Croissance possible de Chlorella vulgaris

Optimization of heterotrophic (dark) growth conditions of Chlorella vulgaris using CO2 as sole carbon source

Méthode:

La souche utilisée pour l’ensemencement de mes erlenmeyers provenait d’un échantillon venant de Munichqui fut étalésur une plaque de 3N BBM afin d’observer la croissance et d’en isolé les colonies d’algues. Les algues ont poussée sur la plaque en conditions mixotrophies à température ambiante, une contamination de colonies blanches était présente sur la plaque de départ c’est pourquoi il a fallu refaire une plaque avec uniquement le prélèvement des colonies d’algues. Un milieu de culture de 3N BBM fut préparé et 0,45% de mélasse a été ajoutés afin de favoriser d’autant plus la croissance des microalgues en condition mixotrophiques [13]. Quelques colonies de Chlorella vulgaris furent inoculée dans un erlenmeyer de 300ml préalablement stérilisé. La culture souches est resté sous agitation sous une lampe avec un ratio de lumière/noir de 16h/8h afin de favoriser un maximum sa croissance [14] l’agitation est importante afin que toutes les algues aient accès à la lumière et ne subissement pas d’entassement au fond de l’erlenmeyers cachant ainsi l’accès à la lumière de la plupart des cellules. Après 6 jours de croissance, les essais ont pu débuter, des prises correspondant à 20% (v/v) du volume total de 3N BBM ont été prélevées dans la culture souche afin d’ensemencés les six erlenmeyers des premiers essais préalablement stérilisés[figure 5]. Une fois que le volume pour les essais était prélevé, il a fallu compléter avec du BBM 3N l’erlenmeyer contenant la culture souche jusqu’à un volume d’environ 300ml afin de laisser se multiplier les algues en milieu mixotrophiques pour les futurs essais.

Les essais étaient réalisés en culture statique, ce qui limite l’accès au CO2à une certaine partie des molécules d’algues et ce qui n’est pas idéale pour obtenir de bons rendements, mais dans notre cas le rendement n’est pas important c’est les l’influence des différents paramètres qui est étudié. Tous les 2 jours la croissance des échantillons est contrôlée avec une mesure du pH, de l’absorbance à 560nm et de la température. L’alimentation en CO2varie légèrement entre les prises d’échantillons car il est difficile d’obtenir un débit régulier pour tous les erlenmeyers, il faut également mesurer le débit et l’ajuster tous les deux jours. Après une durée de 10 jours de culture, les échantillons sont vidés dans des tubes Falcon®de 50ml, le volume de culture est déterminé, puis les échantillons sont centrifugés à 9000rpm pendant 10 min, le liquide purifié d’algues est éliminé puis les algues sont ensuite lavées 3x avec 10ml d’eau déminéralisé afin de purifier les algues des minéraux restants. Les algues sont ensuite séchées dans les tube sFalcon dans une étuve à 60°C pendant 16h. Les algues sèches peuvent ainsi être récupérées et analysées. Les algues sont ensuite prélevées et pesées au dixième de mg. La quantité de matières connue et le volume de bouillon récupérés et mis en relations pour déterminer le rendement en gramme par litre selon l’équation1:

Discussion générale:

Les résultats montrent une croissance possible de Chlorella vulgaris dans le noir avec comme source de carbone uniquement mélasse et CO2. Les essais avec l’acétate de sodium ont démontré que cette source de carbone n’était pas optimale pour ce type de croissance. Les rendements varient de 0,10 à 0.37g/L. La valeur de 0,37g/L n’a pas pu être égalée par la suite, car l’essai provenaient de la première inoculation de souches de Chlorella vulgaris, soit des souches fraiches qui avaient toutes les conditions nécessaires pour se multiplier, ce qui par la suite c’est amoindri sûrement dû au manque de mélasse mis à disposition dans la culture de base. Les courbes d’absorbance coïncident de manière logique avec le rendement sauf pour quelques échantillons de la figure 8 et 9. L’échantillon contenant 4g/L d’acétate de sodium obtient la meilleure absorbance mais le moins bon rendement, le problème de la prise d’échantillon lors de la détermination de l’absorbance n’est pas envisageable car les deux échantillons contenant 10g/L de mélasse et d’acétate sont très répétable à ce niveau.

Le problème vient probablement lors du pesage des échantillons, beaucoup de matière a pu rester collée aux parois des tubes Falcon®et devenir irrécupérable avec une spatulepour la pesée. Les meilleures croissances étant obtenue avec 10g/L de mélasse dans le milieu. Les rendements entre les essais de 1000ml [figure 13] baissent d’environ 20% par rapport à ceux de 300ml [figure 11], cela est peut-êtredu au CO2qui a plus de mal d’être distribuée au sein de toutes les algues dans une culture statique. Les cellules d’algues au bout de quelque semaines n’était plus vraiment de la même ‘fraicheur’ pour croître dans ces conditions. La comparaison entre les rendements et le taux d’acides aminés total fait remarquer que lorsque le milieu est stimulé par une source de carbone tels que la mélasse le taux d’acides aminées va diminuer de manière drastique, cette diminution est peut-être dû à l’épuisement des souches comme expliqué auparavant. Mais la chose la plus importante estle taux d’acides aminées essentielles qui ne varie que de 0,01% parmi tous les essais et tous les paramètres testés. Ce qui explique que la composition biochimique des algues ne changepas malgré les variations des trois sources de carbone ajoutée.

Influence de l’acétatede sodium:

L’ajout d’acétate de sodium a été varier afin d’observer s’il y avait un effet sur la croissance dû à l’acétate uniquement. Les rendements obtenus [Figure9] montre que les souches de Chlorella poussent malgré un faible taux d’acétate de sodium et que le rendement peut être identique avec 4g/L d’acétate de sodium qu’avec 10g/L. Les essais suivants [Figure 11] montre une meilleure croissanceet un rendement meilleur dans les milieux de croissance ne contenant pas d’acétate de sodium. L’hypothèse que l’acétate de sodium ne permet pasla croissance des Chlorella vulgarisen condition Le milieuest privé de 20% deson apport en CO2pendant au moins 2 jours puis les algues acidifie le milieu rendant ainsi plus de CO2disponible et accroît ainsi la croissance. Une tendance est observéeaussi concernant les acides aminés et les protéines entre les échantillons contenant pas ou peu d’acétate de sodium avec les échantillons en contenant beaucoup. L’analyse Kjeldahl montre une augmentation du taux de protéines dans l’échantillon contenant 2g/L d’acétate plus élevé de 5% de l’échantillon contenant 10g/L d’acétate [Tableau4].

Il y a un effet possible de l’acétate de sodium sur le taux de protéine mais aucune étude n’a été publiée avec ces paramètres et ces résultats. Les glucides et les lipides sont des molécules de stockage, tandis que les protéines sont desbiomoléculesde structures. Par conséquent, une augmentation de la teneur en protéine suggèreune augmentationde la croissance en microalgues[8]. Ce qui dans cesessais est confirmé avec l’augmentation du rendement pour les analyses ayant peu d’acétate de sodium [Figure 14] Le taux des quatre acides aminés ou l’acétate de sodium est métabolisé est légèrement augmenté [Tableau3], mais cela n’a pas un véritable impact sur la composition biochimique de la souche car parmi tous les essais, la proportion d’acides aminés essentielles est semblable avec une moyenne de 40,1% et un écart-type de 0,01%. d’hétérotrophie aété confirmée par des essais sur des volumes de 1 litres. Les courbes d’absorbance [Figure 13] ainsi que les rendements [Figure 14] prouvent le fait que l’acétate de sodium n’est pas à favoriserdans ce type de culture.

En effet, il a été prouvé que l’assimilation de l’acétate par les algues bleu-vertes est très réduit en l’absence de CO2 et est dépendante de la lumière [19]. L’acétate ne permet pas la respiration cellulaire dans les algues bleu-vertes en conditions hétérotropheset sans apport de carbone[20]. Les algues vertes sont limitées dans l’utilisation de substance organiques pour croître et produire de l’énergie[21]. Ilfaut une source de carbone et sans lumière la respiration reste quand même limitée et devient 20% moins importante qu’en conditions de lumière [22]. L’acétate de sodium permet de tamponner légèrement le pH, de manière général aucun échantillon contenant au moins 2g/L d’acétate de sodium n’est descendu en dessous d’un pHde 5 alors que les échantillons contenant de la mélasse descendent beaucoup plus bas jusqu’à un pH de 4,2 [Figure 12]. Le fait de ralentir l’acidification du milieu et de tamponner le pH ne permet pas d’assimiler la totalité du CO2car une partie se trouve sous la forme d’HCO3-qui avec un pH plus élevé que 4,75 se retrouve solubles dans le milieu [Figure 16].

Table des matières

1.Introduction
2.Matériel et méthode
3.Résultats
Premiers essais
Deuxièmes essais
Troisièmes essais
Quatrièmes essais
Analyse des acides aminés
Analyse Kjeldahl
Discussion
Conclusion
Bibliographie
Annexe

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