX est réalisée grâce au suivi de la transformation de l’acide linoléique pendant 8 minutes à 234 nm au spectrophotomètre UV-visible simple faisceau. Le substrat de l’enzyme (200 mL) a été préalablement préparé ; il contient : 0,5 mL de Tween 20, 10 mL de tampon substrat (Na2HPO4 anhydre à 0,1 M, pH 6,5) et 625 μl d’acide linoléique à 2 mmol. Après agitation, quelques gouttes de soude 1 M ont été ajoutées jusqu’à obtention d’une solution limpide. Cette solution a été diluée au 1/2 à l’eau distillée et ajustée au pH 6,5. Le mélange réactionnel a été fait dans des cuves en quartz comme indiqué dans le tableau 6. L’activité enzymatique a été donnée en A234nm.min-1.

Dosage de l’activité de la phénylalanine ammonia-lyase (PAL)

La mesure de l’activité de la PAL est réalisée selon les méthodes de [123], [124], [125] et de [118]. Elle consiste à mesurer au spectrophotomètre UV-visible à 290 nm, la quantité d’acide cinnamique libérée lors de la réaction de la PAL avec son substrat, la L-phénylalanine. Le substrat de la PAL pour un extrait est composé de 0,027 g de L-phénylalanine 60 mM dans 2,75 ml de tampon borate 0,1 M, pH 8,8 (acide borique à 0,2 M, solution de borax à 0,05 M). Ce mélange a été préincubé à 40°C pendant 15 min. A chaque extrait enzymatique a été ajouté de la protamine sulfate sous agitation douce afin d’obtenir une concentration finale en protamine sulfate de 1% par extrait. Ce mélange a été incubé 10 minutes à 4°C puis centrifugé à 14000 tours par minute pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant a été conservé pour la mesure de l’activité de la PAL. Une cuve ‘essai’, une cuve ‘témoin’ et une cuve ‘blanc’ ont été réalisées pour chaque extrait enzymatique selon le pendant 1 heure et la réaction a été stoppée par ajout de 0,1 mL de HCl 6M pour 1 mL de
milieu. L’activité enzymatique, donnée en A290nm.h-1, a été lue au spectrophotomètre UV-visible simple faisceau dans des cuves en quartz.

Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase (SOD)

Le substrat de la SOD (O2 ) étant très instable avec une durée de vie très courte, la méthode de dosage est indirecte. Le protocole de mesure a été mis au point d’après la méthode de [119], [121], [120]. L’activité de la SOD est évaluée par sa capacité à inhiber un flux d’anion superoxyde (O2 – ) généré par le système xanthine/xanthine-oxydase. Les radicaux superoxydes produits par ce système réduisent le nitrobleu de tétrazolium (NBT) en bleu de formazan stable à 560 nm. La cinétique a été effectuées pendant 4 minutes au spectrophotomètre UVvisible à double faisceau. Dans un premier temps, l’activité témoin de la xanthine oxydase réduisant le NBT a été mesurée.  La mesure de l’activité enzymatique de la GST a été inspirée de la méthode de [122]. La GST catalyse une réaction de transfert du glutathion réduit (GSH) sur le CDNB (1-chloro-2,4- dinitrobenzène). Le produit de cette réaction absorbe à 340nm. On visualise donc sa formation grâce à un spectrophotomètre double faisceau UV-visible pendant 8 minutes. Pour les micro-cuves ‘essai’ et ‘blanc’ (Plastriband, 70μl micro, Allemagne), la GSH a été mise à incuber avec l’extrait enzymatique 3 à 5 minutes avant l’ajout du CDNB. L’activité enzymatique est donnée en A340nm.min-1.

Table des matières

SOMMAIRE
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES ANNEXES
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION
I. Etude bibliographique : Intérêt de l’utilisation d’éliciteurs pour la résistance systémique induite contre les nématodes du bananier et de l’ananas 
A. Contexte de l’étude : la culture de la banane et de l’ananas en Martinique et les problèmes de nématodes associés
1. La banane
a. Culture tropicale clef de l’économie mondiale
b. Eléments de génétique
c. La banane aux Antilles et en Martinique
d. Problèmes de nématodes sur les cultures de banane en Martinique
e. Pratylenchus coffeae
Distribution
Symptômes et dégâts
2. L’ananas
a. Deux variétés commercialement intéressantes
b. Une situation difficile pour l’ananas de Martinique
c. Problèmes de nématodes sur les cultures d’ananas en Martinique
d. Rotylenchulus reniformis Linford et Oliveira  Répartition géographique et plantes hôtes
Cycle de vie et mode d’infection
Symptômes et dégâts
3. Lutte contre les nématodes de l’ananas et du bananier
a. Lutte chimique
b. Luttes alternatives
c. Une volonté commune de réduire l’usage des pesticide
B. Résistance systémique
1. Résistance spécifique induite ou relation gène-pour-gène
La HR
2. Résistance non spécifique induite
a. La résistance locale acquise (RLA)
b. La résistance systémique acquise (SAR)
c. La résistance systémique induite (ISR)
3. Les réactions de défense
a. Eliciteurs
Stifénia®
Les autres éliciteurs étudiés
b. Evénements de signalisation précoces (figure 10)
c. Les enzymes marqueurs étudiés
II. Matériels et méthodes
A. Objectifs
B. Matériel végétal
C. Mise en évidence de la systémie de la résistance après élicitation par le Stifénia® chez le bananier : essai « split-root »
1. Plan d’expérimentation
2. Elicitation des plants de bananiers
3. Récolte des racines de bananiers
4. Extraits enzymatiques bruts des racines de bananiers
5. Mesure des activités enzymatiques
a. Dosage de l’activité des polyphénoloxydases (PPOX)
b. Dosage de l’activité des peroxydases (POD)
c. Dosage de l’activité de l’ascorbate peroxydase (APX)
d. Dosage de l’activité de la catalase (CAT)
e. Dosage de l’activité de la lipoxygénase (LOX)
f. Dosage de l’activité de la phénylalanine ammonia-lyase (PAL)
g. Dosage de l’activité de la superoxyde dismutase (SOD)
h. Dosage de la glutathion S-transférase (GST)
D. Impact des traitements des racines au Stifénia® sur les populations de nématodes, la croissance et la teneur en chlorophylle de l’ananas et du bananier : essai « serre »
1. Plan d’expérimentation
2. Elicitation des plants de bananiers et d’ananas
3. Récolte des racines pour analyses enzymatiques des racines de bananiers et  d’ananas traités
4. Inoculations de nématodes chez les plants d’ananas et de bananier préalablement
traités
5. Estimation de la population en nématodes chez les bananiers et ananas traités
a. Estimation de la population en Pratylenchus coffeae au niveau des racines de bananiers traités
b. Estimation de la population en Rotylenchulus reniformis au niveau de la gaine de
terre des racines d’ananas traités
Extraction de R. reniformis sur gaine de terre des racines d’ananas traités
Extraction par centrifugation-flottaison
6. Effets du Stifénia® sur la croissance et la teneur en chlorophylle des jeunes
bananiers et jeunes ananas
E. Traitements statistiques
III. Résultats et Discussion 
A. Essai « split-root » : mise en évidence de la systémie de la résistance après élicitation par le Stifénia® chez le bananier
B. Essai « serre »
1. Impact des traitements des racines au Stifénia® sur les activités enzymatiques des racines d’ananas et de bananier
a. chez les bananiers ‘Cavendish 902’
a. chez l’ananas
2. Impact des traitements des racines au Stifénia® sur les populations de nématodes de l’ananas et du bananier
a. Chez le bananier : inoculations avec Pratylenchus coffeae
b. Chez l’ananas : inoculations avec Rotylenchulus reniformis
3. Impact des traitements des racines au Stifénia® sur la croissance et la teneur en chlorophylle de l’ananas et du bananier
a. Chez le bananier
b. Chez l’ananas
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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