Conditions opératoires de la Chromatographie en phase gazeuse couplé à un détecteur à ionisation de flamme CPG/FID

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Extraction par CO2 supercritique

Ce procédé consiste à placer les végétaux préalablement broyés ouu découpés dans un extracteur puis à les mettre en contact avec le CO2 supercritique qui vient d’être comprimé et chauffé à une température maaximale de 40°C. Ainsi l’huile essentielle est extraite et le CO2 supercritique redevient gazeuxx et se sépare très facilement de l’huile essenttielle obtenue (W9). Cette méthode est propre et donne des rendements d’extraction élevés mais nécessite des équipements très coûteux.

Les méthodes de distillation

Le mot « Distillation » vient du latin « Distillare » qui signifiee « couler goutte à goutte ». Elle peut être définiee comme une évaporation d’un liquide suivi de sa condensation (6). Etant la plus utilisée de nos jours, cette technique implique la condensation de la vapeur et la récupération des fractionss liquides qui en résultent (W10).
 Hydrodistillation
Dans cette méthode, la biomasse est directement immergée dans un ballon rempli d’eau. L’ensemble est porté à ébullition. Sous l’effet de la chaleur, less cellules végétales éclatent et libèrent les moléculles odorantes par hydrodiffusion (osmose). Le mélange « vapeur d’eau huile essentielle » se condense dans un réfrigérant et forme deux phases bien distinctes qui sont par la suite séparées par décantation. Lorsque l’huile a une densité plus petite que l’eau, ce qui est souvent le cass excepté pour d’autres comme les clous de girofles, elle se met alors au dessus de celle-ci.
A l’échelle du laboratooire, la distillation peut s’effectuer avec un recyclage de la phase aqueuse obtenue lors de la déécantation comme le cas du système de « Cllevenger » présenté dans la figure 5 :
 L’entrainement à la vaapeur d’eau
Cette technique est l’une des méthodes d’extraction des huiles essentielles recommandées par la norme AFNOR NF T-75-225(18). Contrairement à l’hydrodistillation, l’entrainement à la vapeur (figgure6) ne met pas en contact direct la matièree végétale à extraire avec l’eau. La vapeur d’eau fournie par une chaudière traverse la matièree végétale située au dessus d’une grille. L’augmenntation de la pression due à la chaleur fait écclater les cellules et libère l’huile essentielle qui est vaporisée. La vapeur d’eau « chargée » d’huile essentielle constitue un mélange diphasiqque qui se condense au niveau d’un réfrigèrant. Les deux phases sont séparées dans un essenciier grâce à leur différence de densité. Cette méthode réduit les possibilités d’hydrolyse et d’autres modifications de la nature de l’huile essentielle qui intervient lors de l’extraction.
A l’échelle du laboratoire le dispositif présenté à la figure 6 ci-dessous est le plus adéquat. L’eau florale peut être récupérée durant toute l’extraction pour une éventuelle analyse ou une future valorisation.

Méthode de caractérisation des huiles essentielles

Les huiles essentielles sont de nos jours largement utilisées en pharmacie, en cosmétique et dans l’agroalimentaire (19). L’utilisation d’une huile essentielle de chémotype non connu peut être dangereuse pour l’utilisateur comme ce fut le cas d’une catastrophe qui a eu lieu en France vers la fin du XIXe siècle; le produit responsable de l’intoxication était un constituant majeur de l’huile essentielle utilisée pour parfumer la boisson (W3). Donc, connaitre la composition d’une huile essentielle semble être nécessaire pour éviter les erreurs d’utilisations, vérifier le chémotype et détecter des fraudes éventuelles.
Au cours de ce dernier demi-siècle, plusieurs techniques ont été développées et appliquées à l’analyse des huiles essentielles. Une partie d’entre elles a été remplacée de nos jours par des techniques plus faciles à manipuler et plus efficaces, tandis que d’autres méthodes ont maintenu leur importance significative et ont été améliorées en permanence (6).
La chromatographie en phase gazeuse(CPG) est incontournable de nos jours pour la caractérisation d’une huile essentielle.
 Chromatographie en phase gazeuse
La chromatographie en phase gazeuse est une technique de séparation des constituants d’un mélange basé sur les interactions entre: le soluté (produit contenu dans le mélange), la phase mobile (gaz), la phase stationnaire (solide). Au cours de ce processus, les produits à analysés sont vaporisés et éluées par la phase mobile appelée gaz vecteur le long d’une colonne contenant la phase stationnaire. Les composés seront séparés en fonction de leur affinité sur la phase stationnaire. A la sortie de la colonne, les constituants du mélange vont parcourir la colonne à des temps de rétention différents et arrivent sur un détecteur. Le signal obtenu est enregistré et transformé en chromatogramme. Les temps de rétention étant liés aux conditions de l’analyse, les indices de rétention sont calculés en utilisant une série d’alcanes. Pour une confirmation des résultats, plusieurs banques de données d’indices de rétention relatives à différentes phases stationnaires (Adams 2001 ; Joulain 1998 ; Shibamoto 1980 etc) sont utilisées (12). Cette technique dépasse toutes les autres techniques de séparation même si des colonnes peu performantes ont été utilisées. Cependant nous pouvons noter une amélioration considérable des outils chromatographiques avec un nombre de composés détectés de plus en plus élevé. En effet, en 1964, une amélioration de la séparation d’une huile essentielle qui était déjà séparée en 1961 a été faite en utilisant une chromatographie en phase gazeuse (CPG) équipée d’une colonne capillaire de 2m et d’un détecteur à conductivité thermique (TCD). Ce système exploité dans des conditions isothermes a permis de séparer 20 constituants chimiques. Une autre amélioration de la séparation de cette huile a été obtenue après l’introduction de la programmation de la température du four, ce qui a permis d’avoir 80 constituants. Les dernières améliorations significatives ont été le résultat de l’évolution des colonnes capillaires à haute résolution et le détecteur à ionisation de flamme qui est très sensible (FID). En 1981, à l’aide d’une colonne capillaire en verre de 50 m de long et de 0,25 mm de diamètre intérieur, l’huile a été séparée et environ 150 constituants ont été obtenus. Cependant le problème lié à la fragilité des colonnes capillaires en verre et leur installation encombrante ont atténué l’utilisation de ces colonnes en dépit de leur excellente qualité de séparation. Ces types de colonnes ont été remplacés par les colonnes capillaires en silice fondue presque incassable en utilisation normale et disponible dans le marché. En outre plusieurs phases stationnaires ont été et sont de nos jours utilisées comme : les phases polaires Carbowax 20M (DB-Wax, Supelcowax-10, HP-20M, INNOWax, etc), les phases non polaires (DB-1, SPB-1, HP-1 et HP-1ms, CPSil-5 CB, OV-1, etc), et le méthyl phényl polysiloxane 5%polaire( DB-5, SPB-5, HP-5, CPSil CB-8, OV-5, SE-54, etc.) (6).
La CPG peut être couplée à un détecteur à ionisation de flamme(DIF) pour la quantification et le calcul des indices de rétention des constituants. Elle est aussi souvent couplée à une technique d’identification spectrale comme la spectrométrie de Masse (MS) ou Spectrométrie Infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) (6, 12).
• Chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (CPG/FID) Cette technique permet une analyse quantitative des composés gazeux ou susceptibles d’être vaporises par la chaleur sans décomposition. La solution d’huile essentielle à analyser en CPG/FID est introduite dans l’injecteur qui le porte à l’état gazeux puis l’amène dans la phase mobile. Cette dernière les entraine le long de la colonne. Séparés en fonction de leur capacité d’interaction avec la phase stationnaire, les composés arrivent au niveau du détecteur et sortent sous forme de chromatogramme. La FID mesure la quantité de chaque composé en donnant l’aire intégrée par chaque pic.
• Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse CPG/SM Cette technique permet d’identifier les différents constituants du mélange à analyser. A ce niveau la colonne capillaire est directement couplée à la source d’ions permettant l’ionisation des constituants. Ils existent deux modes d’ionisations : l’ionisation chimique et l’ionisation par impact électronique (7). Ce dernier mode est le plus répandu. A la sortie de la colonne les analytes entrent dans la chambre où ils vont être fragmentés. M + e- M+. +2e- M+. est appelé ion moléculaire. Ces ions moléculaires peuvent évoluer pour donner des ions fils, dont l’énergie interne est suffisamment élevée pour qu’ils puissent se fragmenter et ainsi de suite. Un lot d’ions est obtenu dans la chambre d’ionisation dont le plus léger est H+ et le plus lourd M+.. Au niveau du détecteur, les ions vont se séparer en fonction de leurs rapports m/z. puis un ordinateur assure le traitement des données et fournit un spectre de masse. L’identification des composés est faite par comparaison à l’aide de bibliothèques de spectres disponibles.

Conditions opératoires de distillation

Pour chaque extraction nous avons rempli le ballon cylindrique d’une masse bien déterminée de matières végétales. Le ballon de 2 litres rempli au 2/3 d’eau distillée est porté à ébullition par un chauffe-ballon d’une puissance de 500W. L’ensemble vapeur d’eau huile essentielle se condense et passe dans le récepteur gradué où se forment deux phases distinctes (huile et eau). L’eau florale est éliminée au fil du temps. A la fin de l’extraction l’huile essentielle est séparée de la phase organique (eau florale), pesée puis gardée dans des flacons ambrés et les eaux florales sont récupérées dans des bouteilles. Les échantillons d’huiles et d’eaux sont conservés au réfrigérateur pour les besoins d’analyses chimiques.

Calcul du rendement

Le rendement en huiles essentielles se calcule en faisant le rapport entre la masse d’huile essentielle obtenue sur la masse de matière première végétale utilisée. Le résultat est exprimé en pourcentage. Formule : = 0
Rd= Rendement exprimé en %
MHE= Masse huile essentielle obtenue en g
MMV= Masse Matière végétale utilisée en g

Détermination de la composition chimique des huiles essentielles

La diversité des espèces et entre autres l’état physiologique des plantes et les facteurs édaphiques sont connus pour influencer la composition chimique des huiles essentielles. Donc déterminer la composition chimique s’avère nécessaire avant toute application d’une huile essentielle.
L’étude de la composition chimique des échantillons d’huiles essentielles a été réalisée par chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme (GC/FID) pour la quantification et d’une chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse pour l’identification des composés. La GC/FID (thermo scientific) et le GC/MS (FINNIGAN TRACE GC) sont équipées d’une colonne capillaire en silice de type phenylmethylpolysiloxane 5% polaire. La bibliothèque de spectre utilisée est Wiley 275 L.
Les résultats obtenus sont confirmés par passage en colonne polaire de type VF- WAXMS; en GC/FID (type HP6890) et en GC/FID-MS (Agilent 6890N GC Système et Agilent 5973Network Mass sélective detector).
Pour confirmer l’identification faite en GC/MS nous avons calculé les indices de Kovats (IK) des différents pics obtenus en colonnes polaire et apolaire en injectant une série de n-alcanes (C7-C30). L’injection est répétée après chaque dix analyses. Les résultats obtenus sont comparés à ceux de la littérature particulièrement Adams (2001) (22) et Joulain (1998) (23) pour les résultats de la colonne apolaire et Shibamoto (1980) (24) pour les résultats en colonne polaire (Wax). Les IK Trse calculentx−Tr(z)suivant la formule :
Ik(x) = 100 x Tr(z(+)1) − Tr(z) + 100Z
Ik(x)= Indice de kovats du pic à identifier
Tr(x)= Temps de rétention du composé à identifier
Tr(z)= Temps de rétention de l’alcane qui vient tout juste avant le composé à identifier
Tr(z+1)= Temps de rétention de l’alcane qui vient juste après le composé à analyser.
Z= Nombre d’atomes de carbone de l’alcane qui élue avant le composé à étudier.
Une injection de composés purs est effectuée en colonnes apolaire et polaire pour confirmer la composition chimique trouvée.

Conditions opératoires de la Chromatographie en phase gazeuse couplé à un détecteur à ionisation de flamme CPG/FID

L’étude de la composition chimique des échantillons d’huiles essentielles est effectuée d’abord en chromatographie en phase gazeuse couplée à un détecteur à ionisation de flamme et d’une colonne capillaire en phenyl-methylpolysiloxane (5% polaire) de 30m de long, 0,25mm de diamètre et 0,25µm d’épaisseur. Le gaz vecteur utilisé est l’hélium (He) avec un débit de 1,5 ml/mn. La température du four varie de 40 à 280°C selon la programmation suivante : la température initiale est fixée à 40°C pendant 5mn puis une progression de 8°C/mn jusqu’à 280°C où elle se stabilise pendant 5mn. L’injecteur de type split/splitless utilisé en mode split est à une température de 290°C et programmé à un débit de 30ml/mn. La température du détecteur est fixée à 290°C. Il fonctionne à l’air comprimé et à l’hydrogène à des débits respectifs de 350 ml/mn et 35 ml/mn. Le Gaz Makeup (le diazote N2) est utilisé avec un débit de 30ml/mn. L’aire minimale d’intégration des pics a été fixée à 3000 unités d’aire.
En suite nous avons fait passer les échantillons d’huiles essentielles en colonne polaire de type VF-WAX ms model AgilentP/N : cp9205, de dimension : 30m de long 0,25mm de diamètre et 0,25µm d’épaisseur de film. Avec toujours l’hélium comme gaz vecteur d’un débit de 1,8 ml/mn. La température du four est programmée comme suit : initialement a 50°C, elle augmente de 8°C/mn jusqu’à 70°C et passe de 70°C à 250°C, et une isotherme de 15mn à 250°C. La température du détecteur est de 260°C; le débit de l’hydrogène est de 30 ml/mm et celui de l’air 400 ml/mn. Pour chaque analyse 0,5µl de l’échantillon est injecté.
Dans le but de calculer les indices de Kovats relatifs aux composés obtenus dans les huiles essentielles, une série d’alcanes de C7 à C30 est injectée avant le démarrage des analyses et répétée après chaque dix échantillons analysés.

Conditions opératoires de la Chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse CPG/MS

L’identification des composés volatils de l’huile essentielle a été faite par passage en chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse.
Les analyses en CPG/MS ont permis d’obtenir les spectres de masse de différents pics qui constituent le chromatogramme de l’échantillon d’huile essentielle.
Nous avons utilisé dans un premier temps une chromatographie en phase gazeuse équipée d’une colonne capillaire en silice. Cette dernière est longue de 30m et possède un diamètre de 0,25mm et d’une épaisseur de film de 0,25µm. La température du four est programmée comme suit: isotherme de 5mn à 40°C/mn puis une progression de 8°C/mn jusqu’à 280°C où elle se stabilise pendant 5mn. L’injecteur utilisé en mode splitless est à 240°C. L’hélium est utilisé comme gaz vecteur à un débit de 30ml/mn. La CPG est couplée à une spectrométrie de masse (FINNIGAN TRACE MS), l’énergie d’ionisation fixée à 70ev. Et l’ensemble est relié à un système informatique utilisant la base de données informatisée de Wiley 275L. L’identification est faite en utilisant les indices de Kovats et la base informatisée.
En colonne polaire, nous avons travaillé avec un CPG/FID-MS, équipé d’une colonne VF-WAX ms model AgilentP/N : cp9205 à la sortie en forme d’un y dont le du microlitre injecté passent en FID et le en masse. Nous avons travaillé avec les mêmes paramètres de température du four et les mêmes gaz avec le même débit que ceux utilisés en CPG/FID polaire. La température d’ionisation en Masse est de 70ev.
Pour confirmer l’identification faite en CPG/SM une série d’alcanes de C7-C30 est a été injectée en colonne apolaire comme polaire au début des analyses et après chaque dix échantillons analysés.

Dosage du 1,8-cinéole

La méthode AFNOR NF75-404 (25) (méthode de l’étalon interne) a été utilisée pour déterminer la concentration en 1,8-cinéole des échenillons d’huiles essentielle d’E. camaldulensis.
Dans cette méthode nous avons utilisé comme produit de référence le 1,8-cinéole pur à 99% déterminée par CPG dans les conditions de l’essai. L’étalon interne utilisé est le tetradécane de pureté 99% déterminée en utilisant la même méthode.
Pour déterminer le coefficient de réponse, un mélange d’une quantité bien déterminée de tétradécane (l’étalon interne utilisé) et de 1,8-cinéole pur est passé en CPG dans des conditions opératoires de l’analyse déjà précisées. Cinq répétitions ont été faites et le k utilisé est la moyenne des 5 coefficients de réponse trouvés. Le coefficient de réponse K est calculé = en utilisant la formule suivante : K ..
K=coefficient de réponse du composé à doser
Ae= aire du pic de l’étalon interne en unité d’intégrateur
Ar= aire du pic de la substance de référence en unité d’intégrateur
Mr= masse de la substance de référence exprimée en mg
Me= masse de l’étalon interne exprimée en mg
Cinq répétitions ont été faites et la moyenne utilisée pour calculer la concentration en 1,8-cinéole des échantillons d’huiles essentielles.
Comme énuméré dans la méthode AFNOR NF 75-404 la concentration en cinéole est calculée suivant la formule : = K x . . . x100 exprimée en mg/g d’He.
Cx= concentration du composé à doser.
K= facteur de réponse du composé à doser.
Ax=aire intégrée par le composé à doser.
Me= masse de l’étalon interne utilisé.
Ae= aire intégrée par l’étalon interne.
Mhe= masse d’huile essentielle exprimée en mg.

Table des matières

NTRODUCTION
CHAPITRE I GENERALITES SUR LES HUILES ESSENTIELLES
I.1 Historique
I.2 Définitions
I.3 Présentation des plantes à huiles essentielles et ses parties utiles
I.4 Propriétés des huiles essentielles
I.5 Composition chimique des huiles essentielles
I.5.1 Notion de chémotype
I.5.2 Composition en substances terpéniques
I.5.3 Biosynthèse des terpènes
I.6 Méthodes d’extraction des huiles essentielles
I.6.1 L’expression
I.6.2 Extraction par CO2 supercritique
I.6.3 Les méthodes de distillation
I.7 Méthode de caractérisation des huiles essentielles
CHAPITRE II MATERIEL ET METHODES
II.1 Présentation du matériel biologique
II.2. Matériel végétal
II.3. Matériel de distillation
II.3.1.Conditions opératoires de distillation
II.3.2.Calcul du rendement
II.4.Détermination de la composition chimique des huiles essentielles
II.4.1 Conditions opératoires de la Chromatographie en phase gazeuse couplé à un détecteur à ionisation de flamme CPG/FID
II.4.2.Conditions opératoires de la Chromatographie en phase gazeuse couplée à une spectrométrie de masse CPG/MS
II.4.Dosage du 1,8-cineole
CHAPITRE III RESULTATS ET DISCUSSIONS
III.1 Extraction et rendement des huiles essentielles
III.2 Composition chimique des huiles essentielle obtenues
III.3.Concentration en 1.8-cineole des échantillons
III.3.1.Calcul du coefficient de réponse K
III.3.2. Concentration en 1.8cineole
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
BIBLIOGRAPHIE
WEBOGRAPHIE

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