Soutenance mémoire
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Ethnobotanique du genre Zanthoxylum
L’utilisation des différentes parties des Zanthoxylum en médicine traditionnelle dépend de l’espèce et de la région où la plante pousse.
Les feuilles et les tiges sont employées contre les affections parasitaires. (1).
Les maux de tête, le rhumatisme, la fièvre,l’ulcère, l’œdème, les troubles génitaux et urinaires sont traités par les racines .(4)
Les fruits sont utilisés contre les maux dedents, l’asthme, la bronchite et le rhumatisme. (5).
Les écorces permettent de soigner les mauxde dents, les coryzas et la toux. (6).
Constituants chimiques des espèces du genre Zanthoxylum de Madagascar
Les espèces endémiques de Madagascar étudiées jusqu’à présent renferment de très différents constituants chimiques tels les terpènoïdes, les coumarines et surtout les alcaloïdes dérivés de la tyrosine.
Ces composés sont représentés suivant les espècesudgenre Zanthoxylum dans le tableau II.
Activités biologiques des espèces du genreZanthoxylum de Madagascar
Les espèces du genre Zanthoxylum de Madagascar, déjà étudiées ont montré les activités biologiques suivantes:
– antiplasmodium in vitro grâce à la γ- fagarine, un alcaloïde quinolinique de Zanthoxylum tsihanimposa. (13).
– molluscicide des alcaloïdes totaux de Zanthoxylum madagascariense sur Biomphalaria pfeifferi, qui est un hôte intermédiaire des parasites de la bilharziose (la décarine). (14,10).
– anticercaire des alcaloïdes totaux des écorces de tige de Zanthoxylum madagascariense sur Schistosoma mansoni, agent de la bilharziose intestinale, a été mise ne évidence en 1997 par Rakotozafy et al. (15)
– anticancereux de Rutaceline isolé deZanthoxylum madagascariense. (16)
Zanthoxylum tsihanimposa H.Perr
Zanthoxylum tsihanimposa H. Perr a été décrite par H. Humbert en 1950: Zanthoxylum tsihanimposa H. Perr est une plante endémique de Madagascar. C’est un grand arbre de 20 à 30m. de haut, à tronc de 60cm.à 1m. e t plus de diamètre, portant souvent sur la base quelques gros aiguillons (2 x 1,6cm) très épais et des plaques épaisses de liège jaune stratifié, recouvrant une écorce blanchâtre,épaisse, à saveur brûlante et à forte odeur balsamique des rameaux florifères et des feuilles inermes à ce stade ; au stade jeune tronc et branches couverts d’aiguillons coniques et feuilles (rachis et coté médiane de lapage inférieure des folioles) armées d’aiguillons acérés plus minces ; rameaux aux extrémités épaisse(10 à 12mm.diam.) ; cicatrices foliaires étroites. Feuilles groupées par 15-20 en bouquet au sommet des rameaux, se développant après la floraison, très grandes (55 à 80cm.), à 9-16 paires de foliole s opposées ou subopposées, glabres sauf des traces de pubérulence sur le rachis des très jeunes feuilles ; rachis subcylindrique, plan en dessus ; pétiolules très courts ou subnuls, à base étroitement comprimée ; folioles inférieures ovales (5-10 x 2,4-5,2 cm), les suivantes plus grandes oblongues ou ovales-lancéolées (12-20 x 3-7 cm), toutes plus ou moins inéquilatérales à la base, arrondies ou obtuses, puis cuspidées ou acuminées au sommet ; bords obscurement et très finement ondulés- crénelés ; rvuresne secondaires et réseau visible sur les deux faces ; ponctuations visibles par lumière directe sur la page inférieure des folioles ; par transparence, points très nombreux, plus ou moins visible selon l’état (jeune ou adulte) de la feuille, rougeâtres et de 2sortes, les uns plus petits, disséminés entre lesautres plus gros et plus rares. Inflorescences ♂ thyrsoidales, longues de 8-15cm., groupées par 7-20 en bouquet terminal, autour du bourgeon à feuilles qui se développera un peu plus tard, 2-3 fois ramifiées, denses, entièrement pubescentes ou pubérulentes ; axe portant souvent quelques aiguillons acérés ; bractées arrondies, apprimées, peu distinctes ; pédicelles courts(0,5-2 mm), pubescent ;fleurs ♂ 4-metres, rarement 5-metreé ; sépales ovales-obtus (1 x 0,7 mm.), égaux, pubescents-ciliés, imbriqués-décussés ; pétales ovales-subaigus ( 2,5 x 1,3mm), pubescents sur la face externe, valvaires-indupliqués ; étamines aussi longues que les pétales ;anthères petites (1 x 0,7mm) ; disque large, en collerette dressée, irrégulièrement denticulé; rudiment de gynécée lagéniforme, haut de 1mm., atténué en style tronqué. . Inflorescences♀ moins ramifiées, parfois plus courtes, à fleurs 4-mères, sessiles ou subsessiles ; sépales et pétales semblables ; pas de staminodes ; disque bosselé, adné à la base.
Criblage des flavonoides et des leucoanthocyanes
Une solution hydroalcoolique de 1ml est évaporée dans un cristallisoir au bain marie. Après refroidissement, le résidu a été dépigmentéveca 10ml d’éther de pétrole. Le résidu dépigmenté a été dilué dans une solution d’éthanolà80 %. Après filtration, le filtrat a été réparti dans 5 tubes à essais.
Le tube n°1 sert de témoin.
Le tube n°2 sert pour le test de Wilstater : additi on de 0,5ml de HCl concentré et de quelques tournures de Mg. Après 10mn de la réaction, la coloration a été notée :
– une coloration rouge indique la présence de flavones.
– une coloration rouge pourpre marque la présence deflavonols.
– une coloration rouge violacée signifie que la plante contient des flavanones et flavanols.
Le tube n°3 est destiné pour le test de Wilstater modifié : ajout de 0,5ml de HCl concentré et de quelques tournures de Mg. Ensuite, ajout de 1ml d’eau distillé et de 1ml d’alcool isoamylique. Après 10mn, si la coloration de la phase supérieure est rouge, il y a présence de flavone. Une coloration pourpre montre la présence de flavonols.
Le tube n°4 est réservé pour le test de BateSmith : addition de 0,5ml de HCl concentré puis chauffage au bain marie pendant 30mn. La coloration du milieu réactionnel est notée après refroidissement. Si elle est rouge violacée,la plante renferme des leucoanthocyanes.
Au tube n°5 est additionné à froid 0,5ml de HCl concentré. Une coloration rouge témoigne la présence des anthocyanes.
Criblage des tanins et des polyphénols
L’évaporation au bain marie d’une solution hydroalcoolique 1ml a donné un résidu sec qui a été ensuite dissous dans 15ml d’eau distillée chaude. Après filtration, 4 gouttes de NaCl 10% y sont ajoutées. Le filtrat recueilli a été réparti dans 4 tubes à essais :
Le tube n° 1 sert de référence.
Au tube n°2 sont additionnées 5 gouttes de gélatineà 1%. L’apparition de précipité informe sur la présence de polyphénols.
Au tube n°3 sont additionnées 5 gouttes de gélatinesalée. La présence de tanins est indiquée par l’apparition de précipité.
Au tube n°4 sont ajoutées 5 gouttes de FeCl3 10% dans MeOH. Une coloration bleu vert signifie la présence de tanins condensés (catéchiques ou flavane-3,4-diols). Une coloration noir bleuâtre informe sur la présence de tanins hydrolysables (galliques ou éllagiques) et une solution incolore indique l’absence de tanins.
Criblage des quinones
Le résidu obtenu après évaporation de 1ml deal solution a été dissous dans 15ml d’eau distillée. La solution obtenue a été filtrée. Leltratfi a été extrait avec 5ml de benzène dans une ampoule à décanter. 3ml de NH4OH ont été additionnés à la phase benzénique. Après décantation, la présence de quinones a été indiquéepar une coloration rouge violacée de la phase aqueuse.
Criblage des stéroides et des terpénoides
Une solution hydroalcoolique de 1,2ml a été évaporée à siccité dans un cristallisoir, au bain marie. Après refroidissement, 5ml d’éther y ont été introduits. Le mélange a été agité puis filtré. L’opération a été répétée plusieurs fojusqu’à élimination des pigments. Une addition de 10ml de chloroforme a été effectuée parla suite. Après 10mn d’agitation, le mélange a été décanté. La solution obtenue a étéchéesé sur NaSO anhydre puis filtré. Le filtrat a été réparti dans 6 tubes à essais de la manière suivante :
Le tube n°1 sert de témoin.
Le tube n°2 subit le test de Liebermann Burchard : addition de 3 gouttes d’anhydride acétique et 3 gouttes de H2SO4 concentré. L’apparition d’une coloration pourpre indique l’existence de triterpénoides dans la plante. Une coloration bleuevert indique la présence des stéroïdes .
Le tube n°3 est réservé pour le test de Salkowski :inclinaison à 45° du tube à essais puis ajout de 1ml de H2SO4 concentré. Si l’anneau de séparation est rouge, laplante contient des stéroides insaturés.
Le tube n°4 est utilisé pour le test de Badjet Kedde : addition de quelques grains d’acide picrique. La présence de stéroïdes lactoniques estmontée par une coloration rouge.
Le tube n°5 est additionné de quelques gouttes de FeCl3 10% puis quelques gouttes d’acide acétique glacial. Il est incliné à 45°. Il s’agit du test de Keller-Killiani. Une coloration rouge pourpre de l’anneau de séparation indique la présence de 2-desoxysucres.
Le tube n°6 est additionné d’un peu de solution saturée d’antimoine. S’il y a apparition d’une fluorescence bleue, la plante contient des tritèrpènes. Par contre, une fluorescence jaune indique la présence des stéroïdes.
Criblage des saponines
Une pincée de poudre de plante a été introduite dans un tube à essais. Après addition de 10ml d’eau distillée, le mélange a été agité vigoeusementr pendant 30s. Une mousse se forme dans le tube. On le laisse reposer ; on mesure la hauteur de mousse après 30mn à la température ambiante. On remesure la hauteur de mousse Si après 30mn au repos, à la température ambiante, la hauteur de mousse est supérieure à 3cm, les saponines sont présentes dans la plante.
Criblage des polysaccharides et des sucres réducteurs
Un décocté a été préparé avec 5g de poudreplantede. Après filtration, 3 volumes d’alcool sont ajoutés au filtrat. La formation de précipitéindique la présence de polysaccharides.
• Sucre réducteur 5ml de filtrat ont été ajoutés à 10ml de liqueur de Fehling. Une coloration rouge brique traduit la présence de sucres réducteurs.
Les résultats attendus lors du criblage phytochimique ont été résumés dans le tableau III.
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Table des matières
PREMIERE CHAPITRE : GENERALITES
I.1LE GENRE Zanthoxylum
I.1.1 Botanique du genre Zanthoxylum
I.1.2 Ethnobotanique du genre Zanthoxylum
I.1.3 Constituants chimiques des espèces du genre Zanthoxylum de Madagascar
I.1.4 Activités biologiques des espèces du genre Zanthoxylum de Madagascar
I.2 Zanthoxylum tsihanimposa H. Perr
I.2.1 Botanique
I.2.2 Répartition géographique
I.2.3 Utilisation empirique
I.2.4 Constituants chimiques isolés de Zanthoxylum tsihanimposa
I.2.5 Activités biologiques de Zanthoxylum tsihanimposa
I.3 GENERALITES SUR LES TRITERPENES
I.3.1 Biosynthèse des triterpènes
I.3.2 Cyclisation initiale
I.4 GENERALITES SUR LES ANTIOXYDANTS
I.5 RESONANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE
I.5.1 RMN monodimensionnelle
a. Spectre RMN1H
b. Spectre RMN13C
c. Spectre DEPT 135°
I.5.2 RMN bidimensionnelle
a. Principales expériences 2D
DEUXIEME CHAPITRE : MATERIELS ET METHODES
II.1 MATERIELS
II.1.1Matériel végétal
II.1.2 Matériel de laboratoire
II.1.3 Solvants
II.2 METHODES
II.2.1 CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
II.2.1.1 Préparation des extraits bruts hydroalcooliques18
II.2.1.2 Criblage des alcaloïdes
a-Macération chlorhydrique
b-Test préliminaire
c-Test de confirmation
II.2.1.3 Criblage des flavonoïdes et des leucoanthocyanes
II.2.1.4 Criblage des tanins et des polyphénols
II.2.1.5 Criblage des quinones
II.2.1.6 Criblage des stéroïdes et des terpénoides
II.2.1.7 Criblage des saponines
II.2.1.8 Criblage des polysaccharides et des sucres réducteurs
II.2.2 METHODE D’EXTRACTION
II.2.2.1 Extraction hydroalcoolique
II.2.2.2 Extraction à l’hexane
II.2.2.3 Extraction au chloroforme
II.2.3 FRACTIONNEMENT ET ISOLEMENT
II.2.3.1 Chromatographie sur colonne
II.2.3.2 Chromatographie sur couche mince
II.2.3.3 Fractionnement de l’extrait hexanique
II.2.4 TEST ANTIOXYDANT DES EXTRAITS DE Zanthoxylum tsihanimposa H. Perr
TROISIEME CHAPITRE : RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1 EXTRACTION
III.2 CRIBLAGE PHYTOCHIMIQUE
III.2.1 Tableau récapitulatif des résultats du criblage
III.3 RESULTAT DU TEST ANTIOXYDANT
III.4 RESULTAT DU FRACTIONNEMENT DE L’EXTRAIT HEXANIQUE
III.5 RESULTAT DES CCM DES DIFFERENTES FRACTIONS
III.6 INTERPRETATION DES SPECTRES DU PRODUIT H1
III.6.1 Spectre RMN1H
III.6.2 Spectre RMN13C
III.6.3 Spectre DEPT 135°
III.6.4 Spectre 1H-13C HSQC
III.6.5 Spectre de corrélation 1H-13C HMBC
III.6.6 Spectre 1H-1H COSY
III.7 IDENTIFICATION DE LA STRUCTURE DE H1
CONCLUSIONGENERALE
REFERENCES
ANNEXES
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