Conception des pro-drogues à base de cyclodécapeptide (Chel1) et de NTA (Chel2 à Chel6) 

Introduction

Cuivre & Maladie de Wilson

En 1912, Samuel Alexander Kinnier Wilson publie pour la première fois dans Brain un article dans lequel il décrit une « dégénérescence lenticulaire progressive ».
Ses recherches portent alors sur l’étude d’une maladie nerveuse familiale associée à une cirrhose du foie. Avec seulement 4 patients dans cette publication originale, Wilson décrit la majorité des symptômes connus aujourd’hui et caractéristiques de la maladie de Wilson (Wilson’s Disease, WD). Les 30 années suivantes ont quant à elles permis une meilleure compréhension de la maladie, une plus grande efficacité de diagnostic et le développement de nouveaux traitements.
Le cuivre, au cœur de la maladie de Wilson, s’accumule à un niveau toxique dans l e foie et dans le cerveau. Il est à l’origine des symptômes hépatiques et neurologiques. Afin d’avoir une meilleure compréhension des phénomènes impliqués dans la maladie de Wilson, il est dans un premier temps nécessaire de connaitre la chimie du cuivre ainsi que les mécanismes impliqués dans son homéostasie.

Biologie du cuivre

Le cuivre

Le cuivre est un élément essentiel à tous les organismes. Souvent impliqué en tant que cofacteur, il est nécessaire au fonctionnement de plus de 30 protéines telles que la céruloplasmine (Cp) ou la superoxyde dismutase cytosolique (SOD1). Il participe à d’importants processus cellulaires notamment le métabolisme énergétique, la défense contre le stress oxydant ou encore le métabolisme du fer. Le cuivre est le 3 ème métal de transition le plus abondant dans le corps humain, précédé par le zinc et le fer.
De configuration [Ar] 3d , il est présent sous deux états d’oxydation : l’ion cuivrique Cu(II) et l’ion cuivreux Cu(I). Ces différents états d’oxydation lui confèrent des propriétés oxydo -réductrices, à l’origine de son activité catalytique.
A cause de son activité redox, le cuivre peut être toxique pour les cellules. Il participe aux réactions de type Fenton entrainant la formation du radical hydroxyle OH•, une espèce réactive de l’oxygène (ROS) (Figure 1). Ce radical extrêmement réactif peut réagir avec les biomolécules environnantes et peut notamment entrainer des mutations ou des cassures de l’ADN ou des peroxydations des membranes lipidiques.

Homéostasie du cuivre

Essentiellement apporté par l’alimentation, l’estomac absorbe chaque jour entre 1,5 et 2,5 mg de cuivre.
Il est ensuite lié sous sa forme Cu(II) à des protéines, des peptides ou des acides aminés tels que l’albumine, dans des domaines contenant des histidines. Il est ensuite acheminé jusqu’au foie où il sera redistribué dans tout l’organisme via la circulation sanguine. L’excès de cuivre est quant à lui excrété majoritairement dans les canalicules biliaires (Figure 2).

Cerveau

Le cuivre est indispensable au développement et au fonctionnement du cerveau. Il e st nécessaire comme cofacteur pour de nombreuses enzymes impliquées dans des processus vitaux du système nerveux central comme la respiration, la synthèse de neurotransmetteurs, la protection des dommages oxydatifs… La proportion en cuivre dans le cerveau humain adulte est estimée à 7-10% de la quantité totale dans l’organisme, semblable à celle du foie. La quantité de cuivre diffère selon les régions et reflète les différents besoins métaboliques.
A titre d’exemple, l’apport en cuivre dans l’hippocampe (95,0 ± 23,4 µL/sec/g) est significativement plus élevé que dans le cervelet (43,4 ± 8,1 µL/sec/g) selon une étude de Choi et al.
Les mécanismes de transport du cuivre n’ont pas encore été totalement élucidés. Néanmoins l’échange du cuivre entre la périphérie et le cerveau est fortement régulé par les barrières cérébrales.
Le cuivre libre, non lié aux protéines comme l’albumine ou à la céruloplasmine, est l’espèce du cuivre prédominante qui traverse la barrière hémato-encéphalique (BHE) et la barrière sang–LCR (liquide céphalorachidien).
De plus, le taux de cuivre plus important dans le parenchyme cérébral par rapport au liquide céphalorachidien (LCR) retrouvé après perfusion cérébrale chez le rat, suggère que la BHE est la principale voie d’entrée du cuivre dans le cerveau.
Cette barrière composée de cellules endothéliales séparées par des jonctions serrées, des péricytes, des cellules musculaires lisses, et les pieds astrocytaires, tapisse les parois des vaisseaux sanguins et régule finement les échanges sang cerveau (Figure 4).

Maladie de Wilson

Définition et épidémiologie

La maladie de Wilson est l’une des principales anomalies génétiques du métabolisme du cuivre chez l’Homme. Elle est provoquée par des mutations du gène atp7b codant pour la protéine du même nom. Comme décrit précédemment (Cf Ch I.1.2.1), cette protéine est en charge de la distribution et de l’excrétion du cuivre. Comme elle ne remplit plus correctement ses fonctions, une surcharge en cuivre apparait alors principalement au niveau du foie et du cerveau. Les malades développent alors deux types de syndromes principaux : hépatiques (cirrhoses, hépatites) et neurologiques (dysarthrie, dystonie, syndromes dépressifs). Les symptômes hépatiques apparaissent généralement chez l’enfan t vers l’âge de 4-5 ans alors que les symptômes neurologiques sont généralement plus tardifs etapparaissent vers l’âge de 20-25 ans. Les signes cliniques de la maladie ne sont pas visibles plus tôt car l’accumulation toxique de cuivre dans le foie ou le cerveau prend plusieurs années.
Les estimations mondiales concernant le nombre de personnes touchées par la maladie ne cessent d’être revues à la hausse. En 1968, date de la première estimation mondiale, la prévalence de la maladie de Wilson était de 5 naissances sur 1 million.
En 1981, cette valeur a atteint les 33/million.
Aujourd’hui, on estime que la fréquence est de 142 naissances sur 1 million.
En France, une première étude épidémiologique menée par F. Woimant en 2016 avait permis de recenser 906 cas de patients atteints de la maladie de Wilson, soit une prévalence de 14/million.
Pendant de nombreuses années et encore maintenant, les études épidémiologiques sous-estiment le nombre de personnes atteintes par la maladie de Wilson car il ne prend pas en compte les patients pour lesquelles le diagnostic n’a pas été établi et ceux n’ayant que peu ou pas de symptômes. Un perfectionnement des méthodes de diagnostic et du dépistage de cette maladie permet, au fil du temps, d’améliorer ce recensement.

Génétique

Dans le cadre de la maladie de Wilson, les mutations génétiques concernent le gène atp7b codant pour la protéine ATP7B. C’est aujourd’hui le seul gène connu impliqué dans la maladie. On ne parle d’ailleurs pas de « la » mutation mais « des » mutations, environ 600 ayant été identifiée à ce jour.
La maladie de Wilson est dite « autosomique récessive ». « Autosomique » signifie que le gène muté, à l’origine de la maladie, n’est pas porté par un chromosome sexuel. La maladie touche donc équitablement les femmes et les Hommes. Ensuite, elle est dite « récessive » car il est nécessaire que les 2 allèles du gène soient mutés pour que la maladie se manifeste. Dans le cas où les deux parents portent l’allèle muté sur un seul chromosome, seuls les enfants ayant reçu le gène muté des deuxparents sont malades. La probabilité d’avoir un enfant atteint de la maladie est de 1 chance sur 4 pour chaque grossesse (Figure 5). De plus, la majorité des personnes atteintes de la WD sont hétérozygotes composites, c’est-à-dire qu’elles possèdent 2 allèles mutés différents.

Sels de zinc

C’est en 1961, dans sa thèse de doctorat, que le neurologue néerlandais Schouwink a envisagé pour la première fois les sels de zinc comme traitement alternatif à la maladie de Wilson ( Figure 21). Ces sels de zinc sont généralement sous forme d’acétate, du sulfate ou encore du gluconate de zinc ; l’acétate et le gluconate étant mieux tolérés que le sulfate. Ils sont administrés par voie orale à raison de 150 mg de zinc élémentaire chez l’adulte répartis en 2 à 3 doses par jour.

Récents développements

Tétrathiomolybdate d’ammonium (TTM)

Le molybdène est un élément naturel présent dans les sols. Avant d’être administré chez l’ Homme, il était connu de la médecine vétérinaire.
Dans les années 50, certains pâturages rendaient le bétail malade, causant parfois leur mort. Des études ont alors révélé que la présence de molybdène dans les herbages était associée à des insuffisances en cuivre chez des moutons qui paissaient dans ces pâturages.
En 1957, Il a donc été postulé que le molybdène sous sa forme de sel d’ammonium pouvait être utilisé dans le traitement de la maladie de Wilson en tant que décorporant du cuivre.
Cependant le molybdate n’a pas montré de résultat probant et les essais cliniques ont été stoppés au bout de 2 mois. Il a par la suite été montré que les moutons pâturaient dans des champs riches en soufre et que, au niveau de leur estomac (environnement réducteur), le molybdate était converti en tétrathiomolybdate (TTM). Cette molécule a donc été identifiée comme un puissant décorporant du cuivre. Contrairement aux moutons, l’estomac humain n’est pas capable de réduire le molybdate en TTM et le molybdate ne possède aucune propriété chélatrice du cuivre.
Après la D-Pen et la trientine, Walshe a obtenu en 1986 quelques grammes de TTM et se l’est lui mêmeadministré pendant 4 jours. Le composé n’étant pas toxique, il l’a donné oralement à l’un de ses patients atteint de la WD ne répondant pas aux traitements classiques.
Après 1 an sous TTM, son foie était redevenu normal.

Nanomedecine & Nanoparticules

Introduction

 » There’s plenty of room at the bottom »

Dans son discours de 1959, Richard Feynman évoquait ainsi la miniaturisation, ou comment la physique et le contrôle des atomes pouvaint servir la chimie et la biologie. Ce concept visionnaire a vu le jour quelques années plus tard avec le développement des premiers nanomatériaux.
En 2011, la commission européenne a publié une définition de ces nanomatériaux : « On entend par «nanomatériau» un matériau naturel, formé accidentellement ou manufacturé contenant des particules libres, sous forme d’agrégats ou d’agglomérats, dont au moins 50 % des particules, dans larépartition numérique par taille, présentent une ou plusieurs dimensions externes se situant entre 1nm et 100 nm ».

Nanoparticules organiques

Les nanoparticules organiques les plus courantes sont les nanoparticules polymériques, les dendrimères et les nanoparticules lipidiques. Elles sont généralement de tailles plus importantes que les nanoparticules inorganiques (> 30 nm). De par leur structure, ces nano-objets permettent l’encapsulation de médicaments et ainsi un meilleur contrôle de leur délivrance. Ceci a notamment permis d’améliorer de façon significative l’efficacité thérapeutique et de limiter les effets secondaires de médicaments déjà approuvés.
Deux types de nanoparticules organiques, les nanoparticules polymériques et les dendrimères, sont présentées ci-dessous. Les nanoparticules lipidiques : liposomes, nanoparticules solides, nanocapsules lipidiques et les transporteurs lipidiques nanostructurés qui ont été utilisés au cours de cette thèse feront l’objet d’une partie plus détaillée allant de leur structure à leur intérêt pour l’encapsulation etla vectorisation de principe actif.

Table des matières
I. INTRODUCTION
CUIVRE & MALADIE DE WILSON
1. BIOLOGIE DU CUIVRE
1.1 Le cuivre
1.2 Homéostasie du cuivre
1.2.1. Foie
1.2.2. Cerveau
2. MALADIE DE WILSON
2.1 Définition et épidémiologie
2.2 Génétique
2.3 Pathogénèse
2.3.1. Foie
2.3.2. Cerveau
2.4 Diagnostic et symptômes
2.4.1. Signes physiques et présentation clinique
2.4.2. Diagnostic Génétique
2.4.3. Paramètres biologiques
2.4.4. Mise en place du diagnostic
3. TRAITEMENTS
3.1 Chélateurs actuellement utilisés
3.1.1. D-penicillamine
3.1.2. Trientine
3.2 Sels de zinc
3.3 Récents développements
3.3.1. Tétrathiomolybdate d’ammonium (TTM)
3.3.2. DPM-1001
3.3.3. Autres traitements d’intérêt en développement
4. TRAVAUX ANTERIEURS EFFECTUES AU LABORATOIRE SYMMES
4.1 Du vivant aux chélateurs de cuivre efficaces et sélectifs
4.1.1. S’inspirer du vivant
4.1.1. Chélateurs cyclodécapeptides
4.1.2. Chélateur NTA(CysNH2)3
4.2 Vectorisation de chélateurs vers les hépatocytes
4.2.1. ASGPR cible de choix pour la vectorisation vers les cellules hépatiques
4.2.2. Conception des pro-drogues à base de cyclodécapeptide (Chel1) et de NTA (Chel2 à Chel6)
4.2.3. Internalisation dans les cellules hépatiques et chélation du cuivre
NANOMEDECINE & NANOPARTICULES
1. INTRODUCTION
2. LES NANOPARTICULES UTILISEES EN NANOMEDECINE
2.1 Nanoparticules inorganiques
2.1.1. Nanoparticules d’or
2.1.2. Quantum Dots
2.2 Nanoparticules organiques
2.2.1. Nanoparticules polymériques
2.2.2. Dendrimères
2.3 Nanoparticules lipidiques
2.3.1. Les Liposomes
2.3.2. Nanoparticules Lipidiques Solides (SLN)
2.3.3. Nanocapsules lipidiques
2.3.4. Transporteurs lipidiques nanostructurés
2.3.5. Résumé
3. TRAVAUX ANTERIEURS AU LABORATOIRE DTBS SUR LES NLC
3.1 Composition, formulation & structure
3.2 Encapsulation
3.3 Biodistribution
3.4 Toxicité
3.5 Fonctionnalisation
3.5.1. Fonctionnalisation par un anti-gène
3.5.2. Fonctionnalisation par un peptide cyclique (cRGD)
OBJECTIFS DU PROJET DE THESE
CH II. FONCTIONNALISATION DE NANOPARTICULES LIPIDIQUES PAR DES MOTIFS GALNAC POUR LA DELIVRANCE VERS LE FOIE 
FONCTIONNALISATION PAR DES MOTIFS GALNAC ET QUANTIFICATION
1. OBJECTIFS ET DEMARCHE
2. FORMULATION DES NLC FONCTIONNALISEES PAR DES GALNAC
2.1 Stratégie
2.2 Synthèse du surfactant SA-PEG100 fonctionnalisé par un GalNAc
2.2.1. Synthèse du SA-PEG100-maleimide
2.2.2. Synthèse du GalNAc-SSPy 6
2.2.3. Couplage
2.3 NLC – Formulation et caractérisation
2.3.1. Formulation
2.3.2. Caractérisation des NLC
3. QUANTIFICATION DES MOTIFS GALNAC A LA SURFACE DES NLC
3.1 Optimisation de la méthode de séparation
3.1.1. Appareillage et méthodes
3.1.2. Analyse de chaque constituant
3.2 Calibration des surfactants PEGylés
3.2.1. SA-PEG100-GalNAc 10
3.2.2. Myrj TM S40
3.2.3. Destruction des nanoparticules
3.2.4. Analyse du surnageant
3.2.5. Analyse des précipités
3.3 Quantification des surfactants PEGylés
3.4 Densité de surface en ligand GalNAc
4. CONCLUSION
EVALUATION DE L’INTERACTION DE NANOPARTICULES FONCTIONNALISEES AVEC DES CELLULES HEP ATIQUES
1. OBJECTIFS ET DEMARCHE
2. ETUDE DE L’EFFICACITE D’INTERNALISATION PAR CYTOMETRIE EN FLUX
2.1 Cytométrie en flux
2.1.1. Principe & Appareillage
2.1.2. Données collectées & exploitation
2.1.3. Analyse des données
2.1.4. Sélection & Réglages
2.2 Choix du type cellulaire, des nanoparticules et du fluorophore
2.2.1. Cellules
2.2.2. Nanoparticules
2.2.3. Fluorophore
2.3 Mise au point des expériences de cytométrie en flux
2.3.1. Expérimentation FACS
2.3.2. Evaluation des résultats
2.4 Expérience & résultats
2.4.1. Toxicité des nanoparticules
2.4.2. Saturation des récepteurs des cellules HepG2
2.5 Conclusion
3. EVALUATION DE L’ACCESSIBILITE DES LIGANDS GALNAC A LA SURFACE DES NLC PAR RESONANCE DE PLASMONS DE SURFACE
3.1 La résonance de plasmons de surface
3.1.1. Principe
3.1.2. Choix des lectines et établissement des voies
3.1.3. Acquisition des résultats
3.2 Mise au point de l’expérience
3.2.1. Fonctionnalisation de la surface de dextran
3.2.2. Contrôles des voies
3.3 Expériences et analyse des résultats
3.4 Conclusion
DISCUSSION GENERALE
CONCLUSIONS & PERSPECTIVE
CH III. CHARGEMENT DE NANOVECTEURS POUR LA DELIVRANCE DE CHELATEURS DE CUIVRE VERS LE FOIE
CHARGEMENT PAR UN DERIVE LIPOPHILE DU CHELATEUR DE CUIVRE ET QUANTIFICATION
1. OBJECTIFS ET DEMARCHE
2. CHARGEMENT DES NANOPARTICULES LIPIDIQUES PAR UN DERIVE LIPOPHILE DU CHELATEUR DE CUIVRE
2.1 Synthèse des dérivés lipophiles
2.1.1. Synthèse du chélateur NTA(CysNH2)3 12
2.1.2. Synthèse du dérivé lipophile lien disulfure
2.1.3. Dérivé lipophile avec un lien thioester
2.2 Formulation de NLC chargées
2.2.1. Formulation
2.2.2. Caractérisation
3. QUANTIFICATION DES CHELATEURS LIPOPHILES ENCAPSULE
3.1 Appareillage HPLC/UV vis et méthode
3.2 Calibration des chélateurs lipophiles
3.2.1. NTA(Cys(COC8H17)NH2) 13
3.2.2. NTA(Cys(SC8H17)NH2)3 15
3.3 Quantification
3.3.1. Préparation des échantillons
3.3.2. Analyse de NLC formulées en présence des chélateurs lipophiles
4. CONCLUSION
EVALUATION DE LA CAPACITE DE NANOPARTICULES A DELIVRER UN CHELATEUR DE CUIVRE AU NIVEAU CELLULAIRE
1. OBJECTIF ET DEMARCHE
2. EVALUATION DE LA VIABILITE CELLULAIRE
2.1 Principe du test MTT
2.2 Cytotoxicité
2.3 Effet protecteur des chélateurs
2.3.1. Viabilité sur cellules C3A
2.3.2. Viabilité sur cellules C8
3. EVALUATION DE L’EXPRESSION DES METALLOTHIONEINES PAR RT-QPCR
3.1 Principe de la RT-qPCR
3.2 Evaluation de l’expression des métallothionéines par RT-qPCR
3.2.1. Expérimentation
3.2.2. Résultats
3.3 Conclusion
DISCUSSION
CONCLUSION & PERSPECTIVES
CH IV. CONCLUSION GENERALE 
PARTIE EXPERIMENTALE
SYNTHESE ORGANIQUE
1. INFORMATIONS GENERALES
2. SYNTHESE DU SURFACTANT PEGYLE SA-PEG100-GALNAC 10
3. SYNTHESE DES DERIVES LIPOPHILES
FORMULATION DE NANOPARTICULES ET CARACTERISATION
1. GENERAL INFORMATIONS
2. FORMULATION
3. QUANTIFICATION DES SURFACTANTS PEGYLES SA-PEG100-GALNAC 10
4. QUANTIFICATION DU TAUX D’ENCAPSULATION
EXPÉRIENCES CELLULAIRES 
RESONNANCE DES PLASMONS DE SURFACE – INTERACTION DES NLC AVEC UNE LECTINE 
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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