COMPARAISON DES PHENOTYPES DE FIBROBLASTES DE PATIENTS PHP1A, ACRO-R1A ET ACRO-PDE

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VOIE DE SIGNALISATION

RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G

Généralités

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont une famille de récepteurs, qui comme leur nom l’indique, sont associés à des protéines hétérotrimériques liant le GTP (guanosine triphosphate). Actuellement, plus de 800 RCPG différents ont été identifiés, classés en cinq grandes familles : rhodopsine, sécrétine, adhésion, glutamate, frizzled/taste (67). Ceci permet d’assurer une large reconnaissance de signaux variés qu’ils soient exogènes (odeurs, lumière, molécules du goût) ou endogènes (hormones et neurotransmetteurs). En effet, en fonction du couple agoniste/récepteur et du type cellulaire, les protéines G activées engendrent un signal intracellulaire permettant la génération d’une réponse cellulaire appropriée.
Les RCPG partagent tous une structure commune de sept domaines transmembranaires hydrophobes assez conservés entre les différentes familles, avec une extrémité amino-terminale extracellulaire et une extrémité carboxy-terminale intracellulaire toutes deux beaucoup plus spécifiques à chaque récepteur puisque permettant respectivement la liaison à l’agoniste et la transduction du signal, via la protéine G (68).
Une protéine G comprend trois sous-unités Gα, Gβ et Gγ, la sous-unité Gα liant une molécule de GDP (guanosine diphosphate) au niveau de son domaine GTPase. L’activation du récepteur par son agoniste permet un couplage du récepteur à la protéine G, et un échange GDP/GTP au niveau de Gα entrainant à son tour une dissociation du complexe hétérotrimérique, Gα-GTP se désolidarisant du complexe Gβ/Gγ. Gα-GTP va alors pouvoir activer des effecteurs spécifiques, jusqu’à la déphosphorylation du GTP en GDP, à l’origine de la recomposition du complexe Gαβγ et de la fin de la transduction du signal. Il existe trois grands types de sous-unité α de la protéine G (69,70):
– Gαs et Gαi, respectivement responsables d’une stimulation ou d’une inhibition de l’adénylate cyclase membranaire produisant l’adénosine 3’, 5’-monophosphate cyclique (AMPc) à partir d’adénosine triphosphate (ATP).
– Gαq activant quant à elle la phospholipase Cβ, clivant le phosphatidyl-inositol-4,5-diphosphate en inositol-triphosphate (IP3) et en diacylglycérol (DAG), seconds messagers impliqués dans la voie de la Protéine Kinase C (PKC).

Locus GNAS

La sous-unité α stimulatrice des protéines G est codée par le locus complexe GNAS, localisé sur le bras long du chromosome 20 (16). Comme détaillé dans la figure 3, ce locus soumis à empreinte parentale (21,26), peut générer plusieurs transcrits en fonction de l’exon 1 utilisé. Les transcrits Gs et XLs, traduits en protéines, Gsα et XLsα, partagent les exons 2 à 13, et diffèrent par leur premier exon. XLsα, comme Gsα, est capable de coupler un récepteur activé à la stimulation de l’adénylate cyclase (71,72).
Existence de 5 exons alternatifs d’initiation de la transcription dont les 4 premiers sont localisés dans des DMR (région différentiellement méthylée sur les deux allèles) : NESP, méthylé sur l’allèle paternel et exprimé exclusivement par l’allèle maternel ; AS (antisens), XLs et A/B, méthylés sur l’allèle maternel et exprimés exclusivement par l’allèle paternel. Gsα (avec une transcription initiée sur l’exon 1) est quant à lui exprimé de façon biallélique, sauf dans certains tissus soumis à l’empreinte parentale.
Gsα a une expression biallélique dans la plupart des tissus, mais majoritairement maternelle dans d’autres, notamment le tubule proximal rénal et certaines glandes. XLsα a une expression exclusivement paternelle dans tous les tissus. Comme déjà évoqué précédemment, des mutations inactivatrices de l’allèle maternel de GNAS sont à l’origine de la PHP 1a, alors que des mutations inactivatrices de l’allèle paternel sont responsable de pPHP ou de HOP (18). Une étude récente s’est intéressée aux conséquences de mutations dans l’exon 1 de Gsα (les autres transcrits n’étant donc pas touchés, contrairement aux mutations des exons 2 à 13, les impactant tous) : le tableau est celui d’une OHA similaire à celle observée pour les mutations des exons 2 à 13, illustrant bien que les autres transcrits, y compris XLsα, ne peuvent compenser l’absence de Gsα (73). Les épimutations du locus, entrainant des modifications de l’expression des transcrits alternatifs au désavantage de celle de Gsα dans les tissus soumis à empreinte (notamment le tubule proximal rénal), sont à l’origine de la PHP 1b (25).
Dans l’os, et donc dans le cartilage de croissance, l’expression de Gsα est supposée être bi-allélique, et c’est donc son haplo-insuffisance qui serait à l’origine de l’OHA (via une résistance au PTHrp) présente dans la PHP1a et la pPHP mais pas dans la PHP 1b. En réalité, plusieurs arguments vont à l’encontre de ce dogme. D’une part, d’un point de vue clinique, de plus en plus de publications signalent l’existence de formes modérées d’OHA dans la PHP 1b (30–32,74) et l’OHA semble plus sévère dans la PHP 1a que dans la pPHP. D’autre part, Gsα serait impliqué dans la régulation de la différenciation des cellules progénitrices mésenchymateuses en ostéoblastes et adipocytes (29,75–77) et il a déjà été publié que l’expression de Gsα n’est pas strictement bi-allélique dans les progéniteurs osseux (78), expliquant à la fois le phénotype osseuse et l’obésité fréquemment observés dans les iPPSD.

PTHR1 et ses ligands, PTH et PTHrp

Le PTHR1 est un récepteur membranaire faisant partie de la famille des récepteurs couplés aux protéines G à sept domaines transmembranaires. Il est exprimé principalement dans l’os, le cartilage et le rein, mais également dans les endothélium vasculaires et de nombreux tissus en cours de développement (79).
Ses deux ligands sont la parathormone (PTH) et le parathormone-related-peptide (PTHrp), deux peptides de respectivement 84 et 141 acides aminés, partageant une similitude de séquence dans leur extrémité N-terminale de 34 résidus permettant leur couplage au récepteur (figure 4) (80).
La PTH est une hormone peptidique hyper-calcémiante et hypo-phosphatémiante sécrétée par les glandes parathyroïdes en réponse à une levée d’inhibition du récepteur sensible au calcium, le CaSR (récepteur à sept domaines transmembranaires couplé à une protéine Gα11), suite à une hypocalcémie. Dans le tubule distal rénal, elle augmente la réabsorption tubulaire du calcium. Dans le tubule rénal proximal, elle diminue la réabsorption tubulaire des phosphates et active l’expression de la 1α hydroxylase, l’enzyme responsable de l’activation de la 25(OH)-vitamine D en calcitriol (1,25(OH)2-vitamine D). A concentrations physiologiques, et secrétée sous forme pulsatile (environ un pic toutes les 7 à 10 minutes), la PTH est anabolisante (elle favorise la minéralisation de l’os). Secrétée en excès, elle favorise la résorption ostéoclastique.
Présence d’une extrémité commune N-terminale 1-34 permettant la reconnaissance du PTHR1 avec les 14 premiers résidus se liant au récepteur dans sa portion extracellulaire alors que les résidus 15 à 34 se lient à sa portion intramembranaire. La portion C-terminale joue un rôle dans la reconnaissance d’autres protéines d’interaction (81).
Le PTHrp, sécrété par de nombreux tissus en développement, exerce quant à lui un effet essentiellement paracrine sur l’os et le cartilage de croissance. Outre le rôle qu’il joue dans la pathogénie des hypercalcémies humorales malignes, le PTHrp a des actions physiologiques propres pendant la vie fœtale et la croissance, en particulier pour la chondrogenèse, en ayant un rôle dans la différenciation et la prolifération des chondrocytes de la plaque de croissance (58,82). Plusieurs voies de signalisation cellulaire peuvent être activées par la liaison de la PTH ou du PTHrp au PTHR1. En premier lieu, le PTHR1 est couplé à une protéine Gs dont la sous-unité α stimule l’adénylate cyclase et active la voie de signalisation AMPc/PKA que nous allons décrire en détails plus loin. Mais il a également été montré que le PTHR1 peut aussi être couplé à Gqα, Gα12-13 ou à des β-arrestines et activer ainsi respectivement la voie de la PKC, de RhoA et de ERK1-2 (81).
La régulation du signal engendré par la liaison du PTHR1 à l’un de ses ligands peut faire intervenir des phénomènes de désensibilisation des récepteurs (par leur internalisation le plus souvent), de rétrocontrôle hormonal et de clairance des hormones, comme on le détaillera dans le chapitre 2.6 (p.52).

AMP CYCLIQUE

Bases biochimiques

L’adénosine 3’,5’ monophosphate cyclique (AMPc), second messager identifié en 1958 par Sutherland et Rall (83,84), est un nucléotide cyclique de faible poids moléculaire, impliqué dans un grand nombre de fonctions biologiques. Il se compose d’un résidu d’adénine, et d’un ribose estérifié par un groupe phosphate.
Il est synthétisé à partir de l’adénosine triphosphate (ATP) par les adénylcyclases sous l’action d’une protéine Gsα libérée après activation d’un RCPG (70,85) et dégradé en AMP par les phosphodiestérases (84) (figure 5).
Les AC membranaires sont codées par neuf gènes. Elles se composent de deux domaines transmembranaires (M1 et M2) et de deux domaines cytoplasmiques (C1 et C2). Une dixième adénylate cyclase, soluble et cytosolique, a plus récemment été identifiée, et est codée par un dixième gène. Les AC peuvent être stimulées par la forskoline et inhibées par certains analogues de l’adénosine (3’AMP, 2’-deoxy-3’-AMP) (86).

Cibles de l’AMPc

Après sa synthèse à la membrane cellulaire, l’AMPc va avoir principalement 3 voies d’utilisation en compétition que nous allons décrire en détails par la suite : activation de la protéine kinase A, activation de la voie Epac/Rap/ERK, et dégradation par les phosphodiestérases (87–89). Ces trois voies s’entrecroisent à de nombreux niveaux et se régulent entre elles (figure 6).
Après sa production par les adénylcyclases secondairement à la liaison d’un agoniste et de son RCPG, l’AMPc , en tant que 2nd messager intracellulaire, va pouvoir activer la voie de la PKA, la voie EPAC ou être dégradé par les PDE. A noter que dans certaines cellules, notamment myocardiques, l’AMPc peut également directement interagir avec des canaux calciques membranaires.
Il existe alors différents gradients des taux d’AMPc intracellulaires, avec une modulation de l’amplitude, de la durée et de la localisation de ce second messager. Plusieurs phénomènes concordent à un arrêt du signal avec une diminution de la quantité d’AMPc : l’arrêt de la synthèse d’AMPc (internalisation et/ou phosphorylation des récepteurs, découplage entre le RCPG et la protéine G) et sa dégradation par les PDE.
Afin d’étudier au mieux les propriétés pharmacologiques des différents activateurs et inhibiteurs de ces voies de signalisation, de nombreux analogues de l’AMPc ont été synthétisés, certains étant perméables aux membranes cellulaires. On peut citer notamment le 8-bromo-AMPc, moins sensible aux PDE, le 8-piperidino-AMPc (8-PIP-AMPc) et le 8-aminihexylamino-AMPc (8-AHA-AMPc) qui se lient respectivement et spécifiquement aux domaines A et B des sous-unités régulatrices de la PKA, et les analogues de l’AMPc modifiés en 2’-OH qui activent spécifiquement Epac (90).

PROTEINE KINASE A

Les gènes codant pour des protéines kinases représentent 2% du génome humain. Toutes ces enzymes partagent un noyau catalytique très conservé (91). La protéine kinase AMPc-dépendante, ou PKA, est la première à avoir été cristallisée (92). Elle avait été identifié en 1968, comme étant la cible principale de l’AMPc (93).
A l’état basal, la PKA est un hétérotétramère composé de 2 sous-unités régulatrices séquestrant 2 sous-unités catalytiques. Divers travaux depuis plus de trente ans, en grande majorité par l’équipe de Susan Taylor, utilisant des techniques de cristallographie, de résonance magnétique nucléaire, de fluorescence et de spectrométrie de masse, nous permettent d’avoir une vision de plus en plus claire des mécanismes dynamiques à l’origine de la régulation de cette signalisation après augmentation des taux intracellulaires d’AMPc (88,94–98).

Description

Sous-unités catalytiques

Il existe deux isoformes de sous-unité catalytique : Cα qui est ubiquitaire et Cβ. Cette protéine de 40 kDa se compose d’un noyau catalytique type serine/thréonine kinase très conservé flanqué de résidus spécifiques à la PKA, l’extrémité N-terminale (39 acides aminés) permettant le rapprochement du substrat vers le noyau catalytique et l’extrémité C-terminale (50 acides aminés) permettant la liaison aux protéines partenaires et la reconnaissance du substrat (figure 7).
Le noyau catalytique se compose d’un petit lobe en N terminal, riche en feuillets β, très mobile, avec un site de liaison à l’ATP au sein d’une poche hydrophobe et d’un grand lobe en C terminal, majoritairement composé d’hélices α, très stable et porteur des structures de positionnement de l’atome de phosphore (boucle riche en glycine, boucle d’activation). Ces deux lobes sont séparés par une fente porteuse du site catalytique à proprement parler dans laquelle le substrat (avec un site consensus Arg/Lys-Arg-X-Ser/Thr-résidu hydrophobe) et un complexe Mg-ATP sont rapprochés (92,95,99,100).
Plusieurs variants d’épissage existent au niveau de l’extrémité N-terminale, permettant probablement à chacun une localisation variable des sous-unités catalytiques dans des microdomaines cellulaires (101).
Deux sites de phosphorylation ont été identifiés dans ces sous-unités (102,103):
– le premier en position Ser338, dans l’extrémité C-terminale, avec une auto-phosphorylation en cis, par le site catalytique de cette même sous-unité lui-même, et qui intervient alors que la sous-unité catalytique est encore en cours de synthèse dans le ribosome, sans laquelle la suite de la traduction est bloquée et qui confère une forme active d’emblée à l’enzyme
– le second au niveau de Thr197, au sein de la boucle d’activation catalytique, avec une phosphorylation en trans par une autre sous-unité catalytique de la PKA, également indispensable pour l’activité catalytique de la PKA.
Protéine composée de 350 acides aminés, avec un petit lobe constitué des résidus 40 à 128 et d’un grand lobe constitué des résidus 129 à 350. L’extrémité N terminale (rond vert) permet le rapprochement entre le substrat et le noyau catalytique, tandis que l’extrémité C terminale (rond violet) permet la reconnaissance du substrat. A noter le positionnement des deux résidus soumis à phosphorylation : Thr197 dans le grand lobe et Ser 338 dans l’extrémité C terminale. Le noyau catalytique se situe dans une poche formée dans l’espace entre les deux lobes. Sur la droite, schématisation de la conformation tridimensionnelle de la protéine.
La sous-unité catalytique sous forme active agit selon un cycle d’ouverture et de fermeture de la fente située entre les deux lobes : c’est dans cette dernière que, dans le site catalytique, viennent se rencontrer le substrat protéique à phosphoryler en sérine/thréonine, l’atome de phosphore sur le noyau de l’adénosine. Ces différentes conformations ouvertes et fermées de la sous-unité ont été mises en évidence par cristallographie (94,95,99,104).

Sous-unités régulatrices

Il existe quatre isoformes de sous-unités régulatrices, de 50-57 kDa : R1α et R2α qui sont ubiquitaires tandis que R1β et R2β sont tissus spécifiques (respectivement dans le cerveau et les testicules, et les surrénales et le tissu adipeux) (105), aucune n’étant redondante (106,107). Les sous-unités R1 sont beaucoup plus affines à l’AMPc (108).
Elles se composent (100,109–111) (figure 8):
– d’un domaine de dimérisation/ancrage (DD pour dimerization/docking) en région N-terminale servant à la fois à la dimérisation entre deux sous-unités régulatrices et à la fixation aux AKAP (A Kinase Anchor Protein) permettant comme on le détaillera plus loin de fixer la PKA dans des gros complexes protéiques variants selon les domaines cellulaires
– d’une région de liaison porteuse du site inhibiteur consistant en un pseudo substrat de la sous-unité catalytique et sensible aux protéases
– puis de deux sites de liaisons à l’AMPc en région C-terminale: les domaines A et B, hautement conservés, associant un feuillet β (contenant une Phospho-Binding Cassette, PBC) et une hélice α.
Figure 8 : sous-unité régulatrice de la PKA.
En haut, schématisation en 2D avec de gauche à droite, l’extrémité N terminale, le domaine de dimérisation DD permettant la liaison aux AKAP, le site auto-inhibiteur IS agissant comme pseudo substrat des sous-unités catalytiques, les domaines A et B de liaison à l’AMPC contenant tous deux une PBC) et l’extrémité C terminale. En bas, schématisation en 3D sous forme de homodimère lié à une AKAP.

Conformation tétramérique et cycle activation/désactivation

A l’état basal, en l’absence d’AMPc, la protéine kinase A est un tétramère très stable, avec une grande surface d’interaction entre sous-unité (3-4000 Å) due à un étirement maximal de chaque sous-unité régulatrice pour englober une sous-unité catalytique. Ainsi, le domaine A recouvre le grand lobe, le domaine B le petit lobe, tandis que le site inhibiteur bloque le site catalytique. Les sous-unités catalytiques sont ainsi séquestrées à l’état actif, c’est à dire déjà phosphorylées par de l’ATP, et prêtes à phosphoryler à leur tour un substrat à leur libération (98,100). Après stimulation par un agoniste et libération d’AMPc dans la cellule, ce dernier va d’abord se lier au domaine B entrainant un 1er changement conformationnel de la sous-unité régulatrice permettant la libération du domaine A, auquel peut ainsi également se lier l’AMPc. Il existe alors un 2ème changement conformationnel entrainant la dissociation et la libération des sous-unités catalytiques. Les sous-unités régulatrices sont à ce moment-là sous forme compactée, compartimentalisées à distance des sous-unités catalytiques par les AKAP. Secondairement à la diminution de la concentration intra-cellulaire d’AMPc, les domaines A et B sont libérés, amenant au ré-étirement des sous-unités régulatrices qui peuvent à nouveau se fixer aux catalytiques et reconformer ainsi le tétramère inactivé (figure 9).
(1) Liaison de l’AMPc (étoile noire) aux domaines B des sous-unités régulatrices de la PKA. (2) Changement conformationnel avec libération des domaines A sur lesquels peut se fixer l’AMPc. (3) Nouveau changement conformationnel avec étirement des sous-unités régulatrices et dissociation de la région auto-inhibitrice (losange bleu) du site catalytique. (4) Dissociation entre les sous-unités régulatrices dans une forme compactée et des sous-unités catalytiques. (5) Séquestration des sous-unités régulatrices par les AKAP (rectangle turquoise accroché au domaine de dimérisation) tant que la concentration d’AMPc est suffisante. (6) Avec la décroissance des taux d’AMPc, ré-étirement des sous-unités régulatrices qui se relient aux sous-unités catalytiques sous la forme de l’holoenzyme PKA tétramérique.

Cibles de phosphorylation

On distingue couramment deux types d’action distincts de la PKA :
• la phosphorylation directe de nombreuses protéines, membranaires, cytosoliques ou détaillerons plus loin, la PKA phosphoryle et active notamment la PDE4D, entrainant par conséquent une auto-régulation via une diminution des taux d’AMPc intracellulaires (112)
• l’activation transcriptionnelle secondaire à la phosphorylation en Ser133 de la protéine CREB (cAMP-responsive element binding protein), un facteur de transcription à domaine bZIP se liant sur l ‘ADN à des éléments CRE, des palindromes de 8 paires de bases «TGACGTCA» très conservés (113) entrainant ainsi la transcription de gènes via le recrutement du complexe RNA polymérase II (114,115) puis la synthèse de protéines spécifiques.

Compartimentalisation cellulaire

« Cycle » intra-extra nucléaire

Comme vu précédemment, lors de l’augmentation des taux intracellulaires d’AMPc, l’holoenzyme PKA cytosolique se dissocie, libérant les sous-unités catalytiques dans une forme active, phosphorylant leurs cibles à la chaîne selon un cycle régulier leur conférant le qualificatif de « molecular switch » ou interrupteur moléculaire.
Ces sous-unités catalytiques peuvent soit rester dans le cytosol, et seront inactivées à la décroissance des taux d’AMPc (entre autres sous l’action des phosphodiestérases) par la reconformation du tétramère (116), soit passer dans le noyau avec un passage facilité par des AKIP (A kinase interacting protein) pour faciliter l’activation transcriptionnelle secondaire à la phosphorylation de CREB (117). Dans cette deuxième situation, l’export nucléaire des sous-unités catalytiques est favorisé par le PKI (protein kinase inhibitor) agissant également comme un pseudo-substrat avec un motif de résidus Arg-Arg-Gly-Ala-Ile (92,118–120) (figure 10).
Des travaux récents mettant en évidence l’existence d’une holoenzyme PKA intra-nucléaire bouscule un peu le dogme du cycle nucléaire de la PKA, suggérant que ce pool intra-nucléaire pourrait être mobilisé rapidement pour activer la transcription de certains gènes (121).
(1) stimulation du RCPG par liaison d’un agoniste. (2) Synthèse d’AMPc après stimulation de l’adénylate cyclase par Gsα. (3) Liaison de l’AMPc aux domaines B puis A des sous-unités régulatrices de la PKA avec libération des sous-unités catalytiques. (4) Translocation intranucléaires des sous-unités catalytiques favorisée par AKIP. (4’) Dégradation de l’AMPc en AMP sous l’action des PDE, notamment PDE4D. (5) Activation transcriptionnelle par CREB phosphorylé se liant sur l’ADN à CRE. (6) Rétrocontrôle du signal avec PKI inhibant le site catalytique et favorisant le clivage des sous-unités catalytiques dans le cytosol avec reconformation de l’holoenzyme PKA inactive.

AKAP

Les AKAPs (A Kinase Anchoring Proteins) sont une famille d’une cinquantaine de protéines dont le rôle principal est de s’ancrer aux sous-unités régulatrices de la PKA afin de positionner l’holoenzyme dans les compartiments cellulaires voulus. Elles assurent ainsi le contrôle spatial et temporel de la transduction du signal (122).
Les AKAPs possèdent :
– un domaine conservé de liaison à la PKA, le AKB (A-kinase binding domain) interagissant avec le domaine de dimérisation d’un homodimère de sous-unités régulatrices (123– 125), en se logeant dans une hélice α amphipathique, à savoir possédant une face hydrophile et un face hydrophobe (111,126)
– un domaine d’adressage spécifique leur permettant de se lier à des structures du cytosquelette (actine, tubuline notamment) ou des organelles afin d’en rapprocher la PKA (127).
Les AKAPs peuvent également s’associer à d’autres kinases, des phosphatases, des phosphodiestérases et Epac (128,129).
In fine, les AKAP créent des microdomaines en rapprochant la PKA de ses substrats et interviennent dans l’arrêt du signal en colocalisant la PKA et certaines PDE, Epac, des adénylcyclases (87,122,127,130–132) (figure 11).
Les différentes AKAP colocalisent la PKA dans un domaine cellulaire avec ses substrats et d’autres enzymes pouvant réguler le signal.

Mutations identifiées de PRKAR1A

L’article princeps de notre équipe, en collaboration avec E. Clauser, publiée dans le NEJM en 2011 (41) a décrit une mutation ponctuelle non-sens récurrente de PRKAR1A, remplaçant en position c.1102 une cytosine en thymine, à l’origine d’une protéine tronquée avec remplacement d’une arginine par un codon-stop en position 368 (mutation R368X). Cette mutation est localisée dans le domaine B de fixation de l’AMPc, et la protéine tronquée perd son affinité pour ce dernier. Comme expliqué précédemment, cette liaison de l’AMPc au domaine B est le phénomène initiateur de la dissociation des sous-unités régulatrices et catalytiques de la PKA et dans cette situation, il ne peut pas y avoir libération des sous-unités catalytiques. Il avait d’ailleurs déjà ét illustré que la tyrosine positionnée en 371 était primordiale à l’initiation des changements conformationnels de la protéine PRKAR1A secondaire à la liaison de l’AMPc au domaine B (figure 12) , et cette dernière est absente dans la protéine tronquée (100).
La liaison de l’AMPc au domaine B entraine la captation de sa PBC par Tyr371 à l’origine de la cassure d’un pont entre Glu261 et Arg366 responsable d’un changement de la configuration 3D de la protéine avec libération du domaine A sur lequel l’AMPc peut se fixer, entrainant alors un nouveau changement conformationnel et la libération des sous-unités catalytiques.
L’étude fonctionnelle des conséquences de cette mutation a mis en évidence des concentrations d’AMPc plasmatiques et urinaires plus élevées chez les patients que chez les contrôles, une diminution de l’activité transcriptionnelle secondaire à une stimulation de la voie RCPG/PKA dans les HEK293 transfectées avec un plasmide permettant l’expression de la PRKAR1A mutée R368X, et une diminution de la dissociation des sous-unités régulatrices et catalytiques étudiée par technique de bioluminescence en couplant les sous-unités régulatrices et catalytiques à des fluorophores (technique de BRET détaillée dans le chapitre « Matériels et Méthodes »). Par ailleurs, nous avons constaté que la protéine tronquée est exprimée en quantité plus importante que la protéine sauvage dans les cellules des patients (quantification par Western Blot) ce qui s’explique probablement par la dégradation plus rapide de la protéine sauvage, plus fragile quand non incluse au sein de l’holoenzyme PKA. Il y a donc plus d’holoenzyme contenant la protéine tronquée, expliquant ainsi l’effet dominant négatif de cette mutation hétérozygote (41).
Par la suite, d’autres publications ont suivies, la première ayant confirmé pour une nouvelle mutation (p.T239A) le défaut fonctionnel que nous avions mis en évidence pour la mutation p.R368X (47). Il existe à l’heure actuelle 18 mutations ponctuelles de PRKAR1A publiées responsables d’acrodysostose (tableau 5), dont 13 dans le domaine B et 5 dans le domaine A de liaison à l’AMPc. La séquence en acides aminés de la PRKAR1A est très conservée entre les espèces, et toutes ces mutations affectent des acides aminés conservés.

Table des matières

INTRODUCTION
1. PATHOLOGIES DE LA SIGNALISATION DE L’AMP CYCLIQUE
1.1 PSEUDOHYPOPARATHYROIDIE
1.1.1 Classification historique des pseudohypoparathyroïdies
1.1.2 Génétique des pseudo-hypoparathyroïdies
1.2 ACRODYSOSTOSE
1.2.1 Description clinique historique
1.2.2 Génétique
1.2.3 Modèle murin
1.3 COMPARAISON DES PHENOTYPES
1.4 NOUVELLE CLASSIFICATION
2. VOIE DE SIGNALISATION
2.1 RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G
2.1.1 Généralités
2.1.2 Locus GNAS
2.1.3 PTHR1 et ses ligands, PTH et PTHrp
2.2 AMP CYCLIQUE
2.2.1 Bases biochimiques
2.2.2 Cibles de l’AMPc
2.3 PROTEINE KINASE A
2.3.1 Description
2.3.2 Compartimentalisation cellulaire
2.3.3 Mutations identifiées de PRKAR1A
2.4 PHOSPHODIESTERASES
2.4.1 Généralités
2.4.2 La phosphodiestérase 4D
2.4.3 Mutations identifiées dans l’acroPDE
2.4.4 Etudes fonctionnelles des mutations
2.5 EPAC
2.5.1 Définition
2.5.2 Structure protéique
2.6 REGULATION DU SIGNAL
2.6.1 Régulation du signal au niveau du couple agoniste / RCPG
2.6.2 Génération de microdomaines cellulaires
OBJECTIFS DU TRAVAIL
MATERIELS ET METHODES
1. CULTURE CELLULAIRE
1.1 Mise en culture d’une biopsie cutanée
1.2 Entretien de lignées de fibroblastes
1.3 Lignées immortalisées
1.4 Stimulation des cellules
2. TECHNIQUES « COURANTES »
2.1 RT-PCRq
2.1.1 Extraction des ARNs
2.1.2 PCR quantitative en temps réel
2.2 Dosage immuno-enzymatique d’AMPc
2.3 Western blotting
2.3.1 Préparation des échantillons protéiques
2.3.2 Electrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide (SDS- PAGE)
2.3.3 Transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose
2.3.4 Immunomarquage, révélation et quantification
2.4 Activité CRE-luciférase
2.5 Analyses statistiques
3. AUTRES TECHNIQUES
3.1 Analyse en temps réel de la concentration d’AMPc par BRET
3.1.1 Principe du BRET
3.1.2 Description et fonctionnement du plasmide CAMYEL
3.1.3 Protocole expérimental
3.2 Pull-down Rap1
3.2.1 Principe
3.2.2 Protocole expérimental
RESULTATS
1. ETUDES IN VITRO DE LA MODULATION DE LA VOIE DE L’AMP CYCLIQUE PAR LES PDE4
1.1 Introduction
1.2 Article
1.3 Discussion complémentaire
2. COMPARAISON DES PHENOTYPES DE FIBROBLASTES DE PATIENTS PHP1A, ACRO-R1A ET ACRO-PDE
2.1 Introduction
2.2 Résultats
2.2.1 Expression des transcrits et des protéines de la voie de signalisation
2.2.2 Exploration de la réponse aux agonistes en présence ou non d’inhibiteur de PDE
2.3 Discussion
3. ETUDE FONCTIONNELLE DES MUTATIONS DU GENE PDE4D
3.1 Mise au point de la technique
3.2 Etude de la mutation S190A localisée en UCR1
3. 3 Discussion
CONCLUSIONS
BIBLIOGRAPHIE

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