Soutenance mémoire
Test de toxicité générale Brine Shrimp
a- Principe : Ce test consiste à mettre en contact avec des larves d’Artemia salina (Crustaceae) l’extrait à tester en solution de concentration connue dans l’eau de mer. Pour ce faire, 10 larves, écloses dans l’eau de mer pendant 48 heures, sont transférées dans un tube. L’extrait, de concentration connue est introduit dans le tube (10ml d’extrait). Trois tubes sont ainsi préparés pour chaque concentration. Après 24 heures, les larves survivantes sont comptées pour pouvoir évaluer le pourcentage de décès pour chaque concentration d’extrait. La dose létale LD50 est calculée en utilisant le programme Finney’s Probit Analysis. L’extrait est toxique si son LD50 est inférieure à 500µg/ml [21]
b- Solvants et matériels utilisés
• Œufs d’Artemia salina Leach
• Eau de mer
• Cuve de verre transparent, divisée en deux compartiments : une partie exposée à la lumière d’une lampe à incandescence placée au dessus de la cuve et une partie recouverte de papier aluminium. Les deux compartiments sont séparés par une cloison perforée de minuscules trous.
• Loupe
• Boîte de Pétri
• 19 tubes à essais (3 par concentration et un servant de témoin à blanc)
• Programme Finney’s Probit Analysis
c- Mode opératoire
Eclosion des œufs : Les œufs d’Artemia salina Leach sont introduits dans l’eau de mer, dans le compartiment sombre de la cuve. Les larves écloses migrent vers le compartiment éclairé à l’aide des petits trous. Au bout de 48 heures, on démarre le test proprement dit.
1) 25g de feuilles séchées et broyées sont macérées dans 200ml d’éthanol 80% pendant 24 heures.
2) Filtration sous vide sur Büchner. Solution hydroalcoolique obtenue : 125ml
3) Cette solution est évaporée sous vide (évaporateur rotatif, 60°C)
4) Masse de l’extrait total : 0,8663g
5) Reprise de l’extrait par du méthanol, évaporation
6) Dilution de 50mg de l’extrait dans 50 ml pour obtenir une concentration de 1000µg/ml. Dilutions successives des solutions mères pour avoir des concentrations respectives de 750 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 100 µg/ml et 50 µg/ml
Mise en solution :
1) Les larves écloses sont transférées dans une boîte de Pétri contenant de l’eau de mer pour faciliter leur prise et leur comptage. A l’aide d’une pipette Pasteur, 10 larves sont introduites dans chaque tube à essai. On dispose de 19 tubes, un tube contient 5ml d’eau de mer et sert de témoin
2) Après 24 heures dans le noir à une température de 24 – 25°C, le contenu de chaque tube est transféré dans une boîte de Pétri.
3) Le nombre de larves survivantes sont comptées: les larves survivantes sont mobilisées par la lumière de la lampe.
La colonne chromatographique
Il s’agit en général d’un tube cylindrique vertical de verre dont la longueur peut varier de quelques centimètres à un mètre et parfois plus. Le diamètre moyen est voisin du quinzième de la hauteur et la partie inférieure est obturée par une plaque de verre fritté ou par un tampon de coton de verre. Le remplissage de cette colonne par la phase stationnaire est une opération très importante car de son homogénéité dépend la régularité de la chromatographie. Deux procédés sont utilisés :
• Remplissage par voie sèche : la phase stationnaire est formée ou supportée par des petites particules solides, de granulométrie bien définie et se présente sous forme pulvérulente. Elle est versée dans la colonne par fractions et légèrement tassée par ébranlement latéral. Ce tassement est complété par l’introduction de petites quantités de phase mobile qui pénètrent dans les espaces interstitiels et par écoulement assurant la répartition homogène de l’ensemble. L’excès de phase mobile s’élimine à l’extrémité de la colonne, mais il faut prendre soin de toujours maintenir une certaine quantité de liquide au dessus de la surface de la phase stationnaire, afin d’éviter sa dessiccation et sa fissuration.
• Remplissage par voie humide : dans ce procédé, la phase stationnaire est mise en suspension dans un très petit volume de phase mobile et laissée sous agitation magnétique, jusqu’à obtention d’un mélange homogène. La bouillie ainsi obtenue est versée dans la colonne et l’excès de solvant est éliminé comme précédemment. Cette technique est un peu plus longue, mais présente l’avantage de permettre l’élimination des bulles d’air souvent présentes et source d’irrégularités dans le premier procédé. La capacité des colonnes dépend des quantités de phase stationnaire introduites. A titre d’exemple, 20 g de phase stationnaire sont suffisants pour bien séparer 1g de mélange de 4 à 5 substances dans une colonne de 30cm.
Introduction du mélange à chromatographier et des éluants
1er cas : pour les produits de polarité faible ou moye nne (dépôt liquide) : Le mélange de substances à chromatographier est mis en solution dans la plus faible quantité possible de solvant, souvent quelques centimètres cubes de la phase mobile elle-même, et déposé en une seule fois au sommet de la colonne lorsque l’on pratique une chromatographie descendante, ce qui est le cas le plus général.
2 e cas : pour les produits très polaires (dépôt sec) : On dissout l’échantillon dans un minimum de solvant polaire (DMSO ou méthanol). Dans un mortier en porcelaine on le broie avec une très faible quantité de la poudre de la phase stationnaire (exemple silice Si 60). On évapore à l’évaporateur rotatif le broyat pour éliminer le DMSO. La poudre sèche est ensuite déposée en une fois au sommet de la colonne comme dans le premier cas. Dans les deux cas, la phase mobile est ensuite introduite soit manuellement soit par écoulement, à partir de réservoirs placés au dessus des colonnes et dont les débits sont réglés afin de rester constants pendant toute l’opération. Lorsqu’il s’agit d’opérations de longue durée, on utilise des dispositifs qui permettent de programmer ces débits et éventuellement de modifier la composition des éluants.
Spectre APT (Attached Proton Test)
Il permet de déterminer le nombre de carbone portant 0, 1, 2, 3 protons. Il est obtenu à partir de séquence à impulsion multiple. Le découplage 13C – 1H (broad band decoupling) fait apparaître les signaux sous forme de singulets uniquement (signaux du 13C). Les signaux des CH3 apparaissent généralement aux champs forts. Les pics des Cq (quaternaires) sont de faibles intensités.
Conclusion
Pour notre initiation à la recherche, nous avons eu l’opportunité de nous familiariser avec la méthodologie de Recheche en Chimie des Produits Naturels ainsi que les bonnes pratiques de laboratoire (Good Laboratory Practices, GLP). Nous avons pu mettre en pratique les enseignements théoriques dispensés en AEA, en particulier les méthodes d’analyse par chromatographie et les méthodes spectrales de détermination de structure. Les enquêtes ethnobotaniques effectuées au sein des villageois, sur le lieu de récolte et les environs ont précisé l’utilisation traditionnelle de Cnestis polyphylla comme poison des chiens errants. Le test de toxicité générale Brine Shrimp que nous avons réalisé au laboratoire donne une valeur de LD50 = 115µg/ml pour la dose létale. Cette valeur qui est inférieure à 500µg/ml signifie une forte toxicité générale pour l’extrait brut de Cnestis polyphylla. Le criblage phytochimique a révélé la présence de quinones, de polysaccharides, tanins hydrolysables (galliques ou éllagiques) et de stérols insaturés ; les stéroïdes et les flavonols sont également présents. Les alcaloïdes n’ont pas été détectés. Le mode d’extraction des produits naturels issus des feuilles de Cnestis polyphylla est celui de l’extraction classique par gradient de polarité des solvants, une extraction bioguidée suivie d’un test Brine Shrimp pour chaque extrait. La saponification de l’extrait hexanique a conduit à l’isolement d’un produit donnant une monotache en CCM. L’enregistrement du spectre de masse et des spectres de RMN pour une détermination de structure est en cours. Le fractionnement de l’extrait méthanolique par CLBP successives a conduit, après CCM préparatives, à l’isolement de deux produits codés F4a – F7d donnant une monotache en CCM. La détermination de structure est en cours. Un produit, codé BENF11a, isolé de l’extrait à l’acétate d’éthyle donne une tache unique en CCM. Ses spectres RMN mono et bidimensionnelle (RMN 1D : 1H, 13C ; RMN 2D : COSY, HSQC, HMBC) ont été enregistrés. Certains fragments de la structure de BENF11a ont pu être identifiés sur la base des informations tirées de ces spectres RMN. Mais ces informations sont insuffisantes pour avancer une hypothèse de structure complète. La structure de BENF11a est à déterminer dès l’acquisition des autres spectres. L’étude des autres extraits fera l’objet de travaux ultérieurs sur Cnestis polyphylla Lamk.
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Table des matières
INTRODUCTION
1- MATERIELS ET METHODES
1- 1- Matériel végétal
Travaux antérieurs
Localisation
Présentation botanique
1- 2- Matériel technique
1- 3- Méthodes
1- 3- 1- Test de toxicité générale Brine Shrimp
a- Principe
b- Solvants et matériels utilisés
c- Mode opératoire
1- 3- 2- Criblage phytochimique
1- 3- 3- Extraction
a- Principe
b- Extraction proprement dite
1- 3- 4- Extraction bioguidée
1- 3- 5- Les méthodes chromatographiques
a- La chromatographie sur couche mince (CCM)
b- La chromatographie liquide basse pression (CLBP)
1- 3- 6- Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)
Principe
Applications
RMN impulsionnelle [18, 26]
Notion de déplacement chimique
RMN unidimensionnelle (RMN 1D)
RMN bidimensionnelle (RMN 2D)
Concepts de base
Appareillage
2- RESULTATS ET DISCUSSIONS
2- 1- Test de toxicité générale Brine Shrimp
Interprétation des résultats
2- 2- Criblage phytochimique
Interprétation
2- 3- Extraction
Discussions
2- 4- Etude de l’extrait hexanique
2- 4- 1- Saponification de l’extrait hexanique
2- 4- 2- Fractionnement
2- 5- Etude de l’extrait méthanolique
2- 5- 1- Test de toxicité des extraits
2- 5- 2- Fractionnement de l’extrait méthanolique (MEO1)
Discussions
2- 6- Etude de l’extrait à l’acétate d’éthyle
2- 6- 1- Fractionnement de l’extrait à l’acétate d’éthyle (ACO1)
2- 6- 2- Fractionnement de F1
2- 6- 3- Isolement de F11
2- 6- 4- Interprétation des spectres
CONCLUSION
Références bibliographiques
Références webographiques
ANNEXES
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