Conditions de dosage en HPLC-MS/MS au CHU de Caen 

Effets biologiques de la testostérone

Action sur l’axe gonadotrope

Fonction exocrine et endocrine

Les fonctions endocrines et exocrines des ovaires et des testicules sont sous le contrôle de l’axe gonadotrope, dont le principal régulateur est le décapeptide hypothalamique GnRH. Les neurones à GnRH, présents en petit nombre au niveau hypothalamique, sécrètent cette hormone de façon pulsatile en réponse à différentes stimulations endogènes et exogènes. La fréquence et l’amplitude des « pulses » de GnRH, véhiculés jusqu’à l’antéhypophyse par le système porte hypothalamohypophysaire, déterminent la réponse des cellules gonadotropes antéhypophysaires. La GnRH stimule la biosynthèse des gonadotrophines LH et FSH et leur sécrétion dans la circulation générale, entrainant l’activation des deux fonctions principales des gonades que sont la gamétogenèse et la production hormonale stéroïdienne et peptidique.
La fonction exocrine assure la spermatogénèse à partir des cellules germinales, dans la paroi des tubes séminifères.
La fonction endocrine assure quant à elle la sécrétion de la testostérone par les cellules de Leydig. La concentration de testostérone est maintenue globalement constante grâce à un équilibre dynamique entre l’activité sécrétoire du testicule et la dégradation progressive de l’hormone.
Ces deux fonctions du testicule permettent ainsi les fonctions de reproductionde l’homme.

Différenciation sexuelle

La testostérone participe également à différents processus tels que la différenciation sexuelle du fœtus et le développement des caractères secondaires sexuels primaires. Elle entraine aussi l’apparition des caractères sexuels secondaires à la puberté (augmentation du volume et pigmentation des organes génitaux, apparition de la pilosité, développement de la prostate, des vésicules séminales et du larynx, mue de la voix, développement de la musculature, apparition de la libido, maintien de la spermatogénèse…) (Figure 9)

Effets métaboliques

La testostérone est une hormone qui joue un rôle clé dans le métabolisme des glucides, des lipides et des protéines. Elle stimule notamment l’hématopoïèse et l’anabolisme protidique, et diminue le catabolisme des Acides Aminés (AA). Elle régule le métabolisme glucidique en augmentant la glycogénogénèse et en freinant la glycolyse.

Variations physiopathologiques

Variations physiologiques

A la naissance, les concentrations de la testostérone totale sont plus élevées chez le garçon dans le sang périphérique que dans le sang du cordon. En revanche chez la fille, c’est l’inverse qui est observé. Les concentrations baissent ensuite chez les deux sexes. A partir du quinzième jour, elles remontent chez le garçon pouratteindre un pic au cours du deuxième ou troisième mois, d’une manière parallèle à la LH.
Par la suite, la testostérone reste à des concentrations faibles dans les deux sexes jusqu’à l’apparition de la puberté (Figure 10).

Variations pathologiques

Déficit en testostérone (hypotestostéronémie)

Des concentrations faibles de testostérone peuvent orienter vers un diagnostic de retard pubertaire d’une part ou d’un hypogonadisme d’autre part.
L’hypogonadisme est défini par un déficit en testostérone avec des symptômes associés et/ou une diminution de la production de spermatozoïdes. Il peut résulter d’une anomalie des testicules (hypogonadisme secondaire, périphérique) ou d’un trouble de l’axe hypothalamo-hypophysaire (hypogonadisme primitif, central), tous deux pouvant être congénitaux ou acquis (vieillissement, maladie, médicaments ou autres facteurs). Le diagnostic différentiel entre hypogonadisme primitif et secondaire se fait par dosage de la LH : elle est diminuée ou normale dans le premier cas et augmentée dans le second.

Dosage de la testostérone : indications et méthodes

Indications du dosage de la testostérone

Le dosage de la testostérone est préconisé pour l’exploration des virilismes et des hirsutismes chez la femme. Chez l’homme, il est indiqué dans l’étude des ambiguïtés sexuelles, des troubles pubertaires et des troubles sexuels. Il est également utile dans les deux sexes dans le cadre de tumeurs testiculaires ou ovariennes, ou d’infertilité.

Recommandations pré-analytiques

Le prélèvement sanguin sur un tube sec, avec activateur de la coagulation et sans gel séparateur, est effectué de préférence le matin et doit l’être chez un patient à jeun si la testostérone biodisponible est dosée.

Dosage par HPLC-MS/MS

Pour ce travail, nous nous sommes appuyés sur une technique de Chromatographie Liquide à Haute Performance associée à la spectrométrie de masse en tandem (HPLC-MS/MS) sur automate QTRAP®5500 (Sciex®) (Figure 11), appliquée en routine au Laboratoire du CHU de Caen. Cette méthode est actuellement considérée comme le gold standard pour le dosage de la testostérone sérique, et sera donc définie comme référence pour notre travail.
La technique d’HPLC−MS/MS est une méthode analytique couplant une séparation chromatographique des anaIytes par HPLC, avec une identification des analytes par spectrométrie de masse en tandem (MS/MS).

Principe de la Chromatographie Liquide Haute

Performance (HPLC)

La chromatographie est une méthode de séparation des constituants d’un mélange. En chromatographie liquide, les composés à séparer (solutés) sont mis en solution dans un solvant liquide adéquat, puis injectés dans le système chromatographique. Une phase mobile liquide, ou éluant, est poussée par une pompe sous haute pression et parcourt le système chromatographique. Les composés en solution se répartissent alors suivant leur affinité pour cette phase mobile et la phase stationnaire (colonne chromatographique).
En sortie de colonne, un détecteur adapté aux molécules à doser permet d’obtenir un tracé nommé chromatogramme (constitué d’un ensemble de pics correspondant aux composés détectés) (Figure 12).

Détection

La dernière étape correspond à la détection des ions sélectionnés. La conversion du courant ionique arrivant au détecteur à chaque temps t en courant électrique permet de mesurer une intensité en coups/minute.
Par conséquent, l’HPLC−MS/MS permet d’obtenir une grande spécificité pour les analytes à doser.
Le graphique représentant l’intensité des ions en fonction de leur rapport m/z est appelé spectre de masse.

Valeurs de références (CHU Caen)

Les valeurs de références de testostérone varient en fonction de l’âge, du sexe et du stade pubertaire. A la puberté, elles sont ainsi basées sur l’échelle de maturité de Tanner qui évalue cliniquement l’évolution pubertaire pour aboutir à un classement en cinq stades.
Cette échelle inclut le développement des organes génitaux chez les garçons et le développement mammaire chez les femmes, ainsi que le développement de la pilosité pubienne dans les deux sexes.
Ces valeurs de référence ont été publiées en 2010 et établies selon le protocole suivant : des échantillons sanguins ont été prélevés avant une intervention chirurgicale mineure ou pour l’exclusion de maladies endocriniennes, après recueil du consentement éclairé des patients. Ces derniers ne présentaient aucun signe de maladie endocrinienne ou systémique et ne prenaient aucun médicament stéroïdien.
L’échantillon de sang veineux périphérique a été prélevé par ponction veineuse en décubitus dorsal le matin entre 8h et 10h. Au total, 138 enfants garçons et 131 enfants filles ont été inclus afin d’établir ces valeurs normatives, avec une répartition par âge la plus homogène possible (Tableau 3).

MATERIEL ET METHODE

Conditions de dosages pour le kit évalué

Cette étude a été réalisée à partir d’échantillons de sérum et/ou de plasma provenant de la biobanque du CHU de Caen, frais ou conservés congelés à une température ≤ – 15°C.
Lors de ce travail, les calibrants ont été fournis par la société Fujirebio®. Un total de six calibrants liquides, prêts à l’usage, de différentes concentrations (de 0 à 16 ng/mL) a été utilisé. Ils sont composés d’azide de sodium utilisé comme conservateur, additionné à du sérum humain prétraité. Il est nécessaire de laisser revenir les calibrants à température ambiante (15-25°C) puis de les homogénéiser par inversion douce avant utilisation. Leur conservation ne peut excéder un mois à +4°C (+2°C) pour un lot de cartouche avec un lot de substrat donné. Ces calibrants sont traçables par des calibrants de référence, dont les valeurs ont été reliées à la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse. La calibration en six points est basée sur une courbe obtenue par mesure en double.
Le substrat a également été fourni par Fujirebio® et se compose de 0,2 mg/mL d’AMPPD (3-(2′-spiroadamantyl)-4-methoxy-4-(3″-phosphoryloxy)-phenyl-1,2-dioxetane) dans un tampon de diéthanolamine et avec un stabilisateur chimique. De même que pour les calibrants, l’azide de sodium est utilisé comme conservateur.
Les cartouches immunoréactives contiennent une solution de particules sensibilisées avec de la testostérone et une solution d’anticorps marqués à l’enzyme.
Plusieurs Contrôles Internes de Qualité (CIQ) lyophilisés, fournis par Fujirebio®, ont été utilisés afin de valider les séries de dosages. Ils peuvent être conservés un mois à +4°C (+2°C) après reconstitution par le volume adéquat de solvant fourni dans le kit. Pour valider chaque série de dosages, nous avons passé deux fois chaque niveau de CIQ (niveau 1 : niveau élevé et niveau 2 : niveau bas) : une première fois au début et une seconde fois à la fin de chaque série. Chaque série a été validée par des valeurs de CIQ comprises dans les intervalles d’acceptabilité (Tableau 7).
Concernant la préparation des échantillons, nous avons utilisé des échantillons conservés en enceinte thermostatée contrôlée entre 2 et 10 °C ou congelés à -20 °C pendant un maximum de 14 jours, et en évitant les congélations/décongélations répétées. Les échantillons chargés à bord du système Lumipulse G600II devaient être testés dans les 2 heures maximum. Seuls des échantillons humains sériques ou plasmatiques (sur tubes enduits d’héparinate de lithium ou de sodium) peuvent être acceptés.
Le volume d’essai par échantillon diffère selon le contenant employé, de par des variations de volume mort : 100 μL pour les cuvettes Lumipulse et 250 μL pour les tubes à hémolyse. C’est pourquoi il est nécessaire de disposer d’un volume total d’échantillon par essai supérieur à 130 μL pour les cuvettes et 280 μL pour les tubes à hémolyse.
La plage de mesure de l’analyse s’étend de 0,15 ng/mL à 16 ng/mL. Lorsque la concentration de testostérone dans les échantillons excède 16 ng/mL, on peut procéder à une dilution dans le diluant approprié fourni (nommé diluant d’échantillon 3) avant de réaliser une nouvelle mesure.
Le taux de testostérone d’un échantillon est déduit automatiquement de la courbe d’étalonnage, tracée à partir des données d’étalonnage. Le résultat du calcul est exprimé en ng/mL.

Conditions de dosage en HPLC-MS/MS au CHU de Caen

Préparation des calibrants

Pour le dosage de la testostérone, sept flacons de calibrants contenus dans le kit Perkin Elmer CHS TM MSMS Steroids Kit sont reconstitués avec de l’eau de qualité LC-MS. Des aliquots de 100 µl sont préparés dans des cônes Eppendorf, permettant une durée de conservation de deux mois à -20°C (±5°C).

Préparation des étalons internes

Les flacons d’étalons internes contenus dans le kit Perkin Elmer CHS TM MSMS Steroids Kit sont reconstitués par de l’acétonitrile de qualité LC-MS et leur durée de conservation est également de deux mois à -20°C (±5°C). L’étalon interne utilisé pour le dosage de la testostérone est une testostérone à laquelle 5 deutérium 2 H ont été greffés (Figure 20).

Sensibilité analytique

Concernant la sensibilité analytique, la limite de Blanc (Limit of Blank LoB) est définie comme la concentration apparente la plus élevée de l’analyte que l’on peut s’attendre à trouver lorsque des répliques d’un échantillon dit « blanc » (dépourvu d’analyte) sont testés. La limite de detection (Lower Limit of Detection LLoD) désigne la plus faible concentration d’analyte susceptible d’être distinguée de manière fiable de la LoB et à laquelle la détection est possible. La limite de quantification (Lower Limit of Quantification LLOQ) est quant à elle définie comme la plus faible concentration pour laquelle une valeur quantitative peut être déterminée. Elle peut donc être équivalente à la LLoD ou bien être plus élevée.
La limite de détection LLoD annoncée par le fournisseur est de 0,0573 ng/mL, fixée conformément aux directives du protocole CLSI EP17-A2 . Selon les recommandations du SH-GTA 04 , pour estimer la limite de détection, il est possible d’effectuer 30 mesures répétées d’échantillons dits « blancs » (dépourvus d’analyte à doser) au cours d’une même série, et ensuite de calculer l’écart type (sb) de ces 30 mesures. La limite de détection peut alors être calculée selon la formule suivante : LLoD = 3 x Sb. Nous verrons par la suite dans ce travail que nous avons déterminé ce paramètre selon une autre méthode.

Fidélité intermédiaire et reproductibilité

L’essai de fidélité intermédiaire (reproductibilité intra-laboratoire) consiste à analyser un même échantillon dans des conditions différentes en faisant varier au moins un des facteurs (l’opérateur, le temps, les lots de réactifs, les étalonnages). Il permet de paramétrer les critères d’acceptation des antériorités en combinaison avec les variations biologiques notamment dans le cas de systèmes d’aides à la décision.
Lors de ce travail, les CIQ ont été passés deux fois pour chacune des séries de dosages (une fois avant et une fois après le passage des patients).

Linéarité dans les valeurs basses

La limite de linéarité dans les valeurs basses correspond au plus bas niveau de mesure considéré comme fiable et pouvant être utilisé en tenant compte de tous les facteurs à considérer dans la méthode. Ici, ce paramètre a été estimé par dilutions en série de deux pools d’échantillons faiblement titrés : un pool de trois échantillons prélevés chez des enfants filles et un autre de deux échantillons prélevés chez des enfants garçons. L’utilisation de deux pools d’échantillons et non d’un seul sérum se justifie par un volume d’essai nécessaireimportant pour cette étude. Chaque dilution de chaque pool a été analysée en double.

Test de surcharge

Un test de surcharge consiste à ajouter à un échantillon sérique faiblement concentré (X0) des quantités connues de testostérone (Qi). La courbe représentative de la concentration observée (Xi) en fonction de X0+Qi est une droite, de pente égale à l’unité, passant par l’origine en l’absence d’erreur systématique.
L’impact de notre surcharge a initialement été évalué d’une part en dosant la gamme de calibrant LC/MS-MS en testostérone sur le Lumipulse® G600II et d’autre part en surchargeant un sérum faiblement dosé avec ces calibrants . Les valeurs obtenues pour les dosages des calibrants LC/MS-MS étant incohérents, nous avons procédé à plusieurs surcharges d’un échantillon faiblement dosé par un autreéchantillon fortement dosé en testostérone.

RESULTATS

Evaluation de la limite de blanc LoB

Une première évaluation de la limite de blanc a été réalisée mais les comptages corrigés du calibrant 0 étaient tous supérieurs au comptage du calibrant 0 de la courbe d’étalonnage. Ils étaient donc considérés <0 ng/mL et donc non exploitables.
Une seconde évaluation de la limite de blanc a donc été refaite à la demande de la société Fujirebio® et a permis d’obtenir 14 valeurs exploitables, de moyenne 0,038 ng/mL et d’écart-type 0,020 ng/mL. La limite de blanc a donc été calculée selon la formule précédemment citée (page 38) et correspond à 0,070 ng/mL.

Evaluation des limites de détection et de quantification

La limite de détection LLoD a été déterminée selon le protocole précédemment décrit dans ce travail (page 39). Pour les 20 mesures de notre échantillon de concentration théorique 0,014 ng/mL, nous avons obtenu un écart-type SDéchantillon à faible concentration de 0.009 ng/mL, nous permettant de fixer la LLoD de ce kit à 0,079 ng/mL.

Test de surcharge

Un test de surcharge d’un échantillon faiblement dosé en testostérone (<0,1 ng/mL) par un échantillon fortement dosé (4,43 ng/mL) a été réalisé afin de déterminer le taux de recouvrement d’une surcharge en matrice sérique.
Les graphiques en Figure 25 a), b) et c) permettent de visualiser respectivement, pour chaque niveau de surcharge (« concentration attendue »), la concentration mesurée, le taux de recouvrement et le pourcentage de variation, calculés selon les formules précédemment citées (page 40). a)

DISCUSSION

Comparaison avec les données annoncées par le fournisseur

Lors de notre étude, nous avons établi la limite de blanc à 0,070 ng/mL. Nous avons également conclu que la limite de quantification calculée (0,13 ng/mL) est comparable à la limite de quantification annoncée par le fournisseur Fujirebio® (0,0573 ng/mL).
Concernant l’appréciation de la fidélité intermédiaire, nous avons constaté que la variabilité des résultats exprimée en CV% est satisfaisante pour une technique de dosage immunologique, et ce pour les deux CIQ. Par ailleurs, les CV% que nous avons déterminés sont proches des données de reproductibilité annoncées par Fujirebio® (CV% annoncé de 5,4% et 9,6% pour le CIQ bas et 7,6% Vs 4,82% pour le CIQ haut).
Pour le CIQ niveau 2, le CV% de 9.60% est un peu plus important que celui constaté lors des essais du fournisseur. Ceci peut s’expliquer par le fait qu’il s’agit du CIQ de bas niveau, qui présente habituellement une variabilité plus élevée que le CIQ haut niveau, ce pour la majorité des techniques de dosages. Par ailleurs, durant notre étude, l’ensemble des valeurs obtenues lors des dosages de CIQ était compris dans les intervalles des valeurs acceptables renseignés par le fournisseur, sans constatation d’un biais ou d’une dérive particulière au cours du temps.
Concernant la linéarité dans les valeurs basses, celle-ci peut être considérée comme acceptable, ce quel que soit le sexe, avec des coefficients de corrélation R² supérieurs à 0.99 et des pentes de droites proches de 1.

Table des matières
Table des illustrations 
Abréviations 
Introduction
I. Définition et structure chimique de la testostérone 
II. Différentes fractions dosables de la testostérone 
1. Testostérone totale
2. Testostérone biodisponible
3. Testostérone libre
III. Métabolisme de la testostérone
1. Etapes de la synthèse
2. Régulation de la synthèse de testostérone
3. Transport plasmatique
4. Métabolisme
5. Mécanisme d’action sur le récepteur des androgènes
IV. Effets biologiques de la testostérone 
1. Action sur l’axe gonadotrope
2. Effets métaboliques
V. Variations physiopathologiques
1. Variations physiologiques
2. Variations pathologiques
VI. Dosage de la testostérone : indications et méthodes 
1. Indications du dosage de la testostérone
2. Recommandations pré-analytiques
3. Dosage par HPLC-MS/MS
4. Dosage par Immuno-chimioluminescence
Objectif de ce travail 
Matériel et methode 
I. Conditions de dosages pour le kit évalué
II. Conditions de dosage en HPLC-MS/MS au CHU de Caen 
1. Préparation des calibrants
2. Préparation des étalons internes
3. Préparation des contrôles de qualité internes (CIQ)
4. Préparation des réactifs
III. Données de performance établies par le fournisseur Fujirebio® 
1. Répétabilité et Fidélité intermédiaire
2. Sensibilité analytique
3. Interférences analytiques
4. Linéarité du dosage
5. Comparaison de méthodes
IV. Protocole d’évaluation du kit de dosage Lumipulse® 
1. Evaluation de la limite de blanc LoB
2. Evaluation des limites de détection et de quantification
3. Fidélité intermédiaire et reproductibilité
4. Linéarité dans les valeurs basses
5. Test de surcharge
6. Comparaison de méthodes avec la LC-MS/MS
Resultats 
I. Evaluation de la limite de blanc LoB
II. Evaluation des limites de détection et de quantification
III. Fidélité intermédiaire et reproductibilité
IV. Linéarité dans les valeurs basses
V. Test de surcharge
VI. Comparaison de méthodes avec la LC-MS/MS
Discussion 
I. Comparaison avec les données annoncées par le fournisseur
II. Comparaison avec les données d’une étude préliminaire Brestoise
III. Quel positionnement pour l’utilisation en routine de ce kit ?
1. Difficultés des techniques immunologiques
2. Positionnement du kit Fujirebio® sur le marché actuel des immunoanalyses
Conclusion
Références bibliographiques

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