Complexite et organisation du genome humain

Les développements récents dans le domaine de la génétique moléculaire humaine ont eu pour conséquence une compréhension de plus en plus précise des pathologies à étiologie génétique. Contrairement aux idées reçues, beaucoup de maladies génétiques, loin d’être rares, représentent en fait une cause significative de maladie et de mortalité (Rodwell et Aymé. 2014). Des pathologies qui, prisent individuellement apparaissent rares, sont d’une manière globale une cause majeure de mortalité et de morbidité. Environ 3 % de toutes les grossesses aboutissent à la naissance d’un enfant ayant une maladie génétique significative ou une anomalie congénitale responsable d’un handicap, de retard mental ou de mort précoce (Gelehrter et Collins. 1992).

Le retard mental (RM) est la cause la plus fréquente de handicape grave chez les enfants et les jeunes adultes et constitue un problème majeur du point de vue social et médical. 0.3 – 0.5 % de la population mondiale est affectée par des formes de RM de grave à profond et cette fréquence peut atteindre 1-1.5 % si on considère les formes modérées de RM (Chelly et al., 2006). Les causes de RM sont très variables et peuvent être de nature environnementale ou génétique ou bien une combinaison des deux. Parmi les 1000 différentes maladies héréditaires que l’on trouve associées au RM, 20 % environ montrent une ségrégation liée au chromosome X. Les RM liés au chromosome X syndromique (RMLX-S) intéressent 1 garçon sur 700 environ, soit autant que la trisomie 21(Ropers et Hamel. 2005).

COMPLEXITE ET ORGANISATION DU GENOME HUMAIN

Par définition un génome est complexe lorsque les séquences d’ADN, dont il n’existe qu’une copie par génome, constituent une fraction minime de l’ADN, par exemple le gène de la β-globine représente seulement 0.00005% de l’ADN génomique humain (Strachan et Read 2012). La complexité du génome humain est mise en évidence par des expériences de cinétique de réassociation. La vitesse de réassociation de telles séquences est relativement lente. Au contraire, certaines autres séquences hautement répétées dans l’ADN génomique ont une concentration beaucoup plus élevée et une vitesse de réassociation comparativement plus rapide. Le paramètre qui contrôle cette réassociation est le produit de la concentration initiale d’ADN monocaténaire par le temps d’incubation => Cot.

Le Cot1/2 est le produit de la concentration initiale d’ADN monocaténaire et du temps d’incubation pour obtenir 50 % de réassociation. Pour une concentration donnée, si le Cot1/2 est élevé la réassociation est lente donc le nombre de séquences différentes est élevé. Au contraire, si le Cot1/2 est faible, la réassociation est d’autant plus aisée que le nombre de séquences différentes est bas. Avec l’ADN des procaryotes, la cinétique de réassociation forme une sigmoïde presque parfaite, alors que pour l’ADN humain, elle est sous forme d’une courbe complexe représentée par la superposition de trois sigmoïdes (Strachan et Read 2012).

Cette expérience permet de mettre en évidence l’existence de trois types d’ADN :
→ADN hautement répété : se réassociant quasi-immédiatement (Cot <0.01) correspond à de l’ADN présent en un très grand nombre.
→ADN moyennement répété : se réassociant plus lentement (0.01<Cot<10) correspond à de l’ADN présent en un nombre plus restreint de copies.
→ADN à copie unique : se réassociant très lentement (10<Cot<10⁴ ) correspond à de l’ADN à séquence unique.

Les séquences géniques

Elles sont le plus souvent à copie unique ou en faible quantité sauf pour les gènes codants pour les histones. Cet ADN code toujours pour des chaines polypeptidiques. Du point de vue structural, un gène peut être subdivisé en sections pouvant être transcrites (unité de transcription) et en séquences de régulation. Les séquences régulatrices sont situées non seulement en amont mais aussi en aval du gène. Le premier et le dernier exon contiennent généralement des séquences qui ne sont pas traduites. II s’agit de la région 5′ non traduite (5′ UTR) pour untranslated region de l’exon 1 et de la région 3′ UTR à l’extrémité 3′ du dernier exon (Strachan et Read 2012).

Les séquences extra-géniques répétées

Lorsque de l’ADN humain fractionné est centrifugé dans un gradient de densité de chlorure de césium, la principale portion de l’ADN (Euchromatine) forme une bande de forte densité : 1.701g/cm3 . Trois bandes supplémentaires (satellites) apparaissent aux densités 1.687, 1.693 et 1.697g/cm3 . Elles sont moins denses en raison de leur pauvreté en CG par rapport à la bande principale. (Figure 2) Ces séquences correspondent à de l’ADN non codant d’où le nom d’ADN extra-géniques répétées. Selon leur taille, leur degré de répétition et leur structure, ces séquences d’ADN sont subdivisées en trois catégories : ADN satellites « classiques », ADN minisatellites et ADN microsatellites (Hardman. 1986).

L’ADN satellite classique

Cet ADN hautement répétitif correspond à de l’hétérochromatine constitutive, il n’est pas codant et représente 20 à 30% du génome humain. Les séquences qui constituent ces satellites sont de grande taille (100 à 200 pb), organisées en tandem, elles ne sont pas dispersées dans le génome, mais localisées en certains points particuliers. Il en existe deux types : les séquences centromériques (CEN) et les séquences télomériques (TEL). Chez l’Homme et les primates, les séquences centromériques constituent la famille de l’α-satellite qui correspond à la répétition en tandem d’une séquence de 171 pb. Ces répétitions ont une longueur qui varie entre 300 Kb (Y) à 5 10³ Kb (Ahmad et Henikoff, 2001). Les séquences télomériques situées aux deux extrémités chromosomiques, sont constituées de motifs hautement répétés, riches en G, très conservés (TTAGGG). Elles ont un rôle très important dans la préservation de l’entité chromosomique en empêchent leur dégradation ou leur raccourcissement jusqu’à une longueur critique qui conduirait à l’entrée de la cellule en sénescence (Blackburn, 2001).

L’ADN minisatellite

Il existe dans le génome humain en dehors de l’hétérochromatine constitutive, des séquences de 9 à 64 pb hautement répétées en tandem mais dispersées au niveau de différents points du génome (Singer et Berg 1992). Il s’agit de minisatellites hypervariables car très polymorphes dans leur degré de répétitions, les VNTR pour Variable Number Tandem Repeat.

L’ADN microsatellite
Ce deuxième type d’ADN hautement répétitif et qui correspond aussi à de l’hétérochromatine constitutive est largement prioritaire. Ces séquences sont composées de motifs constitués de courtes séquences (2 à 4 pb) disposés en tandem. Ces séquences sont répétées de très nombreuses fois.

Polymorphisme des séquences extra-géniques répétées

Le polymorphisme génétique est l’existence de variants, que ce soit au niveau du locus d’un gène (allèles), d’une structure chromosomique (par exemple, taille de l’hétérochromatine centromérique), du produit d’un gène (variants présentant des activités enzymatiques ou des affinités de liaison différentes) ou d’un phénotype.

Le terme « polymorphisme de I’ADN » fait référence à un grand éventail de variations dans une séquence nucléique, à la longueur des répétitions de nucléotides ou à la variation d’un seul nucléotide. Les polymorphismes de I’ADN sont utiles en tant que marqueurs génétiques, permettant d’identifier et de distinguer les allèles à un locus donné et de déterminer leur origine parentale (Hartl et Clark. 2007).

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I. COMPLEXITE ET ORGANISATION DU GENOME HUMAIN
INTRODUCTION
I.1- Les séquences géniques
I.2- Les séquences extra-géniques répétées
I.2.1- L’ADN satellite classique
I.2.2- L’ADN minisatellite
I.2.3- L’ADN microsatellite
I.3- Polymorphismes et mise en évidence des séquences répétées
I.3.1- Polymorphisme au niveau d’un seul nucléotide (SNP)
I.3.2- Polymorphisme de longueur d’une séquence (SSLP)
I.4- Les mutations atypiques du génome humain
I.4.1- Les mutations instables ou dynamiques
I.4.2- Différents types de répétitions de trinucléotides et leur expansion
I.4.3- Origine des mutations dynamiques
CHAPITRE II. GENETIQUE MOLECULAIRE DU SYNDROME DE L’X-FRAGILE
INTRODUCTION
II.1- Principe du diagnostic moléculaire des répétitions de trinucléotides
II.2- Les pathologies à répétitions de trinucléotides
II.3- Le syndrome de l’X-Fragile (XFS)
II.3.1- Aspect phénotypique du syndrome de l’X-Fragile
II.3.1.1- Manifestations cliniques
II.3.1.2- Prévalence et mode de transmission
II.3.2- Aspect génotypique du syndrome de l’X-Fragile
II.3.2.1- Identification du gène FMR1
II.3.2.2- Structure et expression du gène FMR1
II.3.3- Pathologie moléculaire du gène FMR1
II.3.3.1- Amplification et taille des répétitions
II.3.3.2- Modifications épigénétiques de FMR1
II.3.4- La protéine FMRP
II.3.5- Traitements du syndrome de l’X-Fragile
II.3.6- Diagnostic différentiel du syndrome de l’X-Fragile/Autisme
MATERIELS ET METHODES
I. Echantillonnage biologique
I.1- Loci FRAXA et FRAXE
I.2- Distributions des répétitions CGG et des répétitions GCC
II. Extraction de l’ADN génomique (ADNg
II.1- Protocole d’extraction de l’ADNg
II.1.1- Principe d’extraction de l’ADNg
II.1.2- Procédure d’extraction
II.2- Quantification et dosage de l’ADNg
II.2.1- Principe de quantification de l’ADNg par spectrophotométrie
II.2.2- Détermination de la concentration de l’ADNg
II.3- Purification de l’ADNg
II.3.1- Principe de la purification de l’ADNg
II.3.2- Procédure de purification de l’ADNg
III. Amplification de l’ADNg par PCR fluorescente
III.1- Principe de l’amplification de l’ADNg par PCR fluorescente
III.2- Amorces utilisées
III.3- Protocole d’amplification
III.4- Conditions d’amplification
IV. Electrophorèse capillaire et génotypage
IV.1- Principe de l’électrophorèse capillaire
IV.2- Protocole de l’électrophorèse capillaire
IV.3- Génotypage des loci FRAXA et FRAXE par GeneMapper
IV.3.1- Le séquenceur ABI 3130
IV.3.2- Programmation et lecture du logiciel GeneMapper v4.0
V. Transfert sur membrane par Southern-blot et hybridation moléculaire
V.1- Principe du Southern-blot
V.2- Protocole du transfert sur membrane
V.2.1- Digestion de l’ADNg
V.2.2- Electrophorèse sur gel d’agarose
V.2.3- Transfert sur membrane
V.2.4- Pré-hybridation
V.2.5- Préparation de la sonde
V.2.6- Lavage de la membrane et mise en cassette
RESULTATS ET INTERPRETATIONS
I. Echantillonnage biologique
I.1- Patients autistiques
I.2- Patients RM
II. Génotypage du locus FRAXA
II.1- Détermination de la taille des répétitions
II.2- Individus non apparentés
II.2.1- Individus de sexe masculin
II.2.2- Individus de sexe féminin
II.3- Etudes familiales
II.3.1- Famille 1
II.3.2- Familles 2 et 3
II.3.3- Famille 4
III. Génotypage des patients au locus FRAXE
IV. Hybridation moléculaire par Southern-blot
IV.1- Blot Z01
IV.1.1- Migration sur gel d’agarose
IV.1.2- Interprétation des résultats du blot Z01
IV.2- Blot Z02
IV.2.1- Migration sur gel d’agarose
IV.2.2- Interprétation des RFLPs obtenus
2.2.1- Interprétation des résultats du blot Z02
2.2.2- Calcul de la taille des bandes des RFLPs
2.2.3- Calcul des RFLPs des individus I1 et II2
2.2.4- Calcul du RFLP de l’individu II1
V. Diagnostic moléculaire
VI. Distributions allélique des répétitions CGG (FRAXA) et GCC (FRAXE
VI.1- Caractéristiques des patients étudiés
VI.2- Polymorphisme allélique des répétitions CGG
VI.3- Polymorphisme allélique des répétitions GCC
VI.4- Hétérozygotie des loci FRAXA et FRAXE
DISCUSSION
CONCLUSION

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