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Étude de l’hétérogénéité intratumorale par l’imagerie
Les études d’imagerie tumorale citées ci-dessus (section 1.3.1) se basent sur l’éva-luation de la moyenne des paramètres dans une coupe ou dans la totalité du volume des tumeurs. Cependant, cette vision ne prend pas en compte l’hétérogénéité de la répartition spatiale des paramètres au sein de la tumeur (HUDSON et al., 2015). L’hé-térogénéité intratumorale a été étudiée à l’aide de plusieurs modalités d’imagerie à plusieurs niveaux de détail et de complexité. Ces méthodes reposent sur l’analyse de cartes paramétriques et/ou sur l’acquisition d’images en 3D permettant d’avoir une information sur la totalité de la tumeur. Les méthodes de caractérisation de l’hé-térogénéité peuvent être appliquées à l’analyse des données acquises par toutes les techniques d’imagerie citées dans la section 1.3.1.
Une première approche pour l’évaluation de l’hétérogénéité tumorale consiste à comparer la moyenne des paramètres dans des plans d’imagerie successifs d’une tumeur et d’étudier la variabilité entre les plans. Cela a été fait, par exemple, avec l’imagerie Dynamic Contrast Enhanced Ultrasound (CEUS) utilisant des agents de contraste ciblés (STREETER et al., 2011) et non ciblés (HOYT, SORACE et SAINI, 2012 ; FEINGOLD et al., 2010). Les trois études montrent une différence entre les plans d’imagerie. Cette approche représente une variabilité intratumorale à une haute échelle.
Une approche plus détaillée est présentée dans (WULKERSDORFER et al., 2017) et dans (GAUSTAD et al., 2005) où les auteurs analysent la différence de la valeur moyenne des paramètres entre les zones périphériques de la tumeur et la zone cen-trale pour l’imagerie TEP et l’IRM de contraste respectivement. Wulkersdorfer et al. (WULKERSDORFER et al., 2017) n’observent pas de différence dans leurs données entre les zones pour des tumeurs cérébrales humaines alors que Gaustad et al. (GAUS- TAD et al., 2005) observent une différence dans des xénogreffes de mélanome humain chez la souris. Cette approche repose sur une division géométrique de la tumeur sans se baser sur des valeurs spécifiques de certains paramètres. Longo et al. dans (LONGO et al., 2015) analysent la répartition des valeurs des paramètres estimés avec l’IRM de contraste à de multiples niveaux de détail : 1) une analyse de la moyenne des paramètres dans toute la tumeur comme présenté dans la section précédente (section 1.3.1) ; 2) Une analyse régionale entre le centre et la périphérie de la tumeur (division géométrique comme vu au paragraphe précédent) .
3) une analyse après classification des pixels par l’algorithme k-means (division régionale en prenant compte de la valeur des paramètres) ; 4) et enfin l’analyse de l’histogramme des valeurs des paramètres (analyse de texture du premier ordre, c’est-à-dire que la relation spatiale entre les pixels n’est pas prise en compte ).
Un niveau de détail plus fin est utilisé dans (SADEGHI-NAINI, FALOU et CZAR-NOTA, 2013) où la répartition des valeurs des paramètres est étudiée en analysant les matrices de co-occurrence. C’est une analyse de texture du deuxième ordre, c’est-à-dire qu’elle prend en compte la relation spatiale entre les pixels. Grâce à cette analyse de texture du deuxième ordre, les auteurs observent une différence significative entre le groupe contrôle et le groupe traité par chimiothérapie dans un modèle de xénogreffe du cancer du sein chez la souris.
Toutes ces méthodes d’analyse permettent donc d’extraire des informations sur l’hétérogénéité tumorale à différentes échelles.
Culture cellulaire et implantation tumorale
Deux lignées tumorales murines ont été utilisées lors des expériences : une lignée tumorale de carcinome colorectal CT26 et une lignée tumorale de carcinome pulmo-naire de Lewis (LLC en anglais). Les tumeurs étudiées pour chaque lignée étaient obtenues par implantation sous-cutanée (modèle ectopique) de fragments tumoraux.
Les lignées CT26 et LLC ont été acquises auprès de l’American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Les cellules CT26 étaient cultivées dans 445mL de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) Glutamax (Life Technologies, French) et les cellules LLC dans 440mL de DMEM avec 5mL (1%) de L Glutamine. Dans les deux cas les solutions étaient complétées avec 50mL (v/v) de Fetal Calf Serum (FCS) et 5mL de penicillin (100 units/mL) et de streptomycin (100 mg/mL). Les cultures cellulaires étaient incubées à 37 C dans une étuve à 5% de CO2. Le repiquage des cellules était réalisé tous les deux ou trois jours. Les cellules injectées provenaient des cultures entre le 15eme` et le 17eme` passage. Les cellules ont été rendues non adhérentes grâce à un traitement constitué d’une solution de trypsin/EDTA (0,25%) (w/v). La trypsine était inactivée par l’addition d’excès de milieu cellulaire complet. Les cellules étaient collectées par centrifugation puis suspendues dans une solution de DMEM complet et maintenues en suspension à une concentration de 2 106 cellules/mL.
L’obtention des tumeurs étudiées s’est faite en 2 étapes. Une première génération de souris BALB/c et C57 Bl/6 J (Janvier Labs, St. Berthevin, France) recevait une injection de 100mL de cellules CT26 ou LLC respectivement, à une concentration de 2 106 cellules/mL dans le flanc gauche. Environ trois semaines après injection, les tumeurs étaient extraites après euthanasie des souris. Les tumeurs extraites étaient ensuite coupées en fragments de 2 à 3 mm de côté (environ de 10 à 30 mm3) pour la lignée CT26 et en fragments de 20 à 40 mm3 pour la lignée LLC. Puis chaque fragment était implanté en sous-cutané dans le flanc gauche d’une souris à étudier. L’utilisation d’une deuxième génération permet d’obtenir une meilleure reproductibilité de la croissance tumorale comme on peut le voir dans la figure 2.1
Deux études utilisant la même méthode d’implantation ectopique pour le mo-dèle CT26 affirment que le modèle est effectivement greffé environ 10 jours après implantation. Cette conclusion repose dans un cas sur une analyse histologique de la densité microvasculaire (SEGUIN et al., 2013), et dans l’autre cas sur le fait que l’étape d’angiogénèse a débuté vers cette date avec analyse d’image IRM pondérée en T2 (JUGÉ et al., 2012).
Installation expérimentale pour l’estimation du volume
L’estimation du volume tumoral se faisait à l’aide de deux images mode B de la tumeur obtenues dans deux plans perpendiculaires, l’une selon un plan transversal et l’autre selon un plan longitudinal de la souris (Figure 2.2). Un échographe clinique Aixplorer (SuperSonic Imagine, Aix en Provence, France) avec la sonde SL15-4 (256 éléments, 0,2 mm pitch, à bande passante de 4 15 MHz et une fréquence centrale de 8 MHz) était utilisé pour réaliser ces images. Une épaisse couche de gel échogra-phique (environ 1 cm) permettait de faire un couplage entre la tumeur à observer et la sonde échographique tout en limitant la pression exercée par la sonde sur la tumeur. La tumeur était manuellement scannée selon chaque plan pour trouver la plus grande section de la tumeur. L’image de cette plus grande section était ensuite sauvegardée puis utilisée pour mesurer la largeur et l’épaisseur de la tumeur sur l’image avec l’outil de mesure intégré dans l’échographe (Figure 2.3).
Estimation du volume tumoral
Le volume tumoral était estimé en faisant l’approximation que la tumeur avait une forme semblable à une ellipsoïde. La formule suivante a été utilisée : V = p6 abc.
où a représente la largeur de la tumeur dans le plan transversal, b la longueur de la tumeur dans le plan longitudinal, et c = c1+2c2 la moyenne des épaisseurs mesurées dans chaque plan (Figure 2.3).
Installation expérimentale pour l’obtention des données immuno- histochimiques
À différents stades de la croissance tumorale, des tumeurs ont été extraites pour analyse immunohistochimique.
Après euthanasie de la souris, la tumeur était extraite et marquée pour conserver son orientation et sa position approximative vis-à-vis du plan d’imagerie ultrasonore. Les tumeurs étaient, après extraction, immédiatement plongées dans un bain de glucose pendant environ 24h. Elles ont été ensuite congelées avec de l’azote liquide dans un cube de composé d’Optimal Cutting Temperature (OCT) et conservées à 80 C. Les tumeurs ont été coupées avec un cryostat (CM3050, Leica) le long du plus grand plan à une épaisseur de 10 mm. Les coupes ont ensuite été préparées avec des marqueurs fluorescents immunohistochimiques pour une estimation de référence des noyaux cellulaires (DAPI), des lymphocytes T (anticorps CD3 – Alexa 647), de l’apoptose (anticorps anti-caspases 3 – TRITC) et de l’endothélium vascu-laire (anticorps isolectine B4 – Alexa 488). Ces coupes quadruplement marquées ont ensuite été scannées avec une résolution de 0,325 0,325 mm (Axio Scan Z1, ZEISS) (Figure 2.4 colonne gauche).
Traitement des données immunohistochimiques et construction des cartes paramétriques
Les bords des tumeurs ainsi que les régions d’artefacts provenant de la prépa-ration ou du scanner ont été manuellement segmentés sur les images. Les coupes, après un seuillage manuel pour chaque marquage, ont été analysées en excluant les régions avec artefacts à l’aide d’un script Matlab que j’ai écrit pour estimer le Nombre de Lymphocytes T par mm2 (NLT) ainsi que le pourcentage d’aire occupé par les mar-queurs des Noyaux (NU), de l’Apoptose (AP) et de l’Endothélium Vasculaire (EV) sur la coupe totale.
Des cartes paramétriques ont été calculées par estimation des paramètres dans des zones de calculs de 512 512 pixels (0,166 0,166 mm) (Figure 2.4 colonne droite). Les dimensions des zones de calculs ont été sélectionnées afin d’avoir une résolu-tion similaire à la résolution des cartes paramétriques ultrasonores (voir chapitre 3, sections 3.1.5, 3.2.3 et 3.3.3). L’écart type représentant la dispersion des valeurs des paramètres sur chaque coupe a pu être calculé à l’aide de ces cartes paramé-triques. Elles nous ont aussi permis de visualiser l’hétérogénéité de la distribution des paramètres entre différentes zones de la tumeur.
Grâce au quadruple marquage, des indices de colocalisations ont pu être calculés, comme par exemple la colocalisation de fort pourcentage d’AP et de EV. Les zones de fort pourcentage d’AP sur les cartes paramétriques sont l’ensemble des pixels pré-sentant un pourcentage d’AP supérieur à 3%. Les zones de forte présence d’EV cor-respondent aux pixels dont la valeur était supérieure à la moyenne (M) plus un écart type (s) de la distribution des valeurs dans la carte (HautEV = fpixel, EV(pixel) > M + sg, soit théoriquement environ 15% des valeurs les plus hautes sur la coupe analysée). Grâce à ces cartes seuillées, le pourcentage surfacique de colocalisation des zones avec de forte valeur d’EV et d’AP (EV \ AP) a été estimé.
Limitations de l’étude des tumeurs par coupes immunohistochimiques
Lors de l’extraction de la tumeur et lors de la coupe du tissu, la structure de la tumeur est déformée par rapport à son état in vivo. L’étape de la coupe est celle qui produit le plus de déformation avec la création de repliements du tissu et de trous dans le tissu. Une grande attention a été portée sur la réduction de ces artefacts lors de la coupe, et à les identifier sur les images finales. Cela reste un élément important à prendre en compte lors de la comparaison avec les autres modalités d’imagerie.
Installation expérimentale pour l’élastographie
L’imagerie élastographique par onde de cisaillement (Shear Wave Elastography (SWE) en anglais) a été réalisée avec le même échographe utilisé pour estimer le vo-lume tumoral (SSI, Aixplorer, sonde SL15-4, voir section 2.2.1). Les données étaient acquises en mode pénétration et temps de persistance moyen. La fenêtre d’observa-tion était choisie pour être centrée sur la tumeur, avec des bords éloignés de la tumeur comme on peut le voir sur la Figure 3.1. La gamme de valeurs pour le module de Young affichée à l’écran de l’échographe était 0 à 50 kPa. Le focus était réalisé au centre de la tumeur. La sonde était maintenue par un bras mécanique pour éviter les mouvements et les variations de pression exercées par la sonde sur la souris causées par l’opérateur. Une épaisse couche de gel échographique (environ 1 cm) permettait de faire un couplage entre la tumeur à observer et la sonde échographique et de limiter la pression exercée par la sonde sur la tumeur.
Six images par tumeur étaient acquises : trois parallèlement au plan transversal et trois parallèlement au plan longitudinal (Figure 2.2). Pour chaque plan, la plus grande section était toujours imagée. Les deux autres images étaient obtenues de part et d’autre de cette image centrale. Pour chaque image, les changements au cours du temps de la carte affichée sur l’échographe étaient observés pendant une quinzaine de secondes. L’opérateur choisissait ensuite l’image à garder comme celle ayant le moins de zones non remplies (voir Figure 3.1 (b)) et étant la plus stable au cours du temps parmi les images sauvegardées temporairement par l’échographe pendant cette quinzaine de secondes.
L’extraction des images se faisait en format DICOM ou en format JPEG. Le format DICOM n’était pas disponible pour certaines expériences en raison d’un changement de version de logiciel de l’échographe.
Comparaison des valeurs des paramètres obtenus dans les trois for- mats considérés
Quarante-huit examens SWE indépendants provenant de 48 souris à différents stades de la croissance tumorale (données issues du protocole introduit dans la sec-tion 4.3) ont été analysés selon les trois formats de données présentés dans la section 3.1.3. Les données provenant directement de l’Aixplorer ont été obtenues comme décrit dans la section 3.1.3. Pour les formats DICOM, et JPEG les tumeurs ont été segmentées sur les images en suivant la délimitation faite sur l’écran de l’Aixplorer. Les zones non remplies ont été exclues des calculs de moyenne et d’écart type pour les deux formats. En effet, ces zones non remplies dans l’image affichée sur l’écran de l’échographe ne sont pas prises en compte dans le calcul de la moyenne et l’écart type pour les données provenant de l’Aixplorer. Pour le format DICOM, les zones non remplies correspondent approximativement aux zones où les valeurs d’élasticité sont égales à 0. Pour le format JPEG, ces zones ont été déterminées comme décrit dans la section 3.1.3. Une étape supplémentaire d’exclusion de zone a été faite pour le format JPEG, ceci dans le but ne pas avoir de valeurs erronées provenant des traits de délimitation de la tumeur sur les images JPEG (comme expliqué dans la section 3.1.3). La moyenne et l’écart type ont été ensuite estimés dans chacune des régions d’intérêts manuellement délimitées. Dans ce jeu de données, seulement 3 souris ont présenté des pixels saturés dans la zone de la tumeur (au-dessus de 50 kPa). Le pour-centage de pixels saturés dans la zone était de 14%, 5% et 3%. Les aires des tumeurs délimitées étaient comprises entre 2,9 mm2 et 125,6 mm2 avec une médiane à 55 mm2.
Résolution des données et cartes paramétriques
Selon le Guide d’utilisateur de l’Aixplorer 2, la résolution spatiale axiale et latérale avec la sonde SL15-4 est de 2 mm 3. Pour cette sonde, la profondeur de pénétration (ou intervalle de mesure) est entre 2,5 mm et 30 mm 4, sachant que «La pénétration maximale en SWE est définie comme la profondeur la plus élevée à laquelle l’image SWE présente de bonnes informations couleur et un minimum de bruit». Toutes ces informations proviennent de mesures faites par SuperSonic Imagine.
Les cartes paramétriques obtenues à l’aide du programme Matlab fourni par SuperSonic Imagine (Section 3.1.3) ont une taille de pixel comprise entre 0,2 mm et 0,22 mm en axial et latéral. Les images JPEG et DICOM avaient quant à elles une taille de pixel < 0,072 mm en latéral et axial.
Variabilité des mesures élastographiques
Une première source de variabilité des mesures provient du choix de l’écho-graphe. Dans deux études issues du programme Quantitative Imaging Biomarker Alliance (QIBA) de la Radiological Society of North America (RSNA), il a été montré que des variabilités intra et inter modèle d’échographe 5, 6 existent pour l’estimation de la vitesse de propagation des ondes de cisaillement. Cette dernière étant utilisée pour estimer le module de Young représentant la rigidité du milieu sondé, la varia-bilité dans son estimation va avoir un impact sur les cartes d’élasticité estimées. La première de ces études repose sur l’analyse de fantômes élastiques aux mêmes pro-priétés élastiques (sans viscosité dans ce cas) répartis sur différents sites (HALL et al., 2013), et la deuxième sur l’analyse des données de trois uniques fantômes avec des propriétés visco-élastiques différentes partagés entre les différents sites (PALMERI et al., 2015). Ces deux études montrent une variabilité d’estimation qui dépend de la profondeur à laquelle la mesure est faite, mais pas de la rigidité des fantômes. Dans (PALMERI et al., 2015), les écarts interquartiles exprimés en pourcentage de la mé-diane à une profondeur de 3 cm en combinant toutes les données de l’étude (mélange des données des échographes de tous les sites) se trouvaient entre 9,6% et 12,4% pour les trois fantômes. Nos mesures ont toutes été effectuées avec un seul échographe et sur une profondeur quasi constante entre les mesures. Ainsi, les variabilités décrites dans les études QIBA peuvent être considérées comme négligeables.
Plusieurs sources de variabilité expérimentale ont été identifiées au cours des expériences réalisées dans le cadre de ma thèse.
Une première source de variabilité des mesures provient des mouvements de la sou-ris dus à la respiration lors de l’examen SWE. En effet, pendant une acquisition SWE, le plan d’imagerie peut bouger, ce qui induit une variabilité de la carte paramétrique au cours du temps. Afin de minimiser cette source de variabilité, l’opérateur choi-sissait une image parmi une séquence de cartographies élastographiques acquises. L’image choisie dans la séquence devait être en dehors des phases de mouvement d’inspiration et d’expiration, avec le moins de zones non remplies possible et qui devait se répéter dans une période comprise entre 10 et 30 s.
Pour éviter toute pression de la sonde sur la tumeur par l’opérateur, ce qui modifie artificiellement l’élasticité estimée dans la tumeur (D’ONOFRIO, GALLOTTI et MU-CELLI, 2010), la sonde était tenue par un bras mécanique et une épaisse couche de gel était intercalée entre la sonde et la tumeur imagée.
Traitement des données radiofréquences et construction des cartes paramétriques
Les signaux étant récupérés en format IQ, il a premièrement fallu reconstruire le signal RF. Les signaux reconstruits avaient une fréquence d’échantillonnage de f S = 4 f = 4 11,25 MHz = 45 MHz. La taille des pixels sur les images construites avec les données RF sont de 0,2 mm en latéral et de c = 1540 = 17 mm en axial.
La deuxième étape consistait à estimer la courbe des valeurs de BSC à partir des signaux RF. Pour ce faire, il faut d’abord calculer la Densité Spectrale de Puissance (DSP) moyenne du milieu étudié (DSPm) et celle du fantôme de référence (DSPre f ) à partir de leurs données RF respectives. Il faut ensuite rectifier les DSP en fonction des
coefficients d’atténuation pour chacun des milieux (Am (DSPm) et Are f DSPre f , où Am et Are f représentent respectivement les fonctions de correction de l’atténuation pour le milieu étudié et pour le fantôme de référence). Enfin la courbe des valeurs de BSC dans le milieu est calculée avec la formule suivante : BSCm = Are f DSPre f BSCre f Am (DSPm) (3.4).
où BSCre f correspond au BSC mesuré avec le fantôme de référence présenté dans la section 3.2.2 et sur la Figure 3.3. Cette méthode d’estimation des valeurs de BSC permet de s’affranchir de la fonction de transfert de la sonde, celle-ci étant présente dans DSPm et DSPre f , et n’avoir que la réponse du milieu sondé (LIZZI et al., 1983).
La courbe des valeurs de BSC du milieu imagé obtenue était ensuite approchée par la formule du modèle Gaussien sphérique présenté dans la section 3.2.1. La mé-thode d’optimisation utilisée pour les estimer est celle décrite dans (INSANA et al., 1990) et (INSANA et HALL, 1990), où l’on cherche le minimum de l’erreur quadra-tique moyenne entre la courbe théorique s et la courbe expérimentale BSCm sur un ensemble de valeurs d’ESD prédéterminé.
La bande de fréquence dans laquelle les valeurs de BSC ont été estimées pour nos expériences a été choisie comme étant la fenêtre de fréquence à 6 dB de la fréquence maximale de la DSP issue des données in vivo. En moyenne la bande de fréquence était comprise entre 7 MHz et 10,5 MHz avec un maximum à 8,5 MHz.
La gamme d’ESD étudiée est fixée par la bande de fréquence utilisable. En effet, d’après (INSANA et HALL, 1990), pour avoir une estimation fiable des paramètres de rétrodiffusion, il faut que 0,5 kae f f 1,2 (avec k = et ae f f = ESD2 ). La limite basse kae f f 0,5 correspond au phénomène de diffusion de Rayleigh, c’est-à-dire quand les diffuseurs sont très petits devant la longueur d’onde. En régime de dif-fusion de Rayleigh, l’intensité rétrodiffusée est proportionnelle au carré du volume du diffuseur et varie comme la puissance quatrième de la fréquence des ultrasons (s µ VS2 f 4) ; un comportement qui ne dépend pas de la forme du diffuseur ren-dant l’estimation impossible. De plus, dans ce régime, le signal rétrodiffusé par les = 10 8,5.1015406 2 p f /c diffuseurs est trop faible comparé au bruit, et un bruit dans l’estimation spectrale plus grand et peut mener à des erreurs d’estimation (INSANA et HALL, 1990). En-suite, le modèle choisi et la méthode d’optimisation ont leur importance. En effet, la méthode d’optimisation utilisée cherche d’abord à estimer l’ESD (notée a) par comparaison de la forme de la courbe des valeurs de BSC mesurées à celle défi-nie dans le modèle Gaussien par le facteur de forme FF (Form Factor en anglais) FF(kae f f ) = e 0.827(kae f f )2 . Or pour le modèle Gaussien, FF varie faiblement en fonc-tion de kae f f lorsque kae f f tend vers 0 (dérivée proche de 0). Ainsi, il y a une plus grande imprécision dans l’estimation des paramètres quand ka est faible (INSANA et al., 1990 ; MAMOU et al., 2005). Donc, le régime de diffusion de Rayleigh ainsi que le bruit dans l’estimation spectrale associé à la faible variation de FF en fonction de la taille font que l’estimation est moins fiable dans le cas des faibles valeurs de kae f f . La limite haute du kae f f est elle aussi définie par deux facteurs. D’une part, pour les fortes valeurs de kae f f , la taille des diffuseurs ne domine plus l’aspect de la réponse spectrale du milieu insonifié. La réponse fréquentielle du milieu dépend plus de la forme et des propriétés élastiques des diffuseurs (INSANA et al., 1990 ; OELZE, ZA-CHARY et O’BRIEN JR, 2002). D’autre part, pour les hautes valeurs de kae f f , le facteur de forme FF varie plus lentement en fonction de la taille diffuseur. En outre, les va-leurs de FF sont faibles et sont donc sensibles au bruit (INSANA et al., 1990 ; MAMOU et al., 2005). Contrairement à la limite haute de kae f f 1,2 définie par Insana et Hall (INSANA et HALL, 1990), Mamou et al. (MAMOU et al., 2005), dans le cas du modèle Gaussien, fixent l’inégalité haute suivante comme cadre de travail : kae f f 2. Le changement de limite haute est justifié par le fait que le modèle Gaussien varie plus doucement que les autres modèles et donc possède de plus fortes valeurs de FF pour kae f f 1,2 comparé aux autres. Donc la limite peut être repoussée à kae f f 2. J’ai choisi l’inégalité suivante pour mes analyses : 0,5 kae f f 2. Les limites des valeurs d’ESD estimables sont donc p0,5f/c ESD . Si l’on prend en compte la bande de fréquence utilisée ceci nous donne pour 7 MHz : 34 mm ESD7 MHz 140 mm ; et pour 10,5 MHz : 23 mm ESD10,5 MHz 93 mm, en considérant que la vitesse de pro-pagation dans le tissu est égale à 1540 m/s. J’ai choisi dans la suite de ne considérer que les ESD vérifiant 23 mm ESD 140 mm.
Les cartes paramétriques ont été construites en estimant les paramètres d’ESD et d’EAC dans des fenêtres de calculs définies dans la tumeur. Selon (TOPP, ZACHARY et O’BRIEN JR, 2001), la taille de ces fenêtres dans la direction axiale doit être supérieure à 10 fois la longueur d’onde de la fréquence centrale utilisée pour diminuer l’effet d’une répartition particulière des diffuseurs. Cette répartition particulière peut en effet influencer la DSP estimée. Ici, elles doivent donc être supérieures à 10 lC = 10 c = 1,8 mm. Nous avons choisi 2 mm pour la taille axiale des fC fenêtres. Nous avons choisi la même taille de fenêtre en latéral, ce qui correspond 38 Chapitre 3. Techniques ultrasonores émergentes pour le suivi tumoral à environ 5 fois la résolution latérale du faisceau ultrasonore émis 7 équivalent au choix fait dans (OELZE et al., 2004).
Les fenêtres de calculs avaient donc une taille de 2 2 mm pour les données provenant des tumeurs (Figure 3.4 (a)). Les fenêtres pour les données provenant du fantôme avaient la même longueur en axial que les fenêtres des données analysées, mais une largeur plus grande en latérale. Ceci a été fait dans l’objectif de réduire l’effet de la répartition spatiale des diffuseurs dans le fantôme, comme décrit ci-dessus, et ainsi avoir une DSP de référence plus robuste. Ceci implique néanmoins que l’on fait l’hypothèse que les effets de la sonde sont identiques à profondeur égale. La taille des fenêtres pour le fantôme en latérale étaient définies comme 90% de la largeur de la sonde (ici 256 0,2 mm 0,9 = 46,08 mm), en écartant symétriquement les bords de la sonde pour éviter les effets de bord (Figure 3.4 (b)).
Dans chaque fenêtre, la DSP de chaque ligne RF était estimée avec 512 points dans la bande de fréquence choisie en appliquant préalablement une fenêtre de Hanning sur les données temporelles, puis les DSP étaient moyennées pour obtenir la DSP moyenne dans la fenêtre (Figure 3.4 (a) et (b)). Le rapport des DSP de l’équation (3.4) était fait entre la DSP d’une fenêtre des données et la DSP de la fenêtre du fantôme de référence à la même profondeur (Figure 3.4 (c)). Les tumeurs étaient manuellement délimitées à partir des données RF recons-truites. L’interface entre le gel échographique et la tumeur était elle aussi délimitée manuellement permettant de prendre en compte la différence d’atténuation entre les deux milieux. Les coefficients d’atténuation ont été fixés à 0,4 dB.cm 1.MHz 1 pour le tissu (OELZE et al., 2004) et pour le gel à 1,8.10 3 dB.cm 1.MHz 2 (FISHER et SIMMONS, 1977). Les fenêtres de calculs étaient ensuite réparties sur la zone de la tumeur avec un chevauchement de 75% en latéral et axial. Les cartes paramétriques étaient ensuite construites en moyennant pour chaque pixel les valeurs des fenêtres le chevauchant (Figure 3.4 (d) et (e)). En raison de la superposition de 75% de fe-nêtres de 2 2 mm, la résolution des cartes était de 0,5 0,5 mm. Pour chaque image, la moyenne et l’écart type des paramètres ESD et EAC étaient calculés à partir des valeurs de l’ensemble des fenêtres de calculs. Si une tumeur était trop petite pour qu’une fenêtre de calcul puisse y être définie, la donnée correspondant à l’examen était traitée comme manquante.
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Table des matières
1 Introduction
1.1 Épidémiologie et évaluation thérapeutique du cancer
1.2 Hétérogénéité intratumorale
1.3 Techniques d’imagerie non invasive complémentaires au critère Response
Evaluation Criteria in Solid Tumours (RECIST)
1.3.1 Suivi thérapeutique par l’imagerie hors critère morphologique 2
1.3.2 Étude de l’hétérogénéité intratumorale par l’imagerie
1.3.3 Analyse multiparamétrique
1.4 Modélisation de la croissance tumorale
1.5 Organisation du manuscrit
2 Modèles tumoraux et techniques de référence pour le suivi tumoral
2.1 Modèles tumoraux et thérapies
2.1.1 Culture cellulaire et implantation tumorale
2.1.2 Thérapie
Pazopanib
Sunitinib
Cytotoxique
Placebo
2.2 Estimation conventionnelle du volume tumoral par ultrasons
2.2.1 Installation expérimentale pour l’estimation du volume
2.2.2 Estimation du volume tumoral
2.2.3 Résolution et discussion sur la précision de l’estimation du volume
2.3 Immunohistochimie
2.3.1 Installation expérimentale pour l’obtention des données immunohistochimiques
2.3.2 Traitement des données immunohistochimiques et construction des cartes paramétriques
2.3.3 Limitations de l’étude des tumeurs par coupes immunohistochimiques
2.4 Résumé
3 Techniques ultrasonores émergentes pour le suivi tumoral
3.1 Élastographie par ondes de cisaillement
3.1.1 Principe de l’élastographie
3.1.2 Installation expérimentale pour l’élastographie
3.1.3 Traitement des données élastographiques
Données sur l’Aixplorer
DICOM
JPEG
3.1.4 Comparaison des valeurs des paramètres obtenus dans les trois formats considérés
3.1.5 Résolution des données et cartes paramétriques
3.1.6 Variabilité des mesures élastographiques
3.2 Ultrasons quantitatifs par analyse fréquentielle
3.2.1 Principe de base des ultrasons quantitatifs
3.2.2 Installation expérimentale pour acquisition des signaux radiofréquence
3.2.3 Traitement des données radiofréquences et construction des cartes paramétriques
3.2.4 Variabilité des mesures
3.3 Échographie de contraste
3.3.1 Principe de base de l’échographie de contraste
3.3.2 Installation expérimentale pour l’échographie de contraste
3.3.3 Traitement des données d’imagerie de contraste et construction des cartes paramétriques
3.3.4 Variabilité des mesures de l’imagerie de contraste
3.4 Recalage des données acquises avec les différentes modalités
3.5 Résumé
4 Protocoles expérimentaux – Bases de données
4.1 Suivi de l’évolution tumorale de tumeurs Lewis Lung Carcinoma
(LLC) avec thérapie antiangiogénique et cytotoxique
4.2 Suivi de l’évolution tumorale de tumeurs CT26 avec thérapie antiangiogénique
4.3 Prélèvement histologique de tumeurs CT26 au cours de l’évolution tumorale sans thérapie
5 Évolution des paramètres ultrasonores et immunohistochimiques lors de la croissance tumorale
5.1 Évolution au cours du temps
5.1.1 Évolution temporelle des techniques de référence
Évolution du volume tumoral
Évolution des paramètres immunohistochimiques
5.1.2 Évolution temporelle des techniques émergentes ultrasonores
Évolution des paramètres ShearWave Elastography (SWE)
Évolution des paramètres radiofréquences
Évolution des paramètres Dynamic Contrast Enhanced Ultrasound (CEUS)
5.1.3 Discussion
5.2 Corrélation entre les paramètres
5.2.1 Corrélation entre les techniques de référence
5.2.2 Corrélations entre les techniques de référence et les techniques émergentes ultrasonores
Corrélations entre le volume tumoral et les paramètres d’imagerie ultrasonore
Corrélations entre les paramètres immunohistochimiques et les paramètres d’imagerie ultrasonores
5.2.3 Corrélations entre les paramètres d’imagerie ultrasonore
Corrélations entre les paramètres fonctionnels
Corrélations entre les paramètres structurels
Corrélations entre les paramètres fonctionnels et structurels
5.2.4 Discussion
5.3 Conclusion
6 Analyse multiparamétrique de l’hétérogénéité tumorale
6.1 Sélection et recalage des données exploitables
6.2 Analyse multiparamétrique à l’échelle des zones perfusées et nonperfusées
6.2.1 Définition des zones et calcul des paramètres
6.2.2 Étude des différences entre les zones perfusées et les zones non-perfusées
Différence de valeur des paramètres
Différence de la variabilité au sein des zones
6.2.3 Corrélation entre les paramètres d’imagerie dans les zones perfusées
6.3 Analyse multiparamétrique à l’échelle des superpixels
6.3.1 Définition des superpixels et calcul des paramètres
Paramètre de référence pour la définition des superpixels
Description de la méthode Simple Linear Iterative Clustering (SLIC)
Estimation des paramètres dans les superpixels
6.3.2 Variabilité au sein des superpixels
6.3.3 Corrélation entre les paramètres d’imagerie à l’échelle des superpixels
6.4 Discussion
7 Modélisation de la croissance tumorale
7.1 Modèles mathématiques de croissance et Taux de Croissance Relatif
7.1.1 Modèles mathématiques de croissance
Modèle Exponentiel-Linéaire
Modèle Gompertz
Modèle Capacité de Support Dynamique
Prise en compte du volume initial
Critère d’information d’Akaike
7.1.2 Taux de Croissance Relatif
7.2 Résultats
7.2.1 Effet du volume initial dans la modélisation
7.2.2 Évolution du Taux de Croissance Relatif
7.2.3 Lien entre les paramètres CEUS et le Taux de Croissance Relatif
7.3 Discussion
8 Conclusion
Production scientifique
Bibliographie
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