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Compréhension globale de l’arginine-vasopressine
GÉNÉRALITÉ DE L’AVP
L’arginine-vasopressine (abrégée AVP ou ADH pour antidiuretic hormone en anglais) est un peptide hormonal constitué de 9 acides aminés dont 2 cystéines (en positions 1 et 6) reliées entre elles par un pont disulfure qui lui confère sa structure tridimensionnelle . Sa masse moléculaire est de 1084.25 g/mol.
Si l’arginine-vasopressine fut découverte pour la première fois par le chimiste Oliver Kamm en 1928, ce n’est qu’en 1950 que sa séquence complète fut déterminée par le chimiste franco-américain Vincent du Vigneaud . L’arginine-vasopressine est appelée ainsi en référence à son acide aminé présent en position 8. En effet, il existe chez certaines espèces d’animaux, comme les suidés (porcins), une lysine8-vasopressine (abrégée LVP) c’est pourquoi la précision de l’acide aminé en position 8 de la séquence est faite.
SYNTHÈSE CENTRALE ET PÉRIPHÉRIQUE DE L’AVP
L’AVP n’est pas produite directement en tant que nonapeptide. Elle dérive d’un précurseur composé d’un porteur de protéine (neurophysine II) rattaché à un glycopeptide et un peptide signal. Cet ensemble, appelé pré-pro-vasopressine, est constitué en tout de 164 acides aminés. La 1ère partie de cette pré-pro-hormone est ce qu’on appelle le peptide signal. Constitué dans ce cas présent de 19 acides aminés, il sert à adresser le précurseur du peptide dans le réticulum endoplasmique. Le peptide signal est souvent présent sur des précurseurs de protéines lorsque ceux-ci sont synthétisés par le génome nucléaire et non par celui de l’organite en question. Les 9 acides aminés suivants constituent l’AVP qui représente finalement une toute petite fraction du précurseur (164 acides aminés). Vient ensuite la plus grosse partie, composée de 93 acides aminés, la neurophysine II qui fait office de protéine de transport « protein carrier » rattachée à un glycopeptide (39 acides aminés) qui module l’activité du SNC (système nerveux central).
RÉCEPTEURS ET EFFETS PHYSIOLOGIQUES
Les 2 effets physiologiques de l’AVP sont la vasoconstriction et l’antidiurèse. Il a été démontré que ces 2 effets opèrent par 2 voies métaboliques différentes ; il semblait donc normal de les différencier. C’est en 1979 que Mitchell, Kirk et Billah proposèrent de distinguer 2 types de récepteurs pour la vasopressine .
Les récepteurs V1 pour l’effet vasoconstricteur
Les récepteurs V2 pour l’effet antidiurétique
Les récepteurs V1 sont principalement localisés dans les cellules musculaires lisses ; lorsque la vasopressine s’y fixe, le récepteur est stimulé et augmente les concentrations cytoplasmiques de calcium ionisé ce qui entraîne une vasoconstriction. Les localisations secondaires du récepteur V1 sont nombreuses, dans le cerveau notamment, où la fixation de l’AVP déclenche la production de cortisol et d’aldostérone , ainsi que dans le foie, la rate, les reins et la vessie.
Les récepteurs V2 sont quant à eux localisés sur le pôle basal des cellules épithéliales du tube collecteur au niveau du rein. L’interaction de l’AVP avec ce type de récepteur stimule l’activité de molécules appelées Aquaporin-2 (AQP2) qui entraîne une réabsorption de l’eau et concentre ainsi l’urine .
HYPOSÉCRÉTION ET HYPOACTIVITÉ
Une hyposécrétion d’AVP, l’incapacité de celle-ci à se lier aux récepteurs V2 ou encore une dégradation trop rapide du peptide peut déclencher un diabète insipide dont les caractérisations principales sont une soif excessive et une polyurie prononcée. Une personne atteint de cette pathologie est susceptible de produire plus de 10 litres d’urine par jour. Il y a 3 cas de diabète insipide à distinguer en fonction de l’origine de la pathologie :
Le diabète insipide central (DIC)
Caractérisé par un défaut de synthèse ou une hyposécrétion d’AVP, le DIC est le cas le plus courant de diabète insipide. Cette déficience peut résulter de dommages causés aux sites impliqués dans la sécrétion de l’AVP tels que les noyaux supraoptiques et para ventriculaires ou les osmorécepteurs situés dans l’hypothalamus .
Malheureusement, si on estime que 1 à 2 % des cas sont dus à une forme héréditaire de DIC provoquée par des mutations sur le gène codant de l’AVP situé sur le chromosome 20, dans la plupart des cas, la cause exacte de cette hyposécrétion est inconnue.
Le diabète insipide néphrogénique (DIN)
Dans le cas du DIN, la synthèse de l’AVP et sa sécrétion sont normales mais le système rénal oppose une résistance à l’action du peptide. A l’inverse du DIC, les causes pouvant entrainer un DIN sont en grande partie connues. Plusieurs maladies rénales comme la PKD (polykystose rénale de type dominant) , l’amylose ou encore l’usage de médicaments antiviraux tels que le cidofovir (traitement contre le cytomégalovirus) peuvent entrainer le DIN . Des mutations du gène AVPR2 qui encode les récepteurs type V2 responsables de l’action antidiurétique ou du gène AQP2 qui encode les canaux à eau sont aussi des causes possibles .
Le diabète insipide gestationnel (DIG)
Ce type de diabète touchant uniquement les femmes enceintes durant leur 3ème trimestre de grossesse est de loin la pathologie la plus rare avec environ 5 cas sur 100’000 grossesses. La cause de ce type de diabète est la dégradation extrêmement rapide de la vasopressine dans le sang en raison de la concentration très élevée d’aminopeptidase (vasopressinase) dans le placenta durant cette période de la grossesse .
STRATÉGIE DU DOSAGE DE L’AVP DANS LE PLASMA
EXTRACTION EN PHASE SOLIDE (SPE)
Le plasma sanguin, constitué à 90 % d’eau, contient des lipides, des bioamines, des ions, des sels minéraux, des gaz dissous, des protéines (fibrinogène, globuline, albumine) et encore une quantité importante d’autres composés. Afin de séparer l’AVP de ces composants, il faut jouer sur l’interaction du peptide avec une phase stationnaire. Plusieurs types de phases stationnaires existent ; pour l’AVP, une phase chargée négativement de type WCX (Weak cation exchange) préalablement conditionnée est utilisée. Il sera alors possible d’adsorber l’AVP sur cette phase en chargeant positivement la molécule d’AVP au moyen d’une solution acide et d’éliminer le reste de l’échantillon biologique. Il faudra ensuite récupérer le peptide adsorbé en substituant les molécules d’AVP adsorbées par des ions H+ en utilisant un solvant fortement acidifié avec le meilleur rendement possible.
LC-MS/MS
Une fois l’AVP extraite du plasma, il faut procéder à l’analyse proprement dite qui consiste à séparer les composés encore présents dans l’échantillon par une chromatographie liquide et ensuite à le détecter dans le spectromètre de masse.
Pour ce travail, l’appareil utilisé est un microLC-MS/MS possédant une sensibilité idéale pour l’analyse de peptides et de protéines. Une fois sorti du système LC, l’échantillon va être ionisé au moyen d’un elecrospray en appliquant une différence de potentiel importante entre la sortie de la LC et l’entrée du spectromètre de masse dans le but de former des micro-goutellettes possédant une très haute densité de charges.
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Table des matières
1 Liste des abréviations
2 Introduction
2.1 Compréhension globale de l’arginine-vasopressine
2.1.1 Généralité de l’AVP
2.1.2 Synthèse centrale et périphérique de l’AVP
2.1.3 Synthèse et dégradation du précurseur
2.1.4 Contrôle et régulation de la sécrétion d’AVP
2.1.5 Récepteurs et effets physiologiques
2.1.6 Physiopathologie de la vasopressine
2.2 Techniques de dosage : Historique et découvertes
2.2.1 Essai biologique
2.2.2 Essai immunologique
2.3 Stratégie du Dosage de l’AVP dans le plasma
2.3.1 Extraction en phase solide (SPE)
2.3.2 LC-MS/MS
2.4 Dosage simultané vasopressine et ocytocine
2.4.1 Généralités de l’ocytocine
2.4.2 Effets physiologiques
2.4.3 Possibilité et utilité du dosage en tandem AVP et OT
3 Matériel et méthodes
3.1 Matériel
3.1.1 Appareils et colonnes
3.1.2 Réactifs et solvants
3.1.3 Monovettes et Inhibiteurs
3.1.4 Plaques SPE
3.2 Méthodes
3.2.1 Préparation des solutions d’AVP
3.2.2 Méthode LC pour UPLC
3.2.3 Méthode MS/MS pour UPLC
3.2.4 Adsorption de l’AVP
3.2.5 Stabilité des solutions AVP
3.2.6 Prélèvement et préparation du plasma
3.2.7 Précipitation des protéines plasmatiques
3.2.8 Extraction en phase solide
3.2.9 Méthode LC pour microLC
3.2.10 Méthode MS pour microLC
3.2.11 Quantification de l’AVP endogène
4 Résultats et discussions
4.1 Optimisation des voltages MS microLC
4.2 Etude de l’adsorption
4.3 Etude de la stabilité
4.4 Inhibition des protéases
4.5 Extraction en phase solide
4.6 Précipitation des protéines plasmatiques
4.7 Prélèvement du plasma
4.8 Quantification de l’AVP endogène
4.8.1 Courbe de calibration STD externes
4.8.2 Courbe de calibration par ajouts dosés
5 Conclusion et perspectives
6 Bibliographie
7 Annexes
7.1 Figures pour la stabilité
7.2 Chromatogrammes des STD externes
7.3 Courbe de calibration STD externes
7.4 Chromatogrammes des ajouts dosés
7.5 Courbe de calibration ajouts dosés
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