Criblage d’une banque de mutants aléatoires d’E. faecalis vis-à-vis de la sensibilité au lysozyme

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Activité non enzymatique du lysozyme

En marge du mécanisme antibactérien bien connu, basé sur l’hydrolyse des chaînes du PG, deux modes d’action antibactériens non-enzymatiques (c’est à dire non catalytique et non hydrolytique) du lysozyme ont été proposés. En effet, de nombreux auteurs ont montré que la réduction ou l’élimination de l’activité enzymatique du lysozyme par des traitements dénaturants (chaleur et dithiothréitol, DTT) ou par mutagenèse dirigée ne réduisait pas nécessairement l’activité bactéricide du lysozyme (163). Laible et Germaine (175) ont été les premiers à observer cet effet, en montrant que du lysozyme humain dont l’activité muramidase était inhibée par la réduction, à l’aide de dithiothréitol , des ponts disulfures essentiels à l’activité lytique, avait un potentiel bactéricide aussi important qu’un lysozyme humain natif (175). Ce mécanisme de lyse non-enzymatique provoqué par le lysozyme a aussi été démontré chez S. aureus (176) et chez Listeria innocua (177).
L’ensemble des études effectuées sur ce sujet suggère que le lysozyme peut entraîner une mort cellulaire par deux mécanismes différents. La première étape pour chacun de ces mécanismes consiste en l’attraction électrostatique du lysozyme chargé positivement par les acides teichoïques et lipoteichoïques et/ou les phospoholipides de la surface cellulaire. Dans le mode d’action muramidase-indépendant, la mort cellulaire est le résultat soit de l’activation des autolysines (par interaction du lysozyme avec les acides teïchoïques et/ou modification de la charge cationique membranaire) soit par une perturbation de la membrane cytoplasmique due aux caractéristiques intrinsèques de la protéine du lysozyme (pour revue, voir (163)).
Ainsi, depuis la découverte du deuxième mode d’action non lytique, du à ses propriétés cationiques, le lysozyme est de plus en plus considéré comme faisant partie intégrante de la classe des peptides cationiques antimicrobiens (cationic antimicrobial peptide, CAMP), dont font partie les défensines, les cathélicidines et les thrombocidines , qui sont des membres importants du système de défense immunitaire inné (178). Ce n’est que très récemment que les mécanismes bactériens de défense contre chacun de ces modes d’action ont été caractérisés chez S. aureus (179).

Régulation de l’expression du lysozyme

Les différentes espèces ont développé divers mécanismes afin de réguler l’expression du lysozyme dans l’espace et le temps. Chez la poule, le gène du lysozyme se comporte de manière complètement différente dans les macrophages et l’oviducte (180). L’expression dans le macrophage est régulée par un activateur cis, tissus-spécifique et des éléments inhibiteurs ; son niveau d’expression est maximum quand les macrophages sont stimulés par des lipopolysaccharides bactériens (181). Dans l’oviducte l’expression du lysozyme est régulée par les hormones stéroïdes (182). Chez la souris, au lieu d’avoir un seul gène et deux mécanismes de régulation, le gène du lysozyme a subi un évènement de duplication produisant deux gènes avec différents profils d’expression. Le premier lysozyme est exprimé dans les cellules de Paneth du petit intestin (où il contribue certainement à la digestion) et le second est exprimé dans les macrophages et les granulocytes (183).

Mécanismes de résistance contre le lysozyme

Les bactéries ont co-évolué avec les effecteurs du système immunitaire de l’hôte, dont fait partie le lysozyme. Il n’est donc pas surprenant que certaines bactéries aient développé des systèmes de défense leur procurant un avantage sélectif sur les autres. La présence de tels mécanismes peut aider à comprendre les phénomènes de colonisations persistantes et/ou d’infections chroniques (178). Bien que le principe de ces modes de défense ai été proposé depuis de nombreuses années, ce n’est que depuis peu que les mécanismes moléculaires responsable de cette résistance commencent à être identifiés. De ces mécanismes de résistance, 3 catégories de fonctions ont été identifiées : – l’inhibition de l’action lytique du lysozyme – l’inhibition de l’action non lytique du lysozyme – l’inactivation du lysozyme.

Inhibition de l’action lytique du lysozyme

Certaines bactéries produisent du PG résistant aux muramidases. Les principales modifications connues sont la O-acétylation du NAM et la dé-N-acétylation du NAG (Figure 16). Ces changements provoquent une modification du site de reconnaissance du lysozyme envers son substrat entraînant une réduction de son activité lytique.
La O-acétylation du PG intervient au niveau du groupement hydroxyl du C6 du résidu NAM et provoque la formation d’un résidu 2,6-diacétylmuramyl (Figure 16). Cette modification prend place à l’extérieur de la membrane cytoplasmique après que le PG ait été assemblé (184). Cette modification a été décrite pour la première fois en 1958 indépendamment chez Streptococcus faecalis (185) et chez Micrococcus luteus (186). Depuis, la présence de PG O-acétylé a été observée chez de nombreuses bactéries (en 2000, 69 souches de 19 espèces différentes) aussi bien à Gram positif que négatif (187). Le taux naturel de O-acétylation varie de 10 à 70 % du nombre total de NAM (184).
La O-acétylation confère une protection contre l’action lytique des muramidases proportionnellement au taux de O-acétylation du PG (188). Il existe toutefois, certaines muramidases (comme la mutanolysine : N,O-diacétylmuramidase issue de Streptomyces globisporus) qui ne sont pas affectées par la présence de groupements O-acétyl (184). La résistance du PG O-acétylé aux muramidases représenterait un problème de santé publique puisque la présence de PG O-acétylé dans le système sanguin est à l’origine d’arthrites chroniques disparaissant après administration de mutanolysine (189).
En marge de son rôle dans la résistance au lysozyme, la O-acétylation a été identifiée comme intervenant dans d’autres mécanismes tels l’inactivation de certains antibiotiques (190, 191) et comme régulant l’activité d’autolysines (par modification chimique de leur substrat) en fonction de la phase de croissance ou de l’état physiologique (ex : état viable mais non cultivable) (142).
Plusieurs gènes responsables de cette modification ont été identifiés chez différentes bactéries, aac(2′)-Ia chez Providencia stuartii (192), oatA chez S. aureus (193), pacA chez Neisseria sp.(191) et adr chez S. pneumoniae (191). Parmi ces 4 gènes, seuls oatA et adr partagent entre eux des homologies de séquence significatives.
Bien que plusieurs gènes soient identifiés dans le mécanisme de O-acétylation, la source du groupement acétyle n’est toujours pas identifiée. Il a été proposé en 1991 (194) que cette modification soit le produit d’un transfert d’acétyle NO durant le recyclage du PG mais cette hypothèse n’a toujours pas été étayée.
La dé-N-acétylation du NAG est aussi une modification bien connue du PG. A notre connaissance, la description de cette modification remonte à 1971 (195). De même que la O-acétylation, la dé-N-acétylation intervient dans les mécanismes de résistance au lysozyme (196) par modification du substrat de l’enzyme. La dé-N-acétylation du NAG intervient en moyenne sur 17 % du total des muropeptides (163), ce qui suffit à conférer une résistance au lysozyme. En plus de conférer une résistance au lysozyme, le rôle physiologique proposé pour cette modification est la régulation des hydrolases impliquées dans la synthèse et l’autolyse du PG (197). Une seule famille de gènes a été identifiée comme responsable de cette modification et nommé pgdA (pour peptidoglycane N-acétylglucosamine déacétylase A) (198). Ce gène a d’abord été identifié chez S. pneumoniae puis des homologues ont été caractérisés comme responsable de dé-N-acétylation chez plusieurs autres bactéries : B. cereus, B. anthracis (199), L. monocytogenes (200) et L. lactis (201). On peut aussi noter que la dé-N-acétylation du résidu NAM a été caractérisée chez B. subtilis (202, 203). Le gène à l’origine de cette dé-N-acétylation a été nommé pdaA mais cette modification n’a pas été identifiée comme conférant une résistance au lysozyme chez B. subtilis.
Des études récentes montrent que le PG et ses produits de dégradation feraient partie des éléments moléculaires associés à la présence de pathogènes qui sont reconnus par l’hôte grâce à des récepteurs intra-cellulaires du système immunitaire inné comme les protéines Nod et les récepteurs Toll-like (89, 204). Il a donc été proposé que la O-acétylation et la dé-N-acétylation constitueraient des mécanismes d’échappement, affectant la capacité de l’hôte à mettre en place une réponse immunitaire adaptée pendant l’infection. Ceci a récemment été confirmé puisque la dé-N-acétylation du PG a été caractérisée comme un mécanisme très efficace permettant d’échapper au système de défense immunitaire inné de l’hôte (200).

Inhibition de l’action non lytique du lysozyme

Le mode d’action non lytique du lysozyme semble être provoqué soit par l’activation de l’autolyse bactérienne soit par la perturbation de la membrane plasmique. Dans ces deux cas, la première étape consiste en l’attraction électrostatique du lysozyme chargé positivement par les acides teichoïques et lipoteichoïques et/ou les phospoholipides (chargés négativement) de la surface bactérienne. Les mécanismes de défense mis en place par les bactéries ont pour but d’empêcher cette attraction en modifiant la charge ionique pariétale (212).
Deux modifications des molécules anioniques ont à ce jour été identifiées comme conférant une résistance accrue aux CAMP : la D-alanylation des TA et l’ajout de L-lysine aux phosphatydilglycérol (Figure 17). Ces deux mécanismes ont été identifiés chez S. aureus et sont respectivement dus à l’opéron dlt (213) et au gène mprF (214).
Bien que l’absence de WTA chez S. aureus provoque une augmentation de la sensibilité au lysozyme il semblerait que l’élément lui conférant sa résistance soit plutôt la D-alanylation des WTA que les WTA eux-même (215, 216).

Souches bactériennes, plasmides, oligonucléotides et conditions de culture

L’étude est réalisée principalement avec la souche E. faecalis JH2-2 (217) issue de l’isolat clinique E. faecalis JH2 (218) suite à l’action d’un mutagène chimique. Les caractéristiques des différentes souches bactériennes et des principaux mutants d’E. faecalis JH2-2 étudiés au cours de ce travail sont décrites dans le Tableau 2. La souche JH2-2 présente, en comparaison à la souche séquencée d’E. faecalis V583 (1), une meilleure aptitude à la transformation et une sensibilité à l’érythromycine, permettant l’utilisation d’une gamme d’outils moléculaires plus importante, cette souche est de plus dépourvue de plasmides.
La souche E. coli DH5 est utilisée lors des étapes de clonage dans le vecteur d’expression pQE-30 (Qiagen). La souche E. coli M15 est utilisée pour la surproduction de protéine de fusion avec le système QIAexpress (Qiagen).
Lors d’expériences d’α-complémentation, le 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside (X-Gal) et l’isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) sont additionnés au milieu gélosé à des concentrations de 50 µg/mlet 1 mM, respectivement.
Les milieux gélosés sont obtenus par l’ajout de 15 g/l de bactoagar dans les milieux liquides.
Les souches bactériennes sont conservées par congélation à -80 °C après addition dans le milieu de culture de glycérol à une concentration finale de 15 % (v/v).
L’ensemble des plasmides utilisés dans le cadre de cette étude est récapitulé dans le Tableau 3 et les différentes amorces et leur utilisation sont référencées dans le Tableau 4.
La croissance des différentes souches étudiées au cours de ce travail a été estimée par turbidimétrie par la mesure de la densité optique à 600 nm (DO600nm) à l’aide du Biophotometer (Eppendorf) de suspensions bactériennes, obtenues en ensemençant à 1 %, 10 ml du milieu de culture adéquat à l’aide de cultures prises en phase stationnaires de croissance.

Méthodes d’analyses physiologiques

Tests de sensibilité au lysozyme

Après des essais préliminaires, nous avons retenu pour différencier les niveaux de sensibilité au lysozyme de mutants dérivant de la souche d’E. faecalis JH2-2 les conditions suivantes : les tests de sensibilité ont été effectués sur 3 ml de milieu Mueller Hinton agar (pH 7,4), contenant différentes concentrations de lysozyme (0, 5, 20, 40 et 60 mg/ml) et du tellurite de potassium à 0,8 µg/ml, disposé dans une plaque de culture compartimentée 5×5. Pour chaque souche, 10 µl d’une suspension bactérienne contenant 106 cellules/ml ont été déposés sur les différents milieux. Les zones de croissance ont été observées après 48 h d’incubation à 37 °C. La différence de couleur observée entre la première colonne et les suivantes est due à la turbidité causée par la présence de lysozyme. Le tellurite de potassium a été ajouté afin d’accroître le contraste entre les colonies et le milieu. Les mêmes tests ont été conduits sur des milieux de cultures dépourvus de tellurite de potassium.

Criblage d’une banque de mutants aléatoires d’E. faecalis vis-à-vis de la sensibilité au lysozyme

La banque de mutants insertionnels de la souche JH2-2 d’E. faecalis utilisée dans cette étude est celle décrite par Le Breton et al. (222). Brièvement, des fragments d’ADN chromosomiques de 0,2 à 1,5 kb générés par une digestion partielle par l’endonucléase AluI ont été clonés dans le plasmide pORI19 (dérivé de pWV01 Ori+ RepA+) dans la souche « helper » RepA+ d’E. coli EC101 (223) afin d’obtenir une banque d’environ 37200 plasmides recombinants. Un mélange de ces plasmides a ensuite été transformé dans une souche d’E. faecalis ayant préalablement reçu le vecteur pVE6007 (plasmide pG+host3 dérivé Ori+ RepATS du pWV01) (224). Les clones ont été incubés à 30 °C en milieu GM17 contenant de l’érythromycine et du chloramphénicol (la protéine thermosensible RepATS est active à 30 °C, permettant la réplication des plasmides recombinants pG+host3 et pORI19). Les cellules ont ensuite été transférées dans du milieu GM17 contenant de l’érythromycine et incubées à 42 °C afin d’inactiver la protéine RepATS et favorisant ainsi la perte du pG+host3 et l’intégration des plasmides pORI19 recombinants. 9 600 mutants intégratifs d’E. faecalis ont été repiqués sur microplaques 96 puits dans 200 l de milieu GM17 contenant de l’Erythromycine et cultivés à 37 °C jusqu’à atteindre la phase stationnaire de croissance.
La recherche de mutants affectés dans la capacité à résister à l’action du lysozyme a été faite en ensemençant, à l’aide des cultures précédentes, des boîtes de Petri contenant du milieu MH supplémenté de lysozyme à 20 mg/ml et en cultivant les mutants 16 h à 37 °C. La recherche de clones ayant perdu la capacité de se développer en présence de lysozyme a été effectuée visuellement.

Survie en macrophages de souris

Les expériences de survie en macrophages ont été réalisées par l’équipe de M. Sanguinetti de l’Institut de Microbiologie, de l’Université Catholique du Sacré Cœur, à Rome.
La survie d’E. faecalis JH2-2 et des différents mutants en macrophages de péritoine de souris est estimée en utilisant un modèle d’infection in vivo-in vitro (37). Les différentes souches d’E. faecalis sont cultivées en aérobiose à 37 °C en milieu BHI pendant 16 h tandis qu’E. coli DH5α (utilisée comme contrôle négatif) est cultivée en bouillon LB. Les bactéries sont ensuite récupérées par centrifugation et resuspendues dans un tampon phosphate pour injection. Des souris mâles de type BALB/c âgées de 10 semaines (Harlan Italy S.r.l., San Pietro al Natisone, Udine, Italy) sont infectées avec 107 à 108 cellules par injection intrapéritonéale. Après 6 h d’incubation, les macrophages sont collectés par lavage du péritoine, centrifugés, et repris dans un milieu « Dulbecco’s modified Eagle’s » (HEPES 10 mM, glutamine 2 mM, sérum fœtal bovin 10 % et acides aminés non essentiels) supplémenté avec de la vancomycine (10 µg/ml) et de la gentamicine (150 µg/ml) afin d’éliminer les bactéries extracellulaires. Les suspensions cellulaires sont réparties en boîtes de culture et incubées à 37 °C en présence de 5 % de CO2 pendant 2 h. Puis, les macrophages sont lavés, et lysés par ajout d’un détergent. Après dilution en bouillon BHI, les lysats sont ensemencés sur milieu BHI solide (agar) pour la quantification des bactéries intra-cellulaires viables. Cette procédure est réalisée 8, 24, 48 et 72 h après l’infection.

Tests d’immobilisation en milieu semi-liquide

Les tests d’immobilisation ont été réalisés dans du milieu GM17 contenant 0,04 % d’agar (225, 226). Deux types d’ensemencement ont été réalisés, soit en surface, par dépôt d’une goutte de culture de nuit à la surface du milieu, soit en masse par ensemencent de 100 µL d’une dilution 10-6 d’une culture de nuit. Les observations ont été effectuées à intervalles réguliers pendant 72 H.

Tests de sensibilité aux antibiotiques

La détermination de la sensibilité aux antibiotiques a été réalisée selon la méthode de diffusion en gélose Mueller-Hinton avec des disques d’antibiotiques (Biorad).
Ces tests consistent à déposer à la surface d’une gélose Mueller-Hinton des disques de papier buvard imprégnés des différents antibiotiques testés. Chaque antibiotique diffuse au sein de la gélose et détermine des concentrations inversement proportionnelles à la distance par rapport au disque. Avant de déposer les disques, on ensemence uniformément la surface de la gélose avec le micro-organisme à étudier. L’inoculum doit être dense (opacité équivalente à 0,5 sur l’échelle de Mac Farland). Après une incubation de 24 à 48 heures à 37 °C, les disques apparaissent entourés d’une zone d’inhibition dont le diamètre permet d’estimer et de comparer les concentrations minimales d’inhibition. Une batterie de 13 antibiotiques a été généralement utilisée : l’amoxicilline, l’ampicilline, la céfalotine, le chloramphénicol, l’érythromycine, la kanamycine, l’oxacilline, la pénicilline, la spiramycine, la streptomycine, les sulfamides, la tétracycline, et les triméthoprime-sulfamides.

Table des matières

LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
ABREVIATIONS
AVANT-PROPOS
AVANT-PROPOS
ANALYSE BIBLIOGRAPHIQUE
I. Principales caractéristiques du genre Enterococcus et de l’espèce faecalis
I. 1. Caractères généraux
I. 2. Niches écologiques des entérocoques
I. 3. Utilisation des entérocoques dans l’alimentation
I. 4. Les entérocoques, des bactéries pathogènes opportunistes
I. 4. 1. Résistance aux antibiotiques chez les entérocoques
I. 4. 2. Mécanismes d’infection in vivo
I. 4. 3. Facteurs de virulence chez E. faecalis
II. Paroi des bactéries à Gram positif
II. 1. Le peptidoglycane (PG)
II. 1. 1. Structure du PG
II. 1. 2. Biosynthèse du PG
II. 1. 3. Cytosquelette et biosynthèse du PG
II. 1. 4. Caractérisation d’un périplasme chez les bactéries à Gram positif
II. 1. 5. Architecture du PG
II. 1. 6. Rôle du PG dans la pathogenèse
II. 2. Les acides téichoïques
II. 2. 1. Composition des WTA et des LTA
II. 2. 2. Synthèse des WTA et des LTA
II. 2. 2. a. Synthèse des WTA
II. 2. 2. b. Synthèse des LTA
II. 2. 3. D-alanylation des TA
II. 2. 4. Rôle des TA dans la physiologie bactérienne
II. 2. 5. Rôle des TA dans la pathogénicité
II. 3. Les protéines de surface bactérienne et les protéines sécrétées
II. 3. 1. Voies de sécrétion
II. 3. 2. Protéines liées à la membrane
II. 3. 2. a. Protéines transmembranaires
II. 3. 2. b. Lipoprotéines
II. 3. 2. c. Protéines ancrées dans la membrane
II. 3. 3. Protéines liées de manière covalentes à la paroi
II. 3. 4. Protéines liées de manière non covalente à la paroi
II. 3. 4. a. Unités répétées de liaison à la paroi
II. 3. 4. b. Protéines du S-layer
II. 4. Capsule
II. 5. Les enzymes de dégradation du PG
II. 5. 1. Rôle et régulation des autolysines
II. 5. 2. Sources exogènes d’hydrolases du PG
III. Le lysozyme
III. 1. Les étapes importantes dans la découverte du lysozyme
III. 2. Le lysozyme dans le domaine de la santé publique et l’alimentation
III. 3. Propriétés biochimiques du lysozyme
III. 4. Découverte de différentes familles de lysozyme
III. 5. Mécanisme d’action du lysozyme
III. 6. Activité non enzymatique du lysozyme
III. 7. Régulation de l’expression du lysozyme
III. 8. Mécanismes de résistance contre le lysozyme
III. 8. 1. Inhibition de l’action lytique du lysozyme
III. 8. 2. Inactivation du lysozyme
III. 8. 3. Inhibition de l’action non lytique du lysozyme
MATERIELS ET METHODES
I. Souches bactériennes, plasmides, oligonucléotides et conditions de culture
II. Méthodes d’analyses physiologiques
II. 1. Tests de sensibilité au lysozyme
II. 2. Criblage d’une banque de mutants aléatoires d’E. faecalis vis-à-vis de la sensibilité au lysozyme
II. 3. Survie en macrophages de souris
II. 4. Tests d’immobilisation en milieu semi-liquide
II. 5. Tests de sensibilité aux antibiotiques
III. Méthodes de génétique et de biologie moléculaire
III. 1. Extraction des acides nucléiques
III. 1. 1. Extraction d’ADN plasmidique
III. 1. 2. Extraction d’ADN chromosomique
III. 1. 3. Extraction des ARN totaux
III. 2. Réactions de polymérisation en chaîne (PCR)
III. 3. Réaction de PCR Quantitative en temps réel
III. 3. 1. PCR quantitative en temps réel à partir de matrices issues de cultures bactériennes
III. 3. 2. PCR quantitative en temps réel à partir de matrices issues de bactéries isolées de macroph
III. 4. Digestion par les endonucléases de restriction, déphosphorylations et ligatures
III. 5. Séquençage de l’ADN
III. 6. Préparation et transformation des cellules électrocompétentes d’E. coli et d’E. faecalis
III. 7. Mutagenèse chez E. faecalis
III. 7. 1. Mutagenèse dirigée par simple recombinaison homologue
III. 7. 2. Mutagenèse dirigée par double recombinaison homologue
IV. Méthodes d’analyses physico-chimiques
IV. 1. Extraction des protéines totales
IV. 2. Electrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
IV. 3. Electrophorèse bidimensionnelle
IV. 4. Révélation par coloration au bleu de Coomassie
IV. 5. Révélation par coloration au bleu Colloïdal
IV. 6. Spectrométrie de masse
IV. 7. Microscopie électronique
IV. 8. Surproduction et purification de la protéine EF1843 par le système QIAexpress.
IV. 9. Analyse de la structure du PG
IV. 9. 1. Extraction du PG
IV. 9. 2. Digestion du PG par la mutanolysine
IV. 9. 3. Réduction des muropeptides
IV. 9. 4. Séparation HPLC et analyse MALDI-TOF
V. Méthodes d’analyses bioinformatiques
RESULTATS ET DISCUSSION
Chapitre I : Analyse du sécrétome et des protéines de surface d’E. faecalis
I. 1. Contexte de l’étude
I. 2. PCR quantitative en temps réel
I. 3. Analyse de l’organisation structurale des gènes EF2224, et EF3054
I. 4. Analyse physiologique des mutants ∆EF2224 et ∆EF3054
I. 5. Conclusion
Chapitre II : Recherche par approche ciblée des déterminants génétiques responsables de la résist au lysozyme chez E. faecalis
II. 1. Contexte de l’étude
II. 2. Identification de gènes potentiellement impliqués dans la résistance au lysozyme
II. 2. 1. Caractérisation du gène EF0783
II. 2. 2. Caractérisation du gène EF1843
II. 2. 3. Caractérisation du gène EF0590
II. 3. Recherche d’un lien entre résistance au lysozyme et présence des gènes EF1843, EF0783 et EF0
II. 4. Construction des mutants ∆EF1843, ∆EF0783 et du double mutant ∆EF1843/∆EF0783
II. 5. Analyse de la sensibilité au lysozyme
II. 6. Effet de la mutation des gènes EF1843 et EF0783 sur la survie d’E. faecalis dans les macrophages péritonéaux de souris
II. 7. Analyse de la composition des muropeptides du PG d’E. faecalis
II. 8. Purification de la protéine EF1843
II. 9. Analyse de l’expression de EF1843 et de son incidence sur la structure du PG
II. 10. Discussion et conclusion
Chapitre III : Recherche par approche globale de déterminants génétiques responsables de résistance au lysozyme chez E. faecalis 1
III. 1. Mutagenèse aléatoire chez E. faecalis JH2-2 1
III. 2. Recherche des membres du régulon sigV par étude protéomique 1
III. 3. Recherche des membres du régulon sigV par approche transcriptomique 1
III. 4. Conclusion 1
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES 
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 

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