Soutenance mémoire
Concept d’acidose
L’acidose métabolique correspond à une perturbation de l’EAB de l’organisme. Elle se caractérise par un pH sanguin inférieur à 7,38 et par une diminution de la concentration plasmatique des bicarbonates (< 22 mmoles/L). Cette réduction en bicarbonates peut résulter d’une surproduction d’acides organiques in vivo (acide lactique, corps cétoniques), d’une moindre élimination d’acides par le rein ou d’une perte excessive de bases, très souvent liées à la dégradation des fonctions rénales avec l’âge (Wiederkehr and Krapf, 2001).
L’état d’acidose induit le recrutement du centre respiratoire du tronc cérébral (qui adapte la fréquence et l’amplitude de la respiration) et des mécanismes rénaux visant à régler la concentration sanguine des ions H + :
1. Dans un premier temps, les chémorécepteurs sensibles au pH sanguin induisent une hyperventilation permettant de compenser la production excessive d’acidité volatile (H2CO3), par une élimination équivalente de CO2 au niveau pulmonaire. Cette première réponse tend à rétablir le pH sanguin à la normale (7,4 ± 0,02). 2. Si l’acidose se maintient au-delà de quelques heures voire jours, les mécanismes de compensation rénaux sont à leur tour stimulés (figures 1, 2). L’excrétion de NH4 + est accrue suite à l’activation de l’ammoniagènese au niveau du tubule proximal et de la réabsorption des protons dans les parties distales du néphron. L’excrétion d’acidité se fait soit associée à des tampons urinaires (25 mEq/j), soit associée à des molécules d’ammoniac issues de la dégradation de la glutamine, permettant d’évacuer en moyenne 45 mEq d’acides/j. De retour à un état stable, le rein excrète une quantité de bases équivalente à la charge acide, se traduisant par une concentration en bicarbonates faible mais stable (Wiederkehr and Krapf, 2001).
Concept d’acidose métabolique latente
Le concept d’acidose métabolique latente (AML) désigne un état d’acidose de faible intensité, généralement bien compensé, qui se traduit par un pH sanguin pratiquement normal et des taux de bicarbonates peu altérés (Frassetto et al., 2001). La modification la plus sensible se situe au niveau de l’excrétion urinaire d’acidité, qui se trouve augmentée (pH urinaire entre 5,6 pour un apport de 140 mEq/j et 6,7 pour 20 mEq/j) (Remer, 2000; Remer and Manz, 1995). Le phénomène d’AML sollicite au niveau de l’organisme les mécanismes compensatoires décrits précédemment, mais, à plus long terme sollicite d’autres systèmes en continu, en particulier les fonctions osseuses et musculaires. Le recrutement de ces systèmes est susceptible de contribuer à long terme à la génération d’effets métaboliques délétères pouvant conduire à l’apparition de calculs rénaux, d’altérations du tissu osseux, voire du tissu musculaire (figure 2) plaçant ainsi l’organisme dans un état catabolique (Alpern, 1995).
La littérature scientifique compte de nombreuses études présentant les conséquences des régimes alimentaires acidifiants sur la santé.
AML et calculs rénaux
Un régime fortement acidifiant peut générer une acidose métabolique. Cette phase initiale se poursuit par une adaptation des reins pour éliminer l’excès d’acidité engendré et ainsi maintenir le pH sanguin et la concentration en HCO3-à des plages normales (Alpern, 1995).
Cependant, cette adaptation se traduit par la perturbation de l’homéostasie du Ca. Plusieurs études cliniques ont clairement démontré que l’acidose métabolique induisait des pertes de Ca (Osther, 2006; Remer and Manz, 1995; Rylander et al., 2006) au niveau rénal, en augmentant le risque de formation des calculs rénaux (Alpern, 1995). La nature des calculs urinaires est variable, avec cependant une prédominance de calculs à base d’oxalate de Ca (70% du total) et dans une moindre mesure de phosphates de Ca (14%) et de purines (10%) (Demigné, 2008).
AML et santé osseuse
Dans le cas où les mécanismes rénaux sont dans l’incapacité de maintenir l’EAB dans des limites convenables, l’organisme est susceptible de mobiliser le tissu osseux pour neutraliser la charge acide excédentaire (figure 2).
Conception du fromage
Parmi les 400 variétés de fromages obtenues à partir du lait de vache, de chèvre, de brebis et de bufflonne, peuvent être distinguées huit familles de fromages : les pâtes fraîches, les pâtes molles à croûte fleurie, les pâtes molles à croûte lavée, les pâtes persillées, les pâtes pressées cuites (PPC), les pâtes pressées non cuites (PPNC), les fromages fondus et les pâtes filées. En France, sept fromages bénéficient du signe de qualité Label Rouge (LR), quatre d’une Indication Géographique Protégée (IGP) et quarante-six autres d’une Appellation d’Origine Protégée (AOP) ou Appellation d’Origine Contrôlée (AOC) (INAO, 2015). En particulier, les fromages AOP du Massif-Central représentent 34% de la fabrication française totale des fromages AOP.
Aptitude du lait à la transformation fromagère
L’aptitude fromagère du lait s’exprime à travers son rendement fromager, la composition du produit final, qui doit respecter des normes précises et la qualité organoleptique du fromage obtenu. La composition du lait et particulièrement ses teneurs en caséines et MG déterminent principalement son aptitude fromagère (Piacere and Elsen, 1992).
L’eau qui est éliminée en proportions variables en fonction de la variété de fromage entraîne avec elle une partie des éléments solubles et les protéines du sérum (Brulé et al., 2006).
Elle a une incidence directe sur la fermeté du fromage, donc sur la texture. Contribuant au rendement fromager, l’eau est indispensable aux microorganismes en influençant leur croissance et ainsi la vitesse de fermentation et d’affinage du fromage. Une teneur plus importante en eau induit une hydrolyse plus rapide des caséines, de la MG et du lactose par les enzymes microbiennes (St-Gelais and Tirard-Collet, 2002).
La matière grasse joue un rôle important dans la formation de la structure du fromage.
En effet, le fromage consiste en une matrice composée de caséines et de minéraux dans laquelle la MG est emprisonnée. Elle contribue au rendement fromager. Ainsi, il faut adapter les procédés de transformation pour retenir au maximum la MG et diminuer les pertes dans le lactosérum. Une augmentation du rapport caséine/MG induirait un égouttage problématique,avec des pertes trop importantes de MG dans le lactosérum, ainsi que des changements de la saveur et de la texture du produit final (Eck and Gillis, 1997).
Les caséines constituent la pièce maîtresse de la fabrication fromagère, ce sont elles qui créent la matrice du fromage, en formant des micelles de caséine stables qui sont en équilibreavec la phase soluble du lait (Brulé, 1991). Lorsque les bactéries lactiques (flore naturelle ouajout de levain) transforment le lactose du lait en acide lactique, le pH du lait diminue(McSweeney and Fox, 2004). Au fur et à mesure de l’abaissement du pH, les résidus acides libres des caséines fixent des protons et de ce fait augmentent la solubilité du phosphate de Ca micellaire. La neutralisation des charges négatives en surface entraîne une agrégation des micelles. Lorsque le point isoélectrique des caséines est atteint (pH = 4,65) (Walstra et al., 2005) le phosphate de Ca est dissout et les micelles sont totalement déstructurées.
Le caillé lactique est obtenu par des liaisons hydrophobes, hydrogènes et électrostatiques. Cependant, en présence d’une enzyme, comme la chymosine, la k-caséine est hydrolysée. Dès lors, les micelles deviennent instables, puis forment en présence des minéraux un réseau de caséines qui se gélifie progressivement, pour former un caillé de type présure, plus ou moins ferme (Brulé et al., 2006).
Mécanisme de coagulation du lait
La coagulation du lait, qui se traduit par la formation d’un gel, résulte des modifications physicochimiques intervenant au niveau des micelles de caséines. Les mécanismes proposés dans la formation du coagulum différent totalement selon que ces modifications sont induites par acidification ou par action d’enzymes coagulantes.
Coagulation par acidification
La coagulation par voie acide est provoquée par le ferment lactique qui transforme le lactose en acide lactique. L’acidification doit être lente et progressive. En effet, une acidification rapide et brutale (par un acide minéral ou organique) du lait entraîne la formation d’un précipité. Une acidification lente et progressive peut être obtenue par des ferments lactiques et conduit à la formation d’un gel lisse homogène, qui occupe entièrement le volume initial du lait (Brulé et al., 2006). L’abaissement du pH a pour effet de protoner les groupements acides libres des caséines (résidus aspartiques, glutamiques, phosphosériques). Cette protonation provoque une réduction du potentiel de surface conduisant à la formation du gel lactique et a pour conséquence de diminuer le pouvoir séquestrant des caséines αet βet d’augmenter la solubilité du phosphate de Ca micellaire (Le Graet and Brulé, 1993). Même une légère acidification modifie suffisamment la structure micellaire pour que les caséinesdeviennent instables à la chaleur. Ainsi, lorsque le pH passe de 6,7 à 5,5, les charges négatives présentes à la surface des micelles de caséines sont neutralisées, ce qui produit une augmentation du diamètre moyen des micelles (de 180 à 1300 nm) causée par l’agglomération des petites micelles aux plus grosses (figure 9). L’acidification se poursuit jusqu’au point isoélectrique des caséines, soit au pH de 4,65. Les micelles perdent complètement leurs structures par dissolution du calcium micellaire.
Dès lors, les caséines sont dénaturées et perdent leur propriété de suspension colloïdale (Le Graet and Brulé, 1993). Les protéines subissent alors des étirements, peuvent s’enchevêtrer et former un gel. Le coagulum obtenu est le résultat de la formation d’un réseau protéique insoluble englobant dans ses mailles la totalité de la phase aqueuse. Ce type de gel est ferme, extrêmement friable et ne présente qu’un très faible pouvoir de synérèse et donc une aptitude à l’égouttage extrêmement limitée.
Coagulation par voie enzymatique
Plusieurs enzymes protéolytiques d’origine animale (présure, pepsine), végétales (broméline, ficine, chardon) ou microbiennes (enzymes de certaines moisissures ou de bactéries) ont la propriété de coaguler les caséines du lait. Cependant, en France, seule la présure est utilisée dans l’industrie fromagère (Ramet, 1985). La présure, sécrétée dans la caillette de veau non sevré, est un mélange de chymosine (80%) et de pepsine (20%).
L’addition de la présure au lait provoque la coagulation par hydrolyse de la caséine k située en périphérie de la micelle. Cette hydrolyse scinde la liaison peptidique 105-106 etlibère le glycomacropeptide qui est la partie hydrophile de la caséine kchargée négativementet responsable des répulsions électrostatiques. La partie restante de la micelle est laparacaséinek qui est plus hydrophobe et peut se lier avec d’autres paracaséines par des liaisons hydrophobes pour créer un coagulum. Cette coagulation commence par une agrégation des petites micelles, puis se complète par l’agrégation des plus grosses micelles pour former un gel de paracaséine (St-Gelais and Tirard-Collet, 2002). Ce type de gel structuré possède une bonne élasticité, une friabilité réduite et un fort pouvoir de contraction, lui conférant ainsi une bonne aptitude à l’égouttage.
En pratique fromagère, la coagulation est toujours obtenue par l’action conjointe d’une préparation enzymatique coagulante et de l’acidification. L’importance de chacun de ces deux modes de coagulation induit des propriétés particulières du coagulum qui conditionnent l’aptitude à l’égouttage et les caractéristiques finales du fromage.
Métabolisme du lactose résiduel
La transformation du lactose en acide lactique développée pendant la coagulation et l’égouttage se poursuit pendant l’affinage (figure 10). Le lactose disparaît en général dans les premiers jours de la maturation à la suite de fermentations variées, dues en particulier aux bactéries lactiques et coliformes, aux levures et moisissures. Cependant, des teneurs mineures, de l’ordre de 0,8 à 1% restent dans le caillé. Ce lactose résiduel est rapidement métabolisé en L-lactate en début d’affinage à un taux largement déterminé par la température, les teneurs en sel et en eau du caillé, mais aussi par l’action des ferments lactiques.
Comme le ratio sel/humidité augmente rapidement pendant le salage, l’activité des bactéries lactiques est très vite stoppée. Ainsi, le lactose non fermenté par les bactéries lactiques est probablement métabolisé par d’autres bactéries non starter (McSweeney and Fox, 2004). A des concentrations très importantes en bactéries lactiques, des teneurs importantes de D-lactate sont formées par racémisation du L-lactate. Ce phénomène a été étudié dans le cas du fromage Suisse (McSweeney, 2004) : le lactose résiduel, emprisonné dans le caillé après moulage, est rapidement métabolisé par les Streptococcus thermophilus pendant le refroidissement du caillé, en métabolisant le glucose avec la production de L-lactate (tableau 7).
Métabolisme du citrate
Le lait contient environ 1750 mg/L de citrate, qui se trouve en majorité dans la phase soluble étant ainsi éliminé avec le lactosérum. Dans le caillé de Cheddar on peut trouver 0,2 à 0,5% de citrate, concentration qui diminue à l’état de traces dans les 6 premiers mois d’affinage.
Les produits de son métabolisme sont le CO2 (petits trous) et des composés d’arôme dans des fromages fabriqués avec des cultures lactiques mésophiles (figure 10). Le citrate est métabolisé par des souches citrate+ de lactocoques (Streptococcus diacetylactis, Lactococcus lactis ssp lactis) et des lactobacilles (Leuconostoc mesenteroides ssp cremoris et Ln. lactis), mais ne pourra pas être métabolisé par d’autres lactobacilles thermophiles (McSweeney, 2004).
Fabrication de la Fourme d’Ambert
Le processus de fabrication industriel a été suivi à partir de la réception du lait cru jusqu’à la fin de l’affinage (Figure 14). A l’arrivée, le lait cru (30 t) a été pasteurisé et standardisé à un taux de matière grasse (3,9 g/100 g), ensuite refroidi à 13 °C. Des quantités appropriées de CaCl2 (15 mL/100 L) et un cocktail de ferments (ferments lactiques et Penicillium roqueforti) ont été rajoutés pour pré-maturer le lait pendant 12 h. Le lait maturé a été chauffé à 32 °C et la présure (30 mL/100 L) a été rajoutée. Après 30 minutes, le coagulum a été coupé horizontalement et verticalement et un processus de brassage d’une heure a été appliqué pour former la coiffe des grains de coagulum. L’égouttage sur tapis a été utilisé avant la mise en moule pour ne pas endommager la structure des grains. Pendant l’égouttage en moule plusieurs retournements par jour ont été faits. Les fromages ont été démoulés après 24 h.
L’étape ultérieure – le salage, a eu lieu en deux temps : 1) saumurage (environ 9 h) et 2) salage par frottage du sel sec (gros sel) à la surface, pour favoriser la formation de la croûte.
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Table des matières
INTRODUCTION
1. ETUDE BIBIOGRAPHIQUE
1.1 Potentiel acidifiant/alcalinisant des aliments
1.1.1 Homéostasie acido-basique
1.1.2 Réactions responsables de la production et de la consommation d’acides
1.1.3 Mécanismes de régulation de l’équilibre acido-basique
1.1.4 Du déséquilibre acido-basique à l’acidose métabolique latente
Concept d’acidose
Concept d’acidose métabolique latente
1.1.5 Conséquences physiopathologiques de l’AML à long terme
AML et calculs rénaux
AML et santé osseuse
AML et fonte protéique
1.1.6 Estimation de la charge acide générée par les aliments
1.1.7 Le sel, facteur aggravant de l’acidose métabolique latente
1.2 Fonctionnalités nutritionnelles des fromages
1.2.1 Contribution des fromages aux apports nutritionnels
1.2.2 Le potentiel acidifiant des fromages
1.3 Conception du fromage
1.3.1 Processus de fabrication des fromages
Composition de la matière première – le lait
Aptitude du lait à la transformation fromagère
Préparation du lait à la transformation fromagère
Mécanisme de coagulation du lait
Coagulation par acidification
Coagulation par voie enzymatique
Egouttage du coagulum
Etape de salage
Modalités de salage des fromages
Salage à sec .
Salage par saumurage
Processus de diffusion du sel dans le fromage
Affinage des fromages
Métabolisme du lactose résiduel
Métabolisme du lactate
Métabolisme du citrate
Lipolyse
Protéolyse
1.4 Stratégies de réduction de la teneur en sel des fromages et perceptions des consommateurs
1.4.1 Amélioration nutritionnelle des fromages et perceptions des consommateurs
1.4.2 Facteurs influençant la composition nutritionnelle des fromages
1.4.3 Stratégies de réduction de la teneur en sel des fromages
2 Objectifs du travail de thèse et démarche expérimentale
2.1 Enjeux et objectifs
2.2 Démarche expérimentale : une approche en trois étapes
2.2.1 1 ère étape : Caractérisation du potentiel acidifiant de fromages issus de technologies fromagères différentes
2.2.2 2 ème étape : Identification des leviers technologiques déterminants dans la génération du potentiel acidifiant des fromages au cours de la transformation
2.2.3 3 ème étape : Exploration des optimisations technologiques pertinentes permettant de réduire le caractère acidifiant des fromages
3 MATERIEL ET METHODES
3.1 Protocoles expérimentaux et méthodes d’échantillonnage
3.1.1 Echantillonnage des produits dans le commerce (étape 1)
3.1.2 Echantillonnage des produits dans l’entreprise (étape 2)
Fabrication de la Fourme d’Ambert .
Echantillonnage
3.1.3 Protocole d’optimisation nutritionnelle de la Fourme d’Ambert – substitution partielle du NaCl par des sels de calcium (étape 3)
Nature des sels de substitution
Granulométrie
Intervention étude préliminaire
Intervention étude finale
Affinage
Echantillonnage
3.2 Méthodes d’analyse biochimique
3.2.1 Préparation des échantillons
3.2.2 Caractérisation globale des produits
Détermination du pH
Teneur de la matière sèche
Teneur de la matière grasse
Détermination de la teneur en cendres
Dosage de l’azote total
3.2.3 Détermination de la teneur en minéraux
Dosage du K, Na, Ca, Mg par spectrométrie d’absorption atomique
Dosage du phosphore par colorimétrie
3.2.4 Analyse des anions (chlorure, citrate et lactate)
Dosage des chlorures par potentiométrie
Dosage enzymatique du citrate et lactate
3.3 Protocole expérimental pour la caractérisation sensorielle des Fourmes d’Ambert salées avec différents types de sel
3.3.1 Observations sensorielles à l’étape préliminaire
3.3.2 Caractérisation sensorielle par un jury entraîné à l’étape finale
Jury qualifié
Nature des échantillons à tester
Découpe des fromages
Déroulement des différentes étapes de l’étude sensorielle
Etape 1 : Séances d’entraînement
Etape 2: Séances d’évaluation
3.4 Méthodes statistiques
Analyses biochimiques (étape 1 – 3)
Validation des performances du panel sensoriel (étape 3)
Analyse du profil sensoriel (étape 3)
4. Résultats et discussion
4.1 Etape 1 : Caractérisation du potentiel acidifiant de fromages issus de technologies fromagères différentes
4.1.1 Contexte de l’étude
4.1.2 Objectifs
4.1.3 Principaux résultats et discussion
4.1.4 Conclusions et perspectives
4.1.5 Article 1. « Exploratory study of acid-forming potential of commercial cheeses: impact of cheese type »
4.2 Etape 2 : Identification des apports et pertes en composants modulant le caractère acidifiant/alcalinisant des fromages au cours de la transformation
4.2.1 Contexte de l’étude
4.2.2 Objectifs
4.2.3 Principaux résultats et discussion
4.2.4 Conclusions et perspectives
4.2.5 Article 2. « Draining and salting as responsible key steps in the generation of the acid-forming potential of cheese : application to a soft blue-veined cheese»
4.3 Etape 3 : Exploration des optimisations technologiques pertinentes
permettant de réduire le caractère acidifiant des fromages
4.3.1 Contexte de l’étude
4.3.2 Objectifs
4.3.3 Principaux résultats et discussion
Etude préliminaire : principaux résultats et discussions
Etude finale : principaux résultats et discussions
Caractérisation biochimiques des produits
La substitution de sel par du lactate et du citrate de Ca appliquée permetelle de diminuer la teneur en Na ?
Comment expliquer l’évolution des teneurs en Ca dans le produit au
cours de l’affinage ?
La substitution à 75% du sel sec par le lactate et le citrate de Ca perme-telle de limiter le potentiel acidifiant de la Fourme d’Ambert ?
Caractérisation sensorielle des produits
Conclusions et perspectives
4.3.4 Article 3. « Calcium lactate and calcium citrate as attractive compounds
to subtitute NaCl in blue-veined cheese »
5. Conclusions générales et perspectives
5.1 Apports scientifiques, technologiques et socio-économiques de la thèse
5.2 Retour sur la démarche
5.2.1 Pertinence nutritionnelle de l’approche
5.2.2 Pertinence de l’utilisation du PRAL
5.2.3 Pertinence de l’approche pluridisciplinaire
5.2.4 Limites de l’étude
5.3 Retombées de la thèse
5.4 Perspectives de recherche
5.5 Apports personnels de la thèse de doctorat
Annexes
6. Références bibliographiques
