Croissances folliculaire et ovocytaire
RECOLTE ET SELECTION DES OVAIRES
Les ovaires ont รฉtรฉ collectรฉs lors dโovariectomies de convenance de 43 chattes dans le cadre des activitรฉs cliniques de lโEcole Nationale Vรฉtรฉrinaire dโAlfort. Ces chattes รฉtaient รขgรฉes de 7 mois ร 3 ans et 4 mois (moyenne ยฑ erreur standard sur la moyenne : 1,17 ยฑ 0,09 ans) et au moins cinq dโentre elles prรฉsentaient des signes comportementaux dโลstrus. Il nโa pas รฉtรฉ tenu compte de leur race, mais il sโagissait, pour la plupart, de chattes de type europรฉen.Dรจs leur exรฉrรจse, les ovaires ont รฉtรฉ placรฉs dans une solution contenant un tampon phosphate (Phosphate Buffered Saline ou PBS, Sigma-Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier, France) et maintenus ร 38ยฐC, c’est-ร -dire dans des conditions dโosmolaritรฉ et de tempรฉrature proches de celles retrouvรฉes in vivo. La figure 6 prรฉsente lโaspect macroscopique dโun ovaire de chatte prรฉsentant de nombreux grands follicules immรฉdiatement aprรจs son exรฉrรจse.
PREPARATION HISTOLOGIQUE
Seuls les ovaires prรฉsentant de nombreux follicules de 1 ร 3,5 mm de diamรจtre et sur lesquels aucun corps jaune ne pouvait รชtre observรฉ ont รฉtรฉ sรฉlectionnรฉs et fixรฉs dans une solution de formaldรฉhyde ร 10 % (v/v, VWR, Fontenay sous Bois, France) pendant une semaine.
Suite ร leur fixation, les ovaires ont รฉtรฉ progressivement dรฉshydratรฉs par passages successifs dans des solutions dโรฉthanol (VWR) de degrรฉ croissant. Ils ont ensuite รฉtรฉ inclus dans la paraffine (Paraplast, CML, Nemours, France) et disposรฉs dans des moules plastiques cubiques.Le dรฉtail du protocole de dรฉshydratation et dโinclusion des ovaires est donnรฉ dans lโannexe 1.Aprรจs dรฉmoulage, les blocs de paraffine ont รฉtรฉ sectionnรฉs ร lโaide dโun microtome (Leitz, Wetzlar, Allemagne), en coupes de 7 ยตm dโรฉpaisseur. Les lames ont prรฉalablement รฉtรฉ traitรฉes au 3-aminopropyltriethoxysilane (silane, Sigma-Aldrich), un composรฉ corrosif, afin que les coupes de paraffine adhรจrent plus efficacement.Les coupes ont ensuite รฉtรฉ dรฉposรฉes sur les lames traitรฉes et placรฉes sur une plaque chauffante ร 42ยฐC afin de permettre leur รฉtirement. Lโexcรฉdent de milieu de montage a รฉtรฉ รฉliminรฉ grรขce ร un papier absorbant et les lames ont รฉtรฉ laissรฉes ร tempรฉratureambiante pendant douze heures sur un portoir pour le sรฉchage.Les lames ainsi prรฉparรฉes ont รฉtรฉ rรฉhydratรฉes dans des bains successifs de solutions dโรฉthanol de degrรฉ dรฉcroissant et colorรฉes par la coloration Hรฉmatoxyline-Eosine-Safran (HES) (annexe 2). Lโhรฉmatoxyline colore dโabord les noyaux cellulaires en violet. Lโรฉosine colore ensuite le cytoplasme des cellules en rose. Enfin, le safran colore les fibres de collagรจne du tissu conjonctif en orange.
MESURE DES DIAMETRES FOLLICULAIRES ET OVOCYTAIRES
Chaque coupe dโovaire a รฉtรฉ observรฉe au microscope (BX41, Olympus, Rungis, France). Les mesures ont รฉtรฉ rรฉalisรฉes grรขce ร un micromรจtre oculaire. Le diamรจtre des follicules et des ovocytes a รฉtรฉ dรฉterminรฉ par deux mesures perpendiculaires en prenant comme limites : – pour le follicule, la membrane basale – pour lโovocyte, la zone pellucide dโune part, et la membrane cytoplasmique dโautre part. La diffรฉrence entre les deux types de mesures rรฉalisรฉes pour le diamรจtre ovocytaire a permis de calculer lโรฉpaisseur de la zone pellucide. Sauf mention contraire, nous nommerons dรฉsormais ยซ diamรจtre ovocytaire ยป le diamรจtre mesurรฉ en incluant la zone pellucide. La figure 7 prรฉsente la photographie dโun follicule prรฉ-antral au microscope optique sur laquelle sont annotรฉs les repรจres qui ont รฉtรฉ choisis pour mesurer les diamรจtres ovocytaires et folliculaires.Chaque mesure a รฉtรฉ rรฉalisรฉe au grossissement le plus รฉlevรฉ possible, c’est-ร -dire x400 pour les follicules infรฉrieurs ร 300 ยตm, x200 ou x100 pour les follicules de 300 ร 1000 ยตm et x40 pour les follicules de plus de 1000 ยตm. Les lames ont รฉtรฉ photographiรฉes ร lโaide dโun appareil photographique numรฉrique (Camedia digital camera C-3030 zoom, Olympus, Rungis, France). Les images ainsi obtenues ont รฉtรฉ transfรฉrรฉes vers un ordinateur via un logiciel spรฉcifique (Camedia Master 2.0, Olympus) puis analysรฉes. Cette procรฉdure a permis de localiser plus aisรฉment les lames dโintรฉrรชt, et donc dโeffectuer un gain de temps considรฉrable. Les plus gros follicules ont รฉtรฉ observรฉs sur plusieurs coupes consรฉcutives afin de dรฉterminer avec prรฉcision leur diamรจtre maximal. Pour ces follicules, le diamรจtre de lโovocyte a รฉtรฉ mesurรฉ sur la coupe centrรฉe sur son noyau. La prรฉsence de plusieurs ovocytes par follicule, caractรฉrisant un follicule polyovocytaire, nโa pas รฉtรฉ spรฉcifiquement รฉtudiรฉe. Les rรฉsultats ont รฉtรฉ retranscrits dans des tableaux dont un exemple est donnรฉ en annexe 4. Pour chaque follicule ont รฉtรฉ rapportรฉs le stade folliculaire, le diamรจtre de lโovocyte comprenant ou non la zone pellucide et le diamรจtre du follicule. Pour chaque donnรฉe, le numรฉro de la lame ayant รฉtรฉ utilisรฉe pour la mesure ainsi que le grossissement choisi ont รฉtรฉ soigneusement indiquรฉs afin de permettre les vรฉrifications รฉventuelles.
CLASSIFICATION DES STADES FOLLICULAIRES
Pedersen et Peters (1968) ont proposรฉ une classification des ovocytes et des follicules ร partir de leurs observations chez la souris. Elle est basรฉe sur la taille de lโovocyte, la taille du follicule, le nombre de cellules folliculaires entourant lโovocyte (nombre de cellules visibles au microscope optique sur la plus grande section du follicule) et la prรฉsence et la morphologie de lโantrum. Cette classification a รฉtรฉ reprise dans cette รฉtude. Nรฉanmoins, dans un souci de simplification, certains stades folliculaires ont รฉtรฉ regroupรฉs (tableau 1).
Nous avons ainsi dรฉfini les stades folliculaires comme suit (figure 8) : – Primordial : ovocyte entourรฉ de couche de cellules folliculaires aplaties – Primaire : ovocyte entourรฉ dโune couche de cellules folliculaires cuboรฏdales – Secondaire : ovocyte entourรฉ de deux couches de cellules folliculaires – Prรฉ-antral : ovocyte entourรฉ de plus de deux couches de cellules folliculaires – Jeune antral : follicule contenant plusieurs petites cavitรฉs antrales – Antral : follicule contenant une grande cavitรฉ antrale unique
ANALYSE STATISTIQUE
Pour chaque stade folliculaire, les moyennes des diamรจtres folliculaires, ovocytaires ainsi que lโรฉpaisseur de la zone pellucide ont รฉtรฉ calculรฉes et les rรฉsultats sont exprimรฉs sous la forme de moyenne ยฑ SEM (en anglais Standard Error of the Mean, ou erreur-type sur la moyenne). Lโerreur-type est le rรฉsultat du quotient de lโรฉcart type de lโรฉchantillon par la racine carrรฉe de la taille de cet รฉchantillon. Elle informe sur le degrรฉ selon lequel la moyenne de lโรฉchantillon approche la moyenne de la population. Plus elle est petite, plus lโรฉchantillon est donc reprรฉsentatif. De mรชme, plus lโรฉchantillon est grand, plus cette erreur est petite.Lors de la comparaison des diamรจtres folliculaires, des diamรจtres ovocytaires et de lโรฉpaisseur de la zone pellucide en fonction du stade folliculaire, nous avons procรฉdรฉ ร une analyse de la variance puis ร un test de Student-Neuman-Keuls (SAS, Cary, NC, USA). Lโanalyse de la variance (ANOVA, en anglais ANalysis Of VAriance), est un test statistique qui permet de comparer les moyennes issues de plusieurs รฉchantillons. On peut considรฉrer quโil sโagit dโune gรฉnรฉralisation du test de Student ร plus de deux moyennes. En effet, lโutilisation du test de Student pour comparer les moyennes deux par deux conduirait ร surestimer le risque dโerreur. Nous avons supposรฉ pour lโutilisation de ces tests que la distribution des populations observรฉes suivait une loi normale dont les variances รฉtaient identiques. De plus, nous avons dรฉcidรฉ de faรงon arbitraire que les rรฉsultats seraient significatifs si le risque de considรฉrer que les moyennes observรฉes รฉtaient diffรฉrentes alors quโelles ne lโรฉtaient pas (risque ฮฑ) รฉtait infรฉrieur ร 5 %. La conclusion de lโANOVA utilisรฉe seule est que toutes les moyennes comparรฉes sont identiques ou que lโune des moyennes est significativement diffรฉrente. Nous avons donc poursuivi notre รฉtude par un test de Student-Neuman-Keuls qui a permis de comparer les moyennes deux par deux.Enfin, afin de permettre la mise en relation de la croissance folliculaire avec la croissance ovocytaire, nous avons utilisรฉ les rรฉgressions linรฉaires simples fournies par le logiciel Excel (Office XP, Microsoft, Courtaboeuf, France). Pour chaque รฉquation nous avons calculรฉ le coefficient r, appelรฉ coefficient de corrรฉlation linรฉaire de Bravais-Pearson. Ce coefficient a pour but dโรฉvaluer la pertinence de la rรฉgression linรฉaire. Il peut รชtre comparรฉ ร une valeur seuil indiquรฉe dans la table de Bravais-Pearson, et qui tient compte de la taille de lโรฉchantillon รฉtudiรฉ ainsi que du risque dโerreur tolรฉrรฉ. En rรจgle gรฉnรฉrale on considรจre que le test est valide lorsque r est supรฉrieur ร la moitiรฉ de la racine de 3 (environ 0,87). Par convention, nous avons choisi dโindiquer le carrรฉ de ce coefficient, r2, qui reprรฉsente le coefficient de dรฉtermination et permet de faciliter la comparaison. La valeur de ce dernier est comprise entre 0 et 1, 1 indiquant une corrรฉlation parfaite. Ainsi, r2 = 0,8 signifie que 80 % de la variation de Y est expliquรฉe par la variation de X et vice versa. On en dรฉduit la probabilitรฉ quโil nโy ait pas rรฉellement de relation linรฉaire (risque ฮฑ) entre les deux variables, notรฉe P. Par convention, nous avons choisi de rejeter cette hypothรจse lorsque cette probabilitรฉ รฉtait infรฉrieure ร 5 %.
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Table des matiรจres
ABLE DES MATIERES
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION
1.Matรฉriels et mรฉthodes
1.1.Rรฉcolte et sรฉlection des ovaires
1.2.ย ย Prรฉparation histologique
1.3.ย Mesure des diamรจtres folliculaires et ovocytaires
1.4. Classification des stades folliculaires
1.5.Analyse statistique
2. Rรฉsultat
2.1. Croissance folliculaire
2.2. Croissance ovocytaire
2.3.Relation entre la croissance folliculaire et ovocytaire
2.3.1.ย Selon le stade folliculaire
2.3.2. Tous stades folliculaires confondus
2.4.ย Apparition et รฉvolution de lโรฉpaisseur de la zone pellucide
2.4.1. Selon le stade folliculaire
2.4.2.ย Tous stades folliculaires confondus
3. Discussion
3.1. Croissances folliculaire et ovocytaire
3.1.1.ย ย Croissance folliculaire
3.1.2.ย ย Croissance ovocytaire
3.2. Formation de lโantrum
3.2.1.ย ย Rรดles et origine de lโantrum 1
3.2.2. Apparition de lโantrum lors de la folliculogenรจse
3.2.3. Relation entre la formation de lโantrum et lโacquisition de la compรฉtence mรฉรฏotique
3.3.ย Relation entre la croissance folliculaire et ovocytaire
3.3.1ย Croissance biphasique de lโovocyte
3.3.2.ย ย Relation entre lโacquisition du diamรจtre ovocytaire maximal et la formation de lโantrum
3.3.3. Relation entre le diamรจtre ovocytaire et lโacquisition de la compรฉtence mรฉรฏotique
3.4.ย Apparition et รฉvolution de lโรฉpaisseur de la zone pellucide
3.4.1.Composition et structure de la zone pellucid
3.4.2.ย Apparition de la zone pellucide lors de la folliculogenรจse et origine
3.4.4.ย imensions de la zone pellucide chez la chatt
3.4.5. Perspectives
3.5.ย Quelques remarques sur les follicules polyovocytaires
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES
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