Contexte biologique de l’amélioration variétale des agrumes

Polyploïdes issus de biotechnologies

Colchicine

La technique la plus ancienne pour l’obtention de tétraploïdes est l’application de colchicine. Barett (1974) et Tachikawa (1971) ont obtenu des plants chimériques suite à un traitement à la colchicine de bourgeons sur une vingtaine de clones de Citrus, d’hybrides et un clone de Fortunella. Afin d’éviter le développement de chimères, plusieurs auteurs ont combiné des techniques de culture in vitro et les traitements à la colchicine. Ainsi, Gmitter et al. (1991; 1990) ont obtenu des plants tétraploïdes non chimériques par culture d’embryons traités à la colchicine pour les orangers Hamlin et Ridge Pineapple ainsi que par culture de cals embryogènes issus de culture d’ovules non développés traités à la colchicine pour l’oranger Valencia et de tangelo Orlando.
Les variétés monoembryonées d’agrumes ne présentent pas naturellement de tétraploïdes spontanés. Chez ces variétés, le traitement à l’aide d’un agent mitoclasique sur bourgeon est la seule technique permettant d’obtenir un autotétraploïde. Juarez et al. (2004) ont obtenu des clémentines tétraploïdes par traitement de branches à la colchicine. Wakana et al. (2005) ont obtenu des branches tétraploïdes par surgreffage de pousses de plusieurs variétés acides d’agrumes dont les bourgeons ont été traités à la colchicine. Les tétraploïdes issus de bourgeons ne présentent pas de phase de juvénilité contrairement aux autotétraploïdes issus de semis polyembryonés ce qui est un avantage en amélioration des agrumes. Une nouvelle méthodologie, basée sur le greffage in vitro d’apex combinée à un traitement de la microgreffe à la colchicine et l’oryzaline a été mise en place (Aleza, et al. 2009). L’oryzaline est utilisée pour initier le dédoublement chromosomique et la déchimèrisation est assistée par cytomètrie en flux. Plusieurs tétraploïdes de clémentiniers et mandariniers ont été obtenus via cette méthode.

Hybridation somatique

Durant les 20 dernières années, de nombreux hybrides somatiques d’agrumes ont été créés par fusion de protoplastes. Depuis les premiers résultats obtenus par (Ohgawara, et al. 1991), l’hybridation somatique est devenue une composante importante dans les programmes Introduction bibliographique d’amélioration d’agrumes (Grosser et Chandler 2000; Grosser, et al. 2000). C’est un puissant outil de biotechnologie permettant la création de nombreux allotétraploïdes mais également de nouvelles combinaisons nucléo-cytoplasmiques, de cybrides diploïdes et d’hybrides asymétriques aneuploïdes. L’élargissement des ressources génétiques tétraploïdes est particulièrement intéressant pour la création de triploïdes. L’hybridation somatique rend possible la combinaison des gènes intéressants tout en contournant les problèmes d’incompatibilité, la stérilité gamétique et l’apomixie.
L’hybridation somatique consiste à fusionner deux cellules non reproductrices dépourvues de leurs parois pectocellulosiques après une digestion enzymatique et issues de deux parents génétiquement différents (Figure 9). Elle n’est possible que si les protoplastes d’au moins un parent sont totipotents et que les protoplastes sont obtenus en grande quantité (Bhojwani et Razdan 1996).
Chez les Citrus, la capacité de régénération d’une plante entière n’est conférée que par les protoplastes issus de cals embryogènes. En effet, dans les conditions de culture utilisées, les protoplastes issus de mésophylle foliaire de Citrus ne présentent pas d’aptitude à la régénération. La constitution de collection de cals embryogènes est donc un préalable à la mise en oeuvre du programme d’hybridation somatique (Ollitrault et De Rocca Serra 1992).
La stratégie alors utilisée, est de réaliser des hybridations somatiques entre des protoplastes issus de cals embryogènes et des protoplastes issus de feuilles. La totipotence est transmise au produit de fusion.
De nombreux programmes d’amélioration des agrumes utilisant l’hybridation somatique sont développés à travers le monde en particulier aux Etats-Unis, au Brésil, au Japon, en Chine, en Espagne, en Italie et en France (Grosser et Chandler 2000; Grosser, et al. 2000). De nos jours, plusieurs centaines d’hybrides somatiques allotétraploïdes d’agrumes sont publiés.
Trois techniques de fusion de protoplastes ont été développées, une chimique, une électrique et une mixte electro-chimique. Plusieurs produits peuvent être issus de ces fusions.

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Table des matières

I. Introduction
I.1 Histoire et contexte de la filère agrume
I.1.1 Origine et dispersion
I.1.2 Taxonomie et phylogénie
I.1.3 Contexte économique
I.1.3.1 Au niveau mondial
I.1.3.2 Au niveau du bassin méditerranéen
I.1.3.3 Au Maroc
I.1.4 Contraintes environnementales
I.1.5 Attentes du marché
I.1.6 Objectifs d’amélioration des agrumes
I.1.6.1 Généralités
I.1.6.2 Amélioration des porte-greffe
I.1.6.3 Amélioration variétale
I.1.6.4 Enjeux et perspectives de l’amélioration dans le bassin méditerranéen
I.1.6.5 Enjeux et perspectives de l’amélioration au Maroc
I.2 Contexte biologique de l’amélioration variétale des agrumes
I.2.1 Diversité phénotypique chez les agrumes
I.2.2 Ploïdie et cytogénétique des agrumes
I.2.3 Système de reproduction chez les agrumes
I.2.3.1 Généralités
I.2.3.2 Apomixie
I.2.3.2.1 Dans le règne végétal
I.2.3.2.2 Chez les agrumes
I.2.3.2.3 L’apomixie dans les programmes d’amélioration
I.2.3.2.3.1 Intérêts à l’amélioration de porte-greffe
I.2.3.2.3.2 Obstacles à l’amélioration variétale
I.2.3.2.4 Transmission de l’apomixie
I.2.3.2.5 Discrimination entre plants hybrides et nucellaires
I.2.3.3 Aspermie chez les agrumes
I.2.3.3.1 Aspermie au niveau diploïde
I.2.3.3.1.1 Stérilité mâle et femelle
I.2.3.3.1.2 Autoincompatibilité
I.2.3.3.2 Cultivars triploïdes aspermes
I.2.3.3.3 Mécanismes de formation naturelle des triploïdes et tétraploïdes spontanés chez les
agrumes
I.3 Stratégie d’amélioration des petits agrumes : la voie triploïde
I.3.1 Intérêt des cultivars triploïdes
I.3.2 Obtention de tétraploïdes pour les croisements interploïdaux 2x X 4x et 4x X 2x
I.3.2.1 Polyploïdes issus de biotechnologies
I.3.2.1.1 Colchicine
I.3.2.1.2 Hybridation somatique
I.3.2.1.2.1 Hybrides somatiques allotétraploïdes
I.3.2.1.2.2 Cybrides
I.3.2.1.2.3 Hybrides aneuploïdes
I.3.3 Stratégies pour la création de triploïdes aspermes
I.3.3.1 Sélection de triploïdes spontanés lors des croisements entre diploïdes
I.3.3.2 Croisements entre diploïdes et autotétraploïdes
I.3.3.3 Croisements entre diploïdes et hybrides somatiques tétraploïdes
I.3.3.4 Hybridation somatique entre des protoplastes diploïdes et haploïdes
I.4 Polyploïdie chez les plantes supérieures
I.4.1 Généralités
I.4.2 Origine et maintien des polyploïdes
I.4.3 Biologie de la reproduction et ségrégation chez les polyploïdes
I.4.3.1 Classification des polyploïdes
I.4.3.2 Comportement méiotique
I.4.3.2.1 Chez les polyploïdes naturels
I.4.3.2.2 Chez les hybrides somatiques
I.4.3.3 Fertilité
I.4.3.3.1 Chez les polyploïdes naturels
I.4.3.3.2 Chez les hybrides somatiques
I.4.3.4 Ségrégation allélique
I.4.3.4.1 Modèles de ségrégation
I.4.3.4.2 Ségrégation chez les hybrides somatiques
I.4.3.4.3 Transmission de l’hétérozygotie
I.4.4 Polyploïdes et expression génotypique et phénotypique
I.4.4.1 Polyploïdisation et modifications génétiques
I.4.4.2 Polyploïdisation et modifications épigénétiques
I.5 Comportement méiotique et expression génomique et phénotypique chez les hybrides somatiques d’agrumes
I.5.1 Comportement méiotique des hybrides somatiques d’agrumes
I.5.2 Expression génomique et phénotypique chez les hybrides somatiques d’agrumes
II. Objectifs de la thèse
III. Matériels et Méthodes
III.1 Matériel végétal
III.2 Méthodes
III.2.1 Croisements contrôlés
III.2.1.1 Extraction des pépins et mise en culture des embryons
III.2.1.2 Sauvetage d’embryons
III.2.2 Caractérisation génétique du matériel végétal
III.2.2.1 Evaluation de la ploïdie
III.2.2.1.1 Cytométrie en flux
III.2.2.1.2 Comptage chromosomique
III.2.2.2 Caractérisation moléculaire des hybrides somatiques et des descendances
III.2.2.2.1 Extraction d’ADN
III.2.2.2.2 Amplification des ADN par PCR avec des amorces non marquées
III.2.2.2.3 Marqueurs SSR nucléaires
III.2.2.2.4 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide
III.2.2.2.5 Electrophorèse capillaire
III.2.3 Biologie de la reproduction des hybrides somatiques d’agrumes
III.2.3.1 Description des fleurs
III.2.3.2 Evaluation de la germination pollinique
III.2.3.3 Evaluation de la taille et la viabilité pollinique des hybrides somatiques et de leurs
parents diploïdes
III.2.3.4 Evaluation de l’apomixie et de la fertilité femelle des hybrides somatiques et de leurs
parents diploïdes
III.2.4 Etude cytogénétique et de la ségrégation allèlique chez les hybrides somatiques d’agrumes
III.2.4.1 Etude de la méiose
III.2.4.2 Etude de la ségrégation allèlique chez les hybrides somatiques
III.2.4.2.1 Modèle de formation des gamètes
III.2.4.2.2 Analyse des données observées
III.2.5 Analyse statistique
IV. Résultats et discussion
IV.1 Etude de la transmission des caractères liés à la biologie de la reproduction chez les hybrides somatiques d’agrumes
IV.1.1 Résumé de l’article
IV.1.2 Article
IV.2 Origines génétiques des variations de ploïdie dans les descendances de croisements de type 2x X 4x impliquant des hybrides somatiques d’agrumes
IV.2.1 Résumé de l’article
IV.2.2 Article
IV.3 Etude de la ségrégation allélique chez un hybride somatique interspécifique entre Citrus reticulata et Citrus lemon
IV.3.1 Résumé de l’article
IV.3.2 Article
IV.4 Etude de la ségrégation allélique chez un hybride somatique intergénérique entre
Citrus reticulata et Poncirus trifoliata
IV.4.1 Résumé de l’article
IV.4.2 Article
V. Discussion générale
V.1 Biologie de la reproduction des hybrides somatiques d’agrumes
V.1.1 Contributions parentales à l’élaboration du système de reproduction de l’hybride
somatique et plus généralement au phénotype
V.2 L’origine génétique des plantes présentant différents niveaux de ploïdie issues de croisements entre diploïdes et hybrides somatiques tétraploïdes d’agrumes
V.3 Etude de la ségrégation allélique chez un hybride somatique interspécifique WLM+EUR et un hybride somatique intergénérique WLM+PON d’agrumes
V.3.1 Les différents modes de ségrégation allèlique chez les hybrides somatiques
V.3.2 L’effet de l’hybridation somatique sur le comportement méiotique
V.3.3 L’identification du mode de ségrégation allélique chez les hybrides somatiques interspécifiques et intergénériques d’agrumes
V.3.4 Impact du type d’hybridation somatique sur la transmission de l’hétérozygotie et la double réduction
VI. Conclusions et perspectives
VI.1 Biologie de la reproduction des hybrides somatiques d’agrumes
VI.1.1 Effets de l’hybridation somatique sur l’appareil floral
VI.1.2 Impact de l’hybridation somatique sur la fertilité
VI.1.3 Transmission de l’apomixie et de la poly-monoembryonie
VI.2 Origine génétique des 2x, 3x et 4x dans les descendances 2x x 4x
VI.2.1 Perspectives pour les programmes d’amélioration d’agrumes
VI.3 Etude de la ségrégation allélique chez les hybrides somatiques d’agrumes
VI.3.1 Analyse cytogénétique et étude du mode de ségrégation allélique
VI.3.2 Perspectives d’études génétiques et épigénétiques chez les hybrides somatiques d’agrumes
et leurs descendances
VII. Références bibliographiques