Soutenance mémoire
Le microbiote intestinal chez la volaille
Selon la définition d’Isolauri et ses collaborateurs, le microbiote intestinal normal est un consortium complexe et en équilibre de microorganismes qui habitent normalement le tractus gastro-intestinal et qui remplissent un rôle dans la nutrition, la physiologie et le fonctionnement du système immunitaire de l’hôte (Isolauri, Sutas et al. 2001). La composition de ce microbiote intestinal est en équilibre relativement stable dans le tube digestif. Cet équilibre peut être rompu avec l’âge, les conditions d’hygiène, le stress ou à la suite d’une agression extérieure comme lors de l’utilisation d’antibiotiques, de facteurs de croissance (Gabriel, Mallet et al. 2003). Ainsi, on note des populations microbiennes plus élevées chez des animaux élevés au sol sur litière propre ou litière contaminée par une bande précédente par rapport à des animaux élevés en cage individuelle (Gabriel, Mallet et al. 2003). Selon les conditions d’élevage, l’augmentation de la densité d’élevage ou les stress thermiques semblent globalement augmenter les bactéries néfastes au détriment des bactéries bénéfiques (Gabriel,Mallet et al. 2005). Outre ces conditions, la présence de parasites intestinaux comme les coccidies, peut entraîner la dégradation de la muqueuse intestinale et la production de nouveaux substrats pour la microflore, modifiant ainsi sa composition (Kimura, Shiosaka et al. 1976). La flore est modifiée aussi par l’alimentation. Ainsi, le type de céréales en particulier la présence de polysaccharides non amylacés hydrosolubles (Mathlouthi, Mallet et al. 2002) ou leur mode de présentation (Gabriel, Mallet et al. 2003) entraînent des changements de la flore. De même, les matières grasses, ou le type d’amidon peuvent avoir un effet sur la composition du microbiote (Weurding, Enting et al. 2003).
Description du tube digestif chez la volaille
Le tractus gastro-intestinal présente quelques particularités anatomiques (Figure 1). On distingue différents compartiments ; la cavité buccale ne comprend ni lèvres ni dents, mais un bec corné qui permet la préhension et une certaine fragmentation des aliments. Les glandes salivaires sont peu développées. Il n’y a ni voile de palais, ni épiglotte, si bien que la déglutition est un phénomène uniquement mécanique par redressement de la tête. Dans la bouche, les aliments sont peu fragmentés et grossièrement insalivés (M. Larbier and Leclercq1992). L’œsophage contient un renflement dont l’épithélium est riche en glandes à mucus : le jabot. Cet organe de pH variant entre 4,47 et 4,54 (Farner 1942) peut entreposer des aliments qui s’y humectent et s’y ramollissent, il fonctionne chez le poulet alimenté à volonté. Il est le lieu d’une digestion microbienne et comporte essentiellement des Lactobacilles, d’une partie de l’amidon (hydrolyse avec formation d’acides lactique) et de formation d’acide gras volatiles (M. Larbier and Leclercq 1992). Le proventricule est riche en glandes sécrétoires (acide chlorhydrique et pepsinogène précurseur de la pepsine) et permettant la digestion chimique : c’est l’estomac chimique. La protéolyse y débute à pH de 3 à 4,5. Dans le gésier et le proventricule, le faible pH fait chuter la population bactérienne (Farner 1942). Le gésier, estomac mécanique est caractérisé par une couche superficielle très dure entourée de muscles puissants. Il y règne un pH très bas (2 à 3,5) et il peut contenir de petits graviers qui sont nécessaires aux animaux consommant des grains intacts. C’est donc au niveau du gésier que se produit véritablement la protéolyse sous l’action de la pepsine (Gabriel, Mallet et al. 2005). Dans l’intestin, l’environnement devient plus favorable à la croissance bactérienne en raison de la plus faible pression d’oxygène et de la faible concentration en enzyme et en sels biliaires et d’un pH variant dans le duodénum entre 5,68 et 6,07, dans le jéjunum entre 5,72 et 6, dans le caecum entre 5,6 et 5,83, l’iléon entre 6,18 et 6,50 et dans le colon entre 6,08 et 6,58 (Farner 1942). À la naissance les poussins sont axéniques. Le microbiote spécifique commence à se développer dès les deux premiers jours pour donner lieu à une flore microbienne environnementale spécifique après trois à six semaines (Methner, Barrow et al. 1997). En effet, après l’éclosion, la flore augmente rapidement. Ainsi dès le premier jour, l’iléon et le caeum hébergent 108 et 1010 bactéries par gramme de contenu digestif. Leur nombre atteint 109 et 1011 bactéries par gramme en 3 jours et reste relativement stable jusqu’à l’âge de 30 jours (Gabriel, Mallet et al. 2005). La flore est composée essentiellement de bactéries à Gram positif anaérobies facultatives du jabot à l’iléon terminal, alors que le caecum contient en plus des anaérobies stricts, ces dernières étant dominantes (Gabriel, Mallet et al. 2005).
Maladies entériques chez la volaille
Les volailles sont prédisposées à de nombreuses infections parasitaires, bactériennes,mycoplasmiques et virales en particulier celles des systèmes respiratoire et gastro-intestinal. Les maladies entériques à forte prévalence comme la cryptosporidiose ou la paratuberculose, conduisent à des pertes économiques élevées dans les élevages. De nombreuses espèces de Salmonella peuvent attaquer les oiseaux adultes et causer des taux élevés de mortalité et de morbidité. Une autre problématique liée à la présence de ces pathogènes dans le tube digestif est la contamination des denrées alimentaires provenant de la volaille. Les infections par le Welchia sont responsables de l’entérite nécrosante. Les infections infracliniques résultent dans des performances altérées et des lésions du foie. La maladie clinique aiguë entraîne une mortalité accrue (Chafai 2006). Le traitement de choix suppose l’utilisation d’antibiotiques, mais ne prévient pas la récurrence de la maladie après arrêt de la médication. Les mesures de contrôle consistent en une pratique d’hygiène adéquate dans la chaîne de production et au niveau du consommateur.
Escherichia coli :Les Escherichia coli aviaires, bien que considérés par beaucoup comme pathogènes secondaires, représentent à l’heure actuelle l’une des plus importantes causes de pertes économiques dans le secteur avicole. Les Escherichia coli sont des hôtes commensaux du tractus digestif de la volaille et la plupart des souches ne sont pas pathogènes. Cependant, un certain nombre de celles-ci appelées « Avian Pathogenic E. coli » ou APEC et appartenant à des sérotypes bien particuliers sont associées au syndrome de la colibacillose (Stordeur and Mainil 2002). La voie d’entrée principale de l’agent pathogène est le tractus respiratoire, via l’inhalation de particules de poussières contaminées par les E. coli excrétées du tractus digestif d’animaux sains. Les intestins sont, en effet, le réservoir le plus important des E. coli pathogènes aviaires ou APEC. Après une première multiplication au niveau du tractus respiratoire supérieur, les bactéries colonisent les voies respiratoires profondes à savoir les sacs aériens et les poumons. Dans une troisième étape, la bactérie atteint le sang et colonise les organes internes comme le coeur, le foie et la rate (Jordan and Pattison 1996). Les colibacilloses sont sans doute les infections bactériennes les plus fréquentes et les plus importantes en pathologie aviaire. Elles peuvent entrainer de la mortalité, des baisses de performances et des saisies à l’abattoir (Stordeur and Mainil 2002). Contrairement aux infections des mammifères, les colibacilloses aviaires prennent des formes générales, avec une voie d’entrée respiratoire ou génitale (Stordeur and Mainil 2002). L’agent étiologique de la colibacillose est la bactérie Escherichia coli.
Salmonella Plus de 60 % des toxi-infections dans le monde sont dues à Salmonella. Les salmonelloses sont de ce fait, devenues un phénomène de santé publique ce qui justifie l’implication de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) dans la lutte contre les salmonelloses (Salm-Surv 2005). Les salmonelles appartiennent à la famille des entérobactéries, ce sont des bacilles mobiles à Gram négatif, aéro-anaérobies facultatifs, mésophiles qui se cultivent facilement. À nos jours plus de 2300 serotypes différents de salmonelles sont identifiés, sur le plan épidémiologique et sont classées en fonction de leur potentiel pathogène pour l’homme ou l’animal. La virulence des salmonelles est une notion complexe, résultant de nombreux facteurs encore largement étudiés, tant au niveau biochimique que génétique. Les principaux facteurs de virulence sont la mobilité (reposant sur les flagelles), l’adhésion par les pili et les fimbriae (phénomène actif de reconnaissance spécifique entre une adhésine bactérienne et un ligand présent à la surface d’une cellule hôte), l’invasion (par endocytose pour les entérocytes, par phagocytose pour les macrophages), la formation de phagosomes spacieux et la fusion avec les lysosomes (Feuillet 2007). Actuellement plus de 200 sérotypes de salmonelles sont connus chez la volaille. Salmonella enteritidis qui infecte les organes profonds (foie, rate, ovaire) est à l’origine d’infection durable au niveau des troupeaux alors que Salmonella typhimurium est actuellement le sérotype le plus incriminé dans les salmonelloses aviaires provoquant les formes cliniques les plus graves, surtout chez les jeunes poussins prenant une allure septicémique, avec une mortalité brutale dans les jours qui suivent l’éclosion. On observe également de nombreuses mortalités en coquille. La première étape de colonisation par les salmonelles est une étape de colonisation intestinale. La bactérie arrive dans l’intestin grêle, où elle se multiplie en adhérant à l’épithélium, elle pénètre par un phénomène d’endocytose dans les cellules épithéliales iléales et caecales, notamment les tissus lymphoïdes incluant les plaques de Peyer, les amygdales caecales et dans les cellules M. Dans le cas des salmonelles provoquant des maladies systémiques, le site d’attachement préférentiel se situe au niveau des plaques de Peyer (Feuillet 2007). L’infection est strictement limitée à la sphère digestive et peut correspondre à un portage latent avec élimination épisodique des Salmonelles dans les fèces.
Histoire d’utilisation des probiotiques en alimentation animale
Les probiotiques ont été commercialisés et utilisés dans les fermes à partir des années 1960.Leur utilisation a été encouragée (1) par le Comité Swann en 1969 qui recommandait de restreindre l’usage des antibiotiques en alimentation animale à la seule fin thérapeutique (leur utilisation « facteurs de croissance » étant associée à l’augmentation des résistances bactérienne) ; (2) par la nécessité de faire face aux conséquences d’une production animale toujours plus intense et stressante pour les animaux (économie d’échelle, augmentation de la taille des élevages, concentration des animaux, sevrage précoce, …). Entre les années 1970 et 1990, les micro-organismes probiotiques revendiquaient des propriétés zootechniques, amélioration du gain de poids, du coefficient de digestibilité, et également des effets sanitaires (diminution des diarrhées, de la morbidité, …). Mais cette période est aussi marquée par l’absence de cadre réglementaire contribuant à réduire la confiance des utilisateurs et dès le début des années 1990, on observe un déclin de l’utilisation des probiotiques sur le marché européen. Cette première vague d’utilisation des probiotiques en alimentation animale jusqu’en 1993 a été définie par Bernardeau et Vernoux (2009) comme « la première génération de probiotiques », caractérisée par une efficacité supposée et un cadre réglementaire peu adapté. L’absence d’efficacité (Simon et al., 2001), de compréhension du mécanisme d’action et le manque de données scientifiques ont amené les professionnels de la production animale (vétérinaires, nutritionnistes, éleveurs) à considérer le concept probiotique avec grand scepticisme (Bernardeau et Vernoux, 2009). C’est le formidable essor de l’utilisation des probiotiques en alimentation humaine et les avancées scientifiques en matière d’écologie digestive et d’interactions microbiennes (Caramia, 2004) qui vont relancer l’utilisation des micro-organismes en alimentation animale. Stimulées également par la nécessité de palier à l’interdiction des antibiotiques facteurs de croissance décrétée en 2006 en Europe, les études scientifiques sur les probiotiques sont mieux établies, réalisées en double aveugle, contrôlées, plus fiables et la directive Européenne de 1993 remet les micro-organismes probiotiques à l’honneur en les incluant dans la réglementation des additifs pour l’alimentation animale. Parallèlement, les productions animales connaissent entre 1980 et 2000, une série de crises qui va remodeler complètement le paysage réglementaire, aussi bien au niveau institutionnel (création de l’AFSSA – Agence Française de Santé et Sécurité Alimentaire en France 1998 et l’EFSA – European Food Safety Agency au niveau européen en 2002) que législatif (refonte complète de la réglementation de l’utilisation des additifs en alimentation animale – Dir. 70/524/EC et clarification de l’utilisation des micro-organismes comme additifs Reg. 1831/2003/EC). Cette nouvelle réglementation très rigoureuse exige de la part des industriels des données scientifiques et technologiques incluant la démonstration de l’innocuité des micro-organismes (pour l’animal, le travailleur, le consommateur et l’environnement) et la preuve de leur efficacité en accord avec les revendications zootechniques et/ou digestives (Mantovani et al., 2006). Les trois volets du dossier d’enregistrement européen appliqués aux probiotiques sont (1) identité et qualité: caractéristiques de la souche (taxonomie, métabolisme, propriétés, …), processus de fabrication, stabilité du probiotique (seul ou en mélange), méthode d’analyse ; (2) sécurité : pour l’espèce cible (innocuité à 10 fois la dose recommandée), pour le manipulateur, le consommateur (absence d’antibiorésistance, génotoxicité et mutagénicité) et pour l’environnement ; (3) efficacité : à démontrer pour l’espèce cible par un minimum de trois études significatives dans deux lieux différents. Le volet efficacité décrit l’espèce cible, les conditions (âge, stade physiologique, type de production), les doses d’utilisation, les performances revendiquées ainsi que les mécanismes d’action possibles. Les allégations possibles pour des probiotiques peuvent concerner des effets sur la performance animale, la production animale, le bien-être animal ou l’environnement.
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Table des matières
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Résumé
Abstract
ملخص
Introduction générale
Synthèse bibliographique
Chapitre 1 : Généralités
1. Le microbiote intestinal chez la volaille
3. Description de la flore digestive du poulet et localisation dans le tractus
2. Description du tube digestif chez la volaille
4. Les pathogènes entériques de la volaille digestif
4.1. Maladies entériques chez la volaille
4.1.1. Escherichia coli
4.1.2. Salmonella
5. Contrôle des infections entériques chez la volaille
Chapitre 2 : les probiotiques en aviculture
1. histoire d’utilisation des probiotiques en alimentation animale
2. Définition des probiotiques
3. Les micro-organismes probiotiques autorisés aujourd’hui en alimentation avicole
4. Critères de sélection des probiotiques
5. Les différents microorganismes probiotiques en aviculture et leurs caractéristiques
5.1. Le genre Lactobacillus
5.2. Le genre Streptococcus
5.3. Le genre Enterococcus
5.4. Les genres Leuconostoc, Oenococcus et Weissella
5.5. Les genres Pediococcus
5.6. Le genre Bifidobacterium
5.7. Les levures
6. Production de substances antimicrobiennes
7. Efficacités des probiotique en aviculture
7.1 Efficacité sanitaire des probiotiques
7.2 Efficacité zootechnique des probiotiques
Chapitre 3 : les prébiotiques
1. Définition Prébiotiques
2. Différentes classes des prébiotiques
2.1. Les hexoses
2.2. Les disaccharides naturels
2.3. Les oligosaccharides
3. Mode d’action des prébiotiques
4. Caractérisation des exopolysaccharides (prébiotique)
4.1 Classification des EPS des bactéries lactiques
4.2 Production et détection des EPS
4.2.1 Détection de polysaccharides exo-cellulaires
4.2.2 Examen visuel
4.2.3 Les colorations
4.3 Extraction et purification
4.4 Dosage colorimétrique des EPS purifiés
4.5 Caractérisation des EPS à l’échelle chromatographique
5. Effet des prébiotiques en aviculture
Chapitre 4 : Approche moléculaire
1. l’ADNr 16S comme sémantide bactérienne
2. Les méthodes d’identification
2.1. Identification des bactéries par l’ADNr-16S
2.2. Identification bactérienne avec amorces oligonucléotidiques (Amplification génique)
3. Amplification par PCR
4. Séquençage de l’ADN
5. Taxonomie des bactéries lactiques
Matériels et méthodes
1.Échantillonnage
2. Isolement et purification des souches
3. Conservation des souches
4. Souche de référence utilisé
5. Caractérisation phénotypique
5.1. Examen macroscopique
5.2. Examen microscopique
5.3. Test de la catalase
6. recherche des bactéries mucoides
6.1. Production et caractérisation des exopolysaccharides (EPS)
6.1.1. formation des exopolysaccharides
6.1.2. Mise en évidence des EPS Mise en évidence des EPS en milieu solide au rouge de ruthénium
6.1. 3 Mise en évidence des EPS par microscopie
6.1.4. Extraction des EPS
6.1.5 Lyophilisation des EPS
6.1.6 Dosage colorimétrique des EPS
6.1 .7. Activité rhéologique
6.2. Analyse de la composition des EPS
6.2.1 L’hydrolyse des EPS
6.2.2 Chromatographie sur couche mince des oses constitutifs des polysaccharides
7. Etude de l’activité antimicrobienne des souches probiotiques isolées du tractus digestif vis-àvis de souches pathogènes
7.1. Nature de la substance inhibitrice
8. Caractérisation moléculaire des probiotiques
8.1. Extraction d’ADN
8.1.1. Extraction d’ADN par utilisation de MOBIO KIT
8.1.2. Extraction d’ADNr 16S dans sa totalité (1500pb)
8.1.3. Vérification qualitatif de l’ADN extrait
8.2. Amplification
8.2.1. Amplification de la région interne de l’ADNr 16S (480 pb) du genre Lactobacillus sp
8.2.2. Séquençage et taxonomie des souches lactobacilles de la flore intestinale
8.2.3. Amplification du gène ADNr 16S (1500 pb) dans sa totalité
8.3. Electrophorèse sur gel d’agarose
Résultats et discussion
1. Caractérisation phénotypique
2. Mise en évidence et caractérisation des EPS
2.1. Production des exopolysaccharides sur milieux solide
2.2. Production des EPS en milieux liquide
2.3. Mise en évidence des colonies mucoïdes blanchâtres en présence de colorant rouge de ruthénium sur milieu solide
2.4. Mise en évidence des EPS par microscopie
2.5 Extraction des EPS
2.6. Lyophilisation des EPS
2.7. Propriétés rhéologiques des EPS
2.8. Dosage colorimétrique
2.9. Chromatographie sur couche mince des oses constitutifs des différents polysaccharides
3. Etude de l’activité antimicrobienne des souches probiotique de la collection LGM
4. Caractérisation moléculaire des souches probiotiques
4.1. Identification du genre Lactobacillus spp. par amplification d’une région interne du gène ADNr 16S
4.2 Séquençage et taxonomie des souches de la flore intestinale
4.3. Amplification du gène de l’ADNr 16S à base de PCR de quelques isolats
Conclusion et perspective
Références bibliographiques
Annexes
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