Concentration des matrices denses de collagène sans ou avec minéral

Synthèses par diffusion de vapeur de NH3

Cette synthèse a été effectuée selon le procédé décrit par Nassif et al. (Nassif 2010). Les solutions de sels de calcium et de phosphate sont préparées dans une solution aqueuse d’acide acétique (500 mM) à température ambiante. Le pH de ces solutions est ajusté à 2,2 en ajoutant de l’acide chlorhydrique (HCl) 12M. Deux solutions différentes sont préparées :

HApD : CaCl2.2H2O à une concentration 110 mM; NaH2PO4 à 66 mM. Le rapport molaire Ca/P est 1,67 correspond à la formation de l’apatite stœchiométrique (Nassif 2010).

CHApD : CaCl2.2H2O à une concentration 110 mM; NaH2PO4 à 33 mM et NaHCO3 à 33 mM. Le rapport molaire Ca/P est déficient en phosphate, mais le rapport molaire Ca/(P+C) est égal à 1,67.

Trois flacons (35 ml, h = 50 mm) sont placés dans un dessiccateur de 1L fermé hermétiquement (Fig. 1). Deux des flacons contiennent 20 ml des solutions préparées précédemment et le troisième, 8 ml de solution aqueuse d’ammoniaque 30% w/w. Les trois récipients sont couverts de Parafilm percé de quelques trous avec une aiguille afin de ralentir la diffusion de vapeur d’ammoniac. Le dessicateur est placé sous hotte à température ambiante.

Suite à la diffusion de vapeur d’ammoniac, le pH des solutions augmente et des précipités sont observés au bout de 1 heure. Après 7 jours, le pH de la solution est 10-11. Les précipités sont récupérés par centrifugation pendant 10 min à une vitesse de 22290G à 10°C, lavés ensuite avec 40 mL d’eau doublement distillée. Cette étape de centrifugation-lavage est répétée plusieurs fois jusqu’à ce que l’eau de lavage soit neutre (4 ou 5 fois en moyenne). Les précipités sont séchés à l’étuve à 37°C pendant 7 jours. Ensuite, les précipités de couleur blanche sont broyés dans un mortier et stockés dans des piluliers en verre avant les caractérisations.

Synthèses par la méthode de neutralisation

Les synthèses ont été réalisées selon le procédé décrit dans la littérature (Osaka 1991). Les nanocristaux d’apatite sont obtenus par réaction entre du nitrate de calcium Ca(NO3)2·4H2O et de l’hydrogénophosphate de diammonium (NH4)2HPO4. Toute l’eau utilisée pendant la synthèse et le lavage est portée à ébullition et refroidie sous barbotage d’azote (N2) pour s’affranchir du CO2 dissous. Une solution aqueuse de (NH4)2HPO4 à 300 mM (100 ml) dont le pH est ajusté à 10 (par ajout d’une solution d’ammoniaque 30% w/w), est ajouté à la vitesse constante de 3 ml/min à 100 ml de solution (500 mM) de Ca(NO3)24H2O sous forte agitation à température ambiante. Pour que la vitesse d’ajout soit constante pendant la réaction, nous avons utilisé un titreur automatique (Titrando 808, Metrohm). L’expérience a lieu entièrement sous atmosphère d’N2, afin d’éviter la carbonatation des solutions. Dans le cas de la synthèse d’apatite carbonatée, la source de carbonate à savoir le bicarbonate de sodium NaHCO3 est ajoutée à la solution de phosphate. Le rapport Ca/P reste constant à 1,67.

Après l’ajout, la solution est agitée pendant 24h. Les précipités sont récupérés par centrifugation pendant 10 min à une vitesse de 22290G à 10°C, ensuite lavés avec 40 mL d’eau doublement distillée. Cette étape centrifugation-lavage est répétée plusieurs fois jusqu’à ce que l’eau de lavage soit neutre (environ 3 fois). Ensuite les échantillons sont séchés à l’étuve à 105°C pendant 48 h. Des poudres de couleur blanche sont obtenues. Pour l’étude de la substitution par les ions carbonates, nous avons varié la quantité de précurseurs carbonatés introduits .

Apatites formées à partir de la solution SBF 1,5 

Préparation de la solution SBF 1,5 à pH = 7,4

Cette solution physiologique est une solution dont la concentration en ions est proche de celle présente dans le fluide extracellulaire ou le plasma sanguin humain. Elle a été mise en place, afin de reproduire la formation de l’apatite in vitro sur des matériaux bioactifs. Il existe différentes solutions physiologiques dont la composition en ions est variée (Hanks 1949 & Kokubo 1987). La solution physiologique mise en place par Kokubo et al., nommée « Simulated Body Fluid » (SBF) possède une concentration en ions proche de celle du plasma sanguin humain. La différence majeure entre la composition de ce SBF et le fluide physiologique est la quantité de HCO3- qui est plus faible dans le cas du SBF .

Néanmoins, pour nos synthèses, nous avons utilisé une solution de SBF 1,5 fois plus concentrée en sels par rapport au SBF de Kokubo notée « SBF 1,5 » (RHEE 2000). Cette solution est moins stable que le SBF conventionnel et la formation d’apatite est plus rapide à partir de cette solution. La solution SBF 1,5 est préparée en dissolvant 1,2 g de 2-amino-2-hydroxyméthyl1,3-propanediol (C4H11NO3 121,1 g/mol, 0,01M) qui est un tampon de la solution dans 1 L d’eau double-distillée sous agitation. Le pH de la solution est ensuite ajusté à 7,4 avec de l’acide chlorhydrique (HCl) concentré (12 M). La solution est maintenue à 37°C dans un bain d’huile. Les sels suivants sont ajoutés successivement dans la solution l’un après l’autre, l’ajout d’un sel ayant toujours lieu après la dissolution totale du précédent :

NaCl 12,45g (213 mM, 58,44 g/mol); NaHCO3 0,529g (6,3 mM, 84 g/mol); KCl 0,334 g (4,5 mM, 74,55 g/mol) ; K2HPO4·3H2O 0,342 g (1,5 mM, 228,2 g/mol) ; CaCl2·2H2O 0,559 g (3,8 mM, 147,02 g/mol) ; Na2SO4 0,107 g (0,75 mM, 142,04 g/mol) ; MgCl2·6H2O 0,467 g (2,3 mM, 203,21 g/mol).

Après dissolution complète de tous les sels, on mesure le pH. Généralement, le pH reste à 7,4, mais si le pH a changé le réajustement de pH est nécessaire avec HCl ou NH3 concentrés. Ensuite, pour éviter toute contamination par des microorganismes, quelques milligrammes de NaN3 sont ajoutés dans la solution, bien qu’elle soit aussi stérilisée par filtration. Elle est conservée à 4°C. La force ionique de la solution est 248,9 mM soit 1,5 fois plus importante que celle du SBF.

Précipitation de la solution SBF 1,5 par congélation/décongélation

La solubilité des ions dans l’eau change en fonction de la température. Nous avons utilisé cette caractéristique en plaçant une bouteille de solution SBF 1,5 dans un congélateur à -20°C pendant 12 h. Ensuite, la solution est remise à température ambiante jusqu’à la décongélation totale. Des précipités de couleur blanche sont trouvés au fond du flacon et en suspension dans la solution SBF 1,5. Ils sont alors récupérés par centrifugation pendant 10 min à une vitesse de 22290G à 10°C et séchés dans l’étuve à 37°C pendant 3 jours.

Echantillons issus du tissu osseux

Les prélèvements osseux utilisés pour les caractérisations proviennent de l’Institut Mutualiste Montsouris (IMM) CERA. Les échantillons d’os sont prélevés à l’aide d’une perceuse électrique d’os longs (sites métaphysaires et diaphysaires) de brebis de deux ans sacrifiées pour d’autres sujets de recherche. Les morceaux d’os sont fermés hermétiquement ou conservés dans une solution de PBS 1X, puis conservés à 4°C jusqu’à l’utilisation. Pendant la thèse, nous avons étudié des échantillons issus du tissu osseux sous différents états.

Os frais : L’échantillon d’os frais extrait de brebis est utilisé directement pour les caractérisations sans aucun traitement avec ou sans imprégnation dans du PBS 1X.

Os séché : L’échantillon est obtenu par séchage de l’échantillon d’os frais sous sorbonne pendant 48 h avant la caractérisation.

Bioapatite (Os sec et lavé) : Nous avons utilisé aussi l’échantillon d’os de brebis pour lequel les débris cellulaires (phospholipides) sont éliminés par lavage dans du chloroforme (CHCl3). Ceci nécessite plusieurs bains successifs de CHCl3 sous agitation avec une durée de 24 h pour chaque bain.

Table des matières

INTRODUCTION
I. Liste des réactifs et des solutions
II. Synthèses des apatites
1. Synthèses par diffusion de vapeur de NH3
2. Synthèses par la méthode de neutralisation
3. Apatites formées à partir de la solution SBF 1,5
3.1 Préparation de la solution SBF 1,5 à pH = 7,4
3.2 Précipitation de la solution SBF 1,5 par congélation/décongélation
4. Echantillons issus du tissu osseux
III. Préparation des solutions de collagène
1. Extraction du collagène de type I
2. Dosage de l’hydroxyproline
3. Conditionnement des échantillons
IV. Concentration des matrices denses de collagène sans ou avec minéral
1. Concentration de collagène par dialyse inverse en injection continue (Wang 2011)
2. Synthèses des matrices hybrides collagène/apatite (co-précipitation de collagène avec l’apatite) : Coll/CHA et Coll/SBF
2.1 La matrice hybride (Coll/CHA)
2.2 La matrice hybride (Coll/SBF)
3. Synthèse de matrices hybrides collagène / apatite en présence d’additifs organiques
3.1 Synthèse d’une matrice de collagène et d’une matrice hybride en présence de polyAspartate (Coll/PolyAsp et Coll/SBF/PolyAsp)
3.2 Synthèse d’une matrice de collagène et d’une matrice hybride en présence d’héparine (Coll/Hép et Coll/SBF/Hép)
4. Augmentation de la charge en minéral par imprégnation des matrices
V. Informations structurales et techniques de caractérisation correspondantes
1. La microscopie électronique à transmission (MET) et les cryométhodes
1.1 Observation par MET
1.2 Les cryo-Méthodes
2. Microscopie électronique à balayage (MEB)
3. Analyses thermogravimétriques (ATG)
4. Spectroscopie infrarouge (IR)
5. Diffraction des Rayons X (DRX)
6. Résonance magnétique nucléaire (RMN) à l’état solide
6.1 Séquence HPDEC
6.2 Séquence CP (Polarisation Croisée)
6.3 Séquence HETCOR
6.4 Séquence double CP
6.5 Séquence REDOR
CONCLUSION

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