Culture in vitro de Plasmodium falciparum

Culture in vitro de Plasmodium falciparum

La culture de Plasmodium falciparum in vitro est basée sur les protocoles modifiés initialement développés par Haynes, Trager et Jensen (Haynes et al., 1976; Trager et Jensen, 1976) la figure 12 A présente la composition du milieu de culture utilisé). La souche de Plasmodium utilisée est la souche 3D7. Cette souche présente la propriété d’être sensible à la chloroquine et est la souche utilisée pour l’établissement du génome complet de Plasmodium falciparum (plasmoDB, http://plasmodb.org/). Les cellules infectées sont maintenues dans des flasques de culture cellulaire (25 cm²), à un hématocrite de 2.5%, à l’intérieur d’une enceinte thermostatée à 37°C et 5% de CO2. La parasitémie est maintenue autour de 5% et est contrôlée quotidiennement, au moment du renouvellement du milieu de culture, par coloration de Giemsa .

Détection de protéines CFTR et ClC-2 dans la membrane cellulaire des érythrocytes humains

Afin de compléter les mesures réalisées en patch-clamp, des techniques d’immunodétection (western-blot et immunofluorescence) ont été utilisées afin de détecter la présence des protéines CFTR et ClC-2 dans la membrane des globules rouges humains.

Le Western-Blot

Préparation des membranes plasmiques :
La première étape avant l’extraction de protéines membranaires consiste à préparer des ghosts, soit des cellules dépourvues de leur contenu cytoplasmique, après cette étape, seule la membrane cellulaire est récupérée. Les ghosts sont préparés par lavages successifs des globules rouges dans un tampon de lyse 5P8. Ce tampon est préparé à partir d’un tampon 5P8 x100 constitué de NaH2PO4 0.5 M titré à pH 8.0. L’obtention des membranes est réalisée par lavage dans ce tampon additionné d’un cocktail d’inhibiteurs de protéases composé de : benzamidine (100 mM), leupeptine (10 mg/ ml), aprotinine (10 mg/ml) et l’inhibiteur de trypsine (SBTI, 10 mg/ml ; Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets de Roche). Chaque lavage est suivi d’une centrifugation à 25000 g pendant 30 minutes à 4°C. L’opération est répétée jusqu’à l’obtention d’un surnageant incolore, et d’un culot blanc opalescent. Les membranes ainsi obtenues peuvent être congelées à -80°C jusqu’à l’étape de solubilisation des protéines membranaires.

Extraction des protéines membranaires :
Les canaux ioniques sont des protéines intrinsèques. Un ou plusieurs de leurs segments sont enfouis dans la bicouche phospholipidique. La plupart de ces protéines comportent des acides aminés à chaîne latérale hydrophobe, qui, en prenant contact avec les chaînes aliphatiques d’acides gras des phospholipides membranaires, ancrent la protéine à la membrane. Les canaux peuvent également être qualifiés de protéines transmembranaires car leur chaîne occupe l’épaisseur de la bicouche phospholipidique. Elles comprennent un ou plusieurs domaines transmembranaires et des domaines de quatre à quelques centaines de résidus baignant dans la phase aqueuse de chaque côté de la bicouche. En vue d’identifier certaines protéines membranaires, telles que les canaux ioniques, il convient de les isoler et de les purifier (Ohlendieck, 1996). Cependant, les protéines membranaires intrinsèques posent un problème particulier. En effet, en les extrayant de leur membrane, leur région hydrophobe est mise à nue, de ce fait, les molécules protéiques s’agrégent et précipitent en solution aqueuse. On peut mettre ces protéines en solution à l’aide de détergents qui ont une affinité à la fois pour les groupes hydrophobes et pour l’eau (Hjelmeland, 1990; Neugebauer, 1990). Les détergents sont des molécules amphipatiques qui disloquent les membranes en s’insérant dans la bicouche lipidique et en rendant solubles lipides et protéines (Fig. 13 A). Nous avons utilisé deux types de détergents pour l’extraction des protéines : le SDS (DodécylSulfate de Sodium, Fig. 13 B, SIGMA) qui est chargé positivement et qui a la particularité de dénaturer les protéines, et deux détergents neutres non-dénaturants : triton X-100 (Fig. 13 B, SIGMA) et le n-Octyl-D-glucopyranoside (Fig. 13 B, SIGMA), ce dernier n’a été que peu utilisé du fait des difficultés techniques liées à sa conservation. En conditions dénaturantes, les membranes sont solubilisées dans un tampon SDS 4.5 % (SDS 4.5% (150 mM), NaPi (150 mM), EDTA 3 (mM), DTT (1mM), pH 7.6). Deux volumes d’extraits membranaires sont ainsi solubilisés dans un volume de SDS, pendant 10 minutes avec quelques étapes de vortex. En conditions non dénaturantes, les membranes sont solubilisées dans une solution de nOctyl à 3% (solution stock à 10%, SIGMA). Ainsi, 300 µl d’extraits membranaires sont incubés en présence de 100 µl de n-Octyl à 3%, pendant 30 minutes à température ambiante.  Finalement, les différents mélanges sont centrifugés à 20°C pendant 30 minutes à 45000 g, afin de se débarrasser des lipides membranaires. La concentration totale en protéines est ensuite calculée à l’aide d’un kit BCA (Pierce) et d’une gamme étalon de BSA (Bovine Serum Albumine, SIGMA).

Préparation du gel d’électrophorèse en conditions dénaturantes (SDSPAGE) et réalisation du transfert liquide

Les systèmes d’électrophorèse que nous avons utilisés reposent sur le matériel développé par Biorad pour réaliser des gels de petite taille (Miniprotean II). Des gels composés à 7.5% de polyacrylamide de 0.75 mm d’épaisseur ont été utilisés. Une fois polymérisés, les gels sont placés dans le système d’électrophorèse en présence de running buffer. Les extraits sont dilués à une concentration précise et chauffés à 100°C pendant 2 minutes avant d’être chargés. Cette dilution est réalisée grâce au tampon de charge, appelé tampon de Laemli. La migration est ensuite lancée à voltage constant de 200 V (Fig. 14 A). Une fois le front de migration sorti, le gel est mis en contact avec une membrane de difluorure de polyvinylidine (ou PVDF) placée dans une cassette utilisée pour réaliser le transfert liquide. L’ensemble est humidifié avec le même tampon que celui utilisé au cours du transfert : le transfer buffer. La cassette est placée dans le système de transfert, pendant une heure à un ampérage constant de l’ordre de 200 mA (Fig. 14 B). Après cette étape, le blot est récupéré pour être placé dans une solution de blocage (TBS / Tween 20 + 0.2% de lait en poudre + 4.5% de BSA ou + 5% de lait en poudre), sur un agitateur orbital pendant 30 à 60 minutes à température ambiante avant de procéder à l’étape de marquage immunologique.

Le marquage immunologique 

Le tampon de blocage est ensuite éliminé, et remplacé par l’anticorps primaire dilué dans ce même tampon. Le blot est ainsi incubé pendant 1 heure sous agitation à température ambiante ou pendant une nuit entière à 4°C. Deux anticorps différents ont été utilisés. Le premier est un anticorps monoclonal dirigé contre un segment de 14 acides aminés [(103)GRIIASYDPDNKEER(117)] de la première boucle extracellulaire de la protéine CFTR de souris (MA1-935, Affinity BioReagents, Inc.). Le second est un anticorps polyclonal reconnaissant un épitope constitué de 18 acides aminés [(888)RSRHGLPREGTPSDSDDKC(906)] de la partie N-terminale du canal ClC-2 de rat (ACL-002, Alomone Labs). Ces anticorps sont utilisés à une dilution de 1/400ième (Fig. 14 B). Après cette période d’incubation, le blot est rincé, 5 fois (chaque lavage durant 5 minutes minimum) avec une solution de TBS / Tween 20, avant d’être incubé avec l’anticorps secondaire (conjugué à l’anticorps primaire et couplé à une péroxydase) dilué dans la solution de blocage au 1/2000ième, pendant 60 minutes, sous agitation continue à température ambiante. Le blot est de nouveau rincé suivant la même procédure que précédemment. Une fois l’humidité en excès retirée, la solution contenant le réactif chémoluminescent (ECL, fabrication maison) est ajoutée. La réaction nécessite environ 1 minute avant de se développer. Enfin, un film Kodak XOMAT AR est déposé sur le blot (la période d’exposition est déterminée expérimentalement), et est révélé suivant les instructions du fournisseur .

Immunofluorescence 

Le même anticorps anti-CFTR que celui utilisé pour les western-blots est utilisé pour réaliser des marquages fluorescents de la membrane des érythrocytes humains. Des frottis sont réalisés à partir de globules rouges conservés dans du milieu de culture, dont l’hématocrite est au préalable amené à une valeur proche de 5%. Les cellules sont fixées dans un bain de méthanol pendant quelques secondes. Après sèchage, les frottis sont saturés dans du sérum à 2% préparé dans du PBS (Phosphate Buffer Saline) 30 minutes à température ambiante. Après saturation, les lames sont incubées en présence de l’anticorps primaire anti-CFTR (dilué au 1/250ième dans la solution de saturation) pendant 45 minutes à 20°C. Après 3 rinçages de 5 minutes avec du PBS, les frottis sont exposés à l’anticorps secondaire couplé à une sonde TRITC (utilisé à une dilution de 1/300ième ; T 7782, SIGMA). Enfin, les lames sont de nouveau rincées suivant le même protocole que précédemment avant d’être observées au microscope à fluorescence.

Table des matières

Introduction
Matériel et Méthodes
1. Le matériel biologique
2. Culture in vitro de Plasmodium falciparum
3. Détection de protéines CFTR et ClC-2 dans la membrane cellulaire des érythrocytes humains
3.1. Le Western-Blot
3.2. Préparation des membranes plasmiques
3.3. Extraction des protéines membranaires
3.3.1. Préparation du gel d’électrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) et réalisation du transfert liquide
3.3.2. Le marquage immunologique
3.4. Immunofluorescence
4. Patch-clamp
4.1. Principe
4.2. Enregistrement des courants et anatomie du poste de patch-clamp
4.3. Protocole
4.4. Analyse des courants ioniques traversant un canal
4.5. Analyse des caractéristiques électriques unitaires d’un canal en configuration cell-attached et inside-out
4.6. Analyse des caractéristiques électriques de la membrane en configuration whole-cell
5. Présentation des données et analyse statistique des résultats
6. Produits chimiques utilisés au cours des différentes expériences
Conclusion

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