Soutenance mémoire
L’ADN est une des plus importantes molécules biologiques qui est présente dans le noyau de chacune des 100 trillions de cellules de notre corps, car elle en contient le plan de construction complet. L’information concernant toutes les caractéristiques d’une personne, de son aspect physique à la structure de ses organes internes, est stockée dans l’ADN au moyen d’un système de codage spécial. Cette information est codée par l’ordre d’enchaînement des quatre bases, qui constituent en quelque sorte les lettres de l’alphabet génétique. De ce fait, une interférence au niveau des fonctions constitutives de l’ADN représente une sérieuse menace pour l’intégrité fonctionnelle des cellules ainsi que pour leur viabilité. En effet, une simple altération au niveau d’une des nucléobases peut entraîner, si le dommage n’est pas réparé, une mutation pouvant être à l’origine d’un processus de carcinogenèse. C’est pour cette raison que de nombreuses études concernant les types de dommages sur l’ADN et les facteurs capables de l’endommager ont été effectuées depuis la découverte de la structure et du rôle biologique de ce dernier.
Dans les cellules eucaryotes, l’ADN cellulaire se localise dans le noyau sous une forme compactée, appelée chromatine. Les principales unités de compaction de la chromatine sont les nucléosomes ou l’ADN change de conformation en s’enroulant autour de complexes de protéines appelés histones. L’influence de la compaction de l’ADN en nucléosomes a été étudiée et les résultats obtenus ont même été utilisés afin de déterminer les positions des bases azotées de l’ADN complexé. Toutefois, la formation de dommages de l’ADN complexé dans des conditions non biologiques n’a jamais été étudiée.
L’ADN étant un polyélectrolyte anionique, il peut interagir avec divers agents cationiques qui seront capables de modifier sa conformation grâce à la neutralisation de ses charges, mais également son environnement. D’où l’intérêt d’étudier l’influence de la complexation de l’ADN avec des agents cationiques comme des tensioactifs, des polymères, des lipides et des sels sur la formation de ses dommages. De plus, contrairement aux nucléosomes, cette approche permettra de moduler la compaction et l’environnement de l’ADN afin de mieux comprendre leurs influences sur la formation de lésions. Comme le rayonnement UV est une des principales sources de lésions au niveau de l’ADN, nous nous sommes tout particulièrement intéressés, dans ce travail, aux dommages oxydatifs photosensibilisés sous irradiation UVA. Réciproquement, l’analyse de ces derniers pourra aussi être utilisée comme un nouvel outil d’investigation afin de mieux comprendre les mécanismes de complexation par les agents cationiques. Un tel outil pourra s’avérer précieux, en regard de l’importance de la thérapie génique et donc de la transfection de l’ADN grâce à des vecteurs cationiques.
MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES MECANISMES DE FORMATION DE DOMMAGES DE L’ADN
L’acide désoxyribonucléique (ADN) est le support de l’hérédité, et contient sous forme codée toutes les informations relatives à la création et à la vie d’un organisme vivant, du plus simple au plus complexe : viral, bactérien, végétal ou animal. Toutefois, l’ADN peut aussi être la cible de divers agents délétères chimiques et/ou physiques. Ces agents peuvent provoquer différentes altérations de structure de cette molécule ce qui représente une sérieuse menace pour l’intégrité fonctionnelle des cellules et pour leur viabilité.
La connaissance des facteurs, capables de modifier la structure de l’ADN ainsi que des mécanismes de formation de ses dommages est donc d’une importance cruciale. C’est pour cette raison que de nombreuses études concernant les dommages sur l’ADN ont été effectuées depuis la découverte de la structure et du rôle biologique de ce dernier. Le chapitre qui suit sera consacré à une mise au point bibliographique sur les divers types et mécanismes de formation de dommages sur l’ADN ainsi que sur les facteurs pouvant les influencer.
L’ADN : son rôle et sa structure
L’ADN est formée par deux chaînes complémentaires qui s’enroulent l’une autour de l’autre en formant une double hélice. Sa structure hélicoїdale a été proposée par James Watson et Francis Crick en 1953. L’importance de cette découverte a été distinguée par le prix Nobel de physiologie et de médecine en 1962. En effet une telle conformation de l’ADN montre encore une fois le génie de la Nature. Chaque chaine est formée d’un enchaînement de nucléotides. Ces derniers sont constitués d’un phosphodiester, reliant deux nucléotides consécutifs entre eux, d’un sucre, le 2 désoxyribose, et d’une des quatre bases azotées (deux bases de type purique – l’adénine (A) et la guanine (G), et deux bases de type pyrimidique – la thymine (T) et la cytosine (C)). Chaque brin d’ADN est donc constitué d’un squelette sucre-phosphate hydrophile sur lequel sont branchées des bases azotées hydrophobes.
En trois étapes seulement, la Nature a diminué le contact entre les nucléobases hydrophobes et le milieu hydrophile (l’eau) . Pour cela elle a:
– relié deux chaînes désoxyribonucléiques par des liaisons hydrogènes entre des nucléobases selon une règle de complémentarité : la thymine se lie toujours à l’adénine et la cytosine à la guanine
– diminué l’espace libre entre les bases d’une même chaîne en inclinant le squelette par rapport au plan de paires de bases
– enroulé les deux brins incliné en hélice l’un autour de l’autre .
Dans cette structure hélicoïdale, les bases sont situées à l’intérieur tandis que le squelette sucre-phosphate est repoussé à l’extérieur faisant ainsi apparaître 2 sillons de taille différente : le petit sillon et le grand sillon .
Le rôle de l’ADN est de contenir l’information nécessaire à la production des protéines, constituant essentiel de la matière vivante. Cette information est codée par l’ordre d’enchaînement des quatre bases, qui constituent en quelque sorte les lettres de l’alphabet génétique. Ainsi chaque être vivant possède une batterie d’enzymes dont le rôle principal est de transcrire l’ADN en ARN (acide ribonucléique), qui sera ensuite traduit en protéines nécessaires à l’organisme. Les protéines ainsi formées ont diverses fonctions que l’on peut classer en deux essentielles : l’autonomie de l’organisme (croissance, défense) et sa reproduction. La fidélité de la réplication est assurée par des processus enzymatiques complexes, vérifiant la complémentarité des bases (A-T et G-C) et corrigeant les erreurs aléatoires. C’est pour cette raison qu’une simple altération au niveau d’une des nucléobases peut entraîner, si le dommage n’est pas réparé, une mutation pouvant être à l’origine d’un processus de carcinogenèse .
Types de dommages sur l’ADN
L’ADN est une molécule cible de nombreux agents délétères. Il existe deux sources principales de dommages au niveau de l’ADN : les dommages photoinduits et ceux dus à des agents ou systèmes chimiques actifs. Les coupures de brins d’ADN sont induites principalement par des espèces oxygénées réactives (EOR), notamment par les radicaux hydroxyle . Ces espèces oxygénées réactives qui peuvent être formées par les deux mécanismes précédents, jouent un rôle majeur dans ce processus. Les dommages chimiques sont des dommages induits par des agents ou des systèmes chimiques actifs, capables d’interagir avec l’ADN directement ou par le biais de radicaux (espèces oxygénées réactives (EOR), espèces azotées réactives (EAR), radicaux de type carbonés etc.). Dans ce type de dommages peuvent être également inclus les dommages induits par sonication non liés à l’absorption de photons. Les dommages photoinduits sont provoqués par des photons de différentes énergies, et selon leur énergie, ils peuvent être classés en deux types de radiations: les radiations ionisantes (rayonnement γ) et les radiations non-ionisantes (l’ultraviolet et la lumière visible). La radiation ionisante est même capable d’ioniser ou d’exciter les molécules d’eau, en formant des radicaux qui endommagent l’ADN. Il a été montré que ce sont principalement les dommages au niveau de l’ADN qui sont responsables de la mort des cellules. Les cellules eucaryotes, dont l’ADN est situé dans le noyau, ne meurent pas tant que la radiation ionisante pouvant endommager l’ADN est absorbée par la membrane et le cytoplasme. Mais dès que la radiation ionisante pénètre dans le noyau, une augmentation significative de la mort des cellules est observée .
Les dommages photoinduits
La nature des dommages engendrés sur l’ADN dépend de la longueur d’onde d’irradiation. Le rayonnement ultraviolet, dont l’énergie lumineuse peut être, selon la longueur d’onde, directement absorbée par les bases de l’ADN, constitue une source importante de dommages. Il est divisé en trois domaines :
– les UVC, les plus énergétiques (190-280 nm), sont absorbés par l’ozone stratosphérique et n’atteignent généralement pas la surface de la Terre.
– les UVB de courte longueur d’onde (280-295 nm) sont également bloqués par l’atmosphère, les UVB de grande longueur d’onde (295-320 nm) représentent environ 5% des UV atteignant la surface de la Terre.
– les UVA (320-400 nm) représentent 95% des UV atteignant la surface de la Terre .
Les photodommages directs
Le maximum d’absorption de l’ADN se situant à environ 260 nm, c’est pour cette raison que seuls les UVC et UVB sont capables de former des dommages directs sur cette molécule biologique. Lorsque l’ADN est irradié par ce type de rayonnement, une base de l’ADN peut absorber un photon et ainsi passer de son état fondamental à son état singulet excité. A partir de cet état singulet excité, plusieurs processus sont possibles : la base peut revenir à son état fondamental par conversion interne, accompagnée d’un dégagement de chaleur, ou par émission de fluorescence , elle peut subir une réaction photochimique ou bien subir un croisement intersystème qui la fait passer de son état singulet excité à un état triplet excité.
La majorité des photodommages directs est observée au niveau des bases pyrimidiques (thymine ou cytosine), principalement à cause du processus de dimérisation[7,8] . Les trois principaux photoproduits obtenus par irradiation UV sont les dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPDs) qui représentent 75% des photoproduits dimèriques, les pyrimidine-(6-4)-pyrimidones photoproduits – 25% et leurs isomères Dewar .
Dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD)
Lorsqu’une pyrimidine à l’état excité est adjacente à une autre pyrimidine sur un même brin d’ADN, une réaction de cycloaddition [2+2] peut avoir lieu entre les doubles liaisons des carbones C5 et C6 des deux bases .
L’enchaînement des pyrimidines au sein de l’ADN influe sur la fréquence de formation des dimères. Ainsi, les CPD le plus souvent formés sous irradiation UVB sont les dimères (<>) de séquence T<>T, suivis par les dimères 5′-T<>C-3′, 5′-C<>T-3′, puis C<>C (avec un rapport molaire 60:24:11:5 sur ADN cellulaire) .
L’étude théorique, par la méthode DFT (density functional theory) de la formation de CPDs confirme cet ordre [11] . Il a été montré que dans le cas du système T + T, les barrières d’énergie à franchir, à partir de l’état singulet excité, pour parvenir au puits de potentiel à partir duquel a lieu la dimérisation sont beaucoup moins importantes que pour les systèmes comportant des cytosines.
Les pyrimidine-(6-4)-pyrimidones photoproduits et leurs isomères Dewar
Ces dommages se forment par cycloaddition [2+2] entre le groupe C4’ carbonyle d’une thymine en position 3’ et la double liaison C5-C6 d’une pyrimidine adjacente en 5′. Une telle cycloaddition induit la formation d’un intermédiaire oxétane. En revanche, dans le cas d’une cytosine en position 3’, c’est la liaison 4’C=N de son tautomère imino qui interagit avec une pyrimidine en 5’. Il se forme un intermédiaire azétidine non stable qui se réarrange en photoproduit .
Si l’irradiation UV se prolonge, les photoproduits (6-4) peuvent ultérieurement subir une transformation en leur isomère de valence, l’isomère Dewar . Or, si les photoproduits (6-4) sont rapidement réparés par la cellule, leurs isomères Dewar le sont en revanche peu, d’où leur caractère hautement mutagènes. Des résultats récents suggèrent en outre que ce sont les UVA, plutôt que les UVB, qui sont responsables de cette isomérisation .
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
Chapitre I. MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LES MECANISMES DE FORMATION DE DOMMAGES DE L’ADN
I.1 Introduction
I.2 L’ADN: son rôle et sa structure
I.3 Types de dommages sur l’ADN
I.3.1 Les dommages photoinduits
I.3.1.1 Les photodommages directs
I.3.1.1.1 Dimères de pyrimidine de type cyclobutane (CPD)
I.3.1.1.2 Les pyrimidine-(6-4)-pyrimidones photoproduits et leurs isomères Dewar
I.3.1.1.3 Autres types de photodommages directs
I.3.1.2 Les photodommages indirects
I.3.1.2.1 Réactions de type I
I.3.1.2.1.1 Oxydation des guanines
I.3.1.2.1.2 Formation de radicaux hydroxyle
I.3.1.2.2 Réactions de type II
I.3.1.2.2.1 Transfert d’énergie sur le dioxygène
I.3.1.2.2.2 Transfert d’énergie sur les bases azotées
I.3.2 Les dommages chimiques
I.3.2.1 Mécanismes de coupures des brins d’ADN
I.3.2.1.1 Arrachement direct de l’atome d’hydrogène du désoxyribose
I.3.2.1.1.1 Accessibilité des atomes d’hydrogène du désoxyribose dans l’ADN
I.3.2.1.1.2 Mécanismes de coupures d’ADN à partir de radicaux de désoxyribose
I.3.2.1.1.2.1 Réactions du radical C(1’)
I.3.2.1.1.2.2 Réactions du radical C(2’)
I.3.2.1.1.2.3 Réactions du radical C(3’)
I.3.2.1.1.2.4 Réactions du radical C(4’)
I.3.2.1.1.2.5 Réactions du radical C(5’)
I.3.2.1.2 Transfert de l’atome d’hydrogène du désoxyribose vers la base azotée
I.3.2.2 Autre voies de la coupure de l’ADN
I.4 Origines de la production des espèces oxygénées réactives
I.4.1 Le rayonnement ionisant
I.4.2 L’ultrasonication
I.4.3 La thermolyse
I.4.4 La photolyse
I.4.5 La photosensibilisation
I.4.6 Les réactions de type « Fenton »
I.4.7 L’ozonation
I.5 Conclusion
Références
Chapitre II. MISE AU POINT BIBLIOGRAPHIQUE SUR LA COMPLEXATION ENTRE L’ADN ET DES TENSIOACTIFS CATIONIQUES
II.1 Introduction
II.2 Les tensioactifs et leur mode d’agrégation
II.3 Interactions tensioactifs-polyélectrolytes
II.4 Complexation ADN-tensioactifs
II.4.1. Méthodes les plus couramment utilisées pour l’étude de la complexation ADN-tensioactifs
II.4.1.1 La diffusion de la lumière
II.4.1.1.1 Intensité de la lumière diffusée
II.4.1.1.2 Diffusion dynamique de la lumière
II.4.1.2 Mesures de la température de fusion de l’ADN
II.4.1.3 Titration par fluorescence
II.4.1.4 Mesures de viscosité
II.4.1.5 Tension de surface
II.4.1.6 Etude potentiométrique
II.4.1.7 Microscopie de fluorescence
II.4.1.8 Calorimétrie isotherme
II.4.1.9 Electrophorèse sur gel d’agarose
II.4.2 Comportement de phases d’un système ADN-tensioactif
II.4.3 Influence de différents facteurs sur la complexation entre l’ADN et les tensioactifs
II.4.3.1 Force ionique
II.4.3.2 Longueur des chaînes hydrophobes
II.4.3.3 Tête polaire des tensioactifs
II.4.3.4 Concentration en ADN
II.4.3.5 Température
II.4.4. Structures et morphologies des complexes ADN-tensioactifs
II.5 Applications des complexes ADN-tensioactifs
II.5.1 Purification et isolement de l’ADN par précipitation
II.5.2 La thérapie génique
II.5.3 Dosage de l’ADN
II.6. Conclusion
Références
Chapitre III. ETUDE DE LA COMPLEXATION DE L’ADN AVEC DES TENSIOACTIFS ET DES SELS
III.1 Introduction
III.2 Etude de complexation ADN-tensioactifs
III.2.1 Méthodes utilisées pour les études de la complexation ADN – tensioactifs
III.2.1.1 Titration par fluorescence
III.2.1.2 Electrophorèse sur gel d’agarose
III.2.1.3 Intensité de la lumière diffusée
III.2.2 Influence de la concentration en ADN sur la complexation avec des tensioactifs
III.2.2.1 Cas de la complexation ADN-CTAB
III.2.2.2 Cas de la complexation ADN-DTAC
III.2.3 Effet de contre-ion dans le cas du cetyltriméthylammonium
III.2.4 Effet de la longueur de la chaîne de tensioactif
III.2.5 Comparaison de la micellisation et de l’agrégation des tensioactifs sur
l’ADN de type triméthylammonium
III.2.6 L’effet de la tête polaire
III.2.6.1 Synthèse et caractérisation physico-chimique de Ghyd12HCl
III.2.6.2 Comparaison de la complexation du DTAC et du Ghyd12HCl avec l’ADN
III.2.7 Complexation ADN-tensioactifs bolaformes
III.3 Etude de complexation ADN-sels
III.4 Conclusion
Références
Chapitre IV. INFLUENCE DE LA COMPLEXATION DE L’ADN SUR SA COUPURE PHOTOINDUITE
IV.1 Introduction
IV.2 Etude par résonance paramagnétique électronique (RPE) des espèces formées au cours de la photolyse de la benzophénone
IV.2.1 Etude RPE en présence de DMPO
IV.2.2 Etude RPE en présence de 4-oxo-TEMP
IV.3 Influence des tensioactifs sélectionnés sur la photosensibilisation de coupures simple brin d’ADN
IV.3.1 Effet du contre-ion et de la longueur de la chaîne
IV.3.2 Effet de la tête polaire
IV.3.2.1 Mise en évidence d’un environnement hydrophobe lors de la complexation ADN-tensioactifs
IV.3.3 Influence du Bol12 sur la photosensibilisation de coupures simple brin
IV.4 Influence de NaCl et NMe4Br sur la photosensibilisation de coupures simple brin
IV.5 Etude mécanistique de la formation de coupure simple brin photosensibilisée par la benzophénone sur l’ADN seul et sur l’ADN complexé par le CTAB
IV.6 Généralisation de la méthode et possibles applications
IV.7 Influence de la complexation ADN – polymères ou ADN – lipides cationiques sur la photosensibilisation de coupures simple brin
IV.7.1. Complexation ADN-polymères cationiques et son influence sur la photosensibilisation de coupures simple brin
IV.7.1.1. Complexation ADN-PEI
IV.7.1.2. Complexation ADN-PNBHCl
IV.7.1.3. Comparaison de la complexation de l’ADN avec des tensioactifs et des polyélectrolytes
IV.7.1.4. Influence de la complexation de l’ADN avec le PEI et le PNBHCl sur la photosensibilisation de coupures simple brin
IV.7.1.5. Comparaison de l’influence de la complexation de l’ADN avec des tensioactifs et du PNBHCl sur la photosensibilisation de coupures simple brin
IV.7.2. Influence d’un lipide cationique sur la photosensibilisation de coupures simple brin
IV.8. Conclusion
Références
CONCLUSION GENERALE
