Comparaison des paramètres spermatiques conventionnels

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Impact des cancers sur les paramètres spermatiques conventionnels

Les données de la littérature concernant l’impact des cancers sur les paramètres spermatiques conventionnels (concentration, mobilité et morphologie) sont rares, concernent majoritairement deux types de cancers (le CT et le lymphome) et soulèvent certaines controverses.
Chez les patients atteints d’un CT, une diminution de la concentration en spermatozoïdes (Caponecchia et al., 2016), de la mobilité (Bujan et al., 2013), et du pourcentage de spermatozoïdes à morphologie normale (Bussen et al., 2004) a été rapportée. Pourtant, 37% (O’Flaherty et al., 2008) à 60% (Rives et al., 2017) de ces patients présentaient des paramètres spermatiques normaux. Ces différences observées peuvent être expliquées par le type histologique de la tumeur. En effet, le séminome altère plus significativement la production de spermatozoïdes par comparaison aux tumeurs germinales non séminomateuses (Rives et al., 2012). Physiologiquement, l’effet du CT sur la spermatogenèse pourrait être expliqué d’une part, par des effets loco-régionaux néfastes tels qu’une compression pouvant altérer les cellules de Leydig et provoquer une diminution du niveau des androgènes, mais également par la mise en place d’un micro-environnement inflammatoire au sein des tubes séminifères non envahis par les cellules tumorales, provoquant la fibrose du tissu interstitiel (O’Donovan et al., 2005), et d’autre part, par la survenue d’un dysfonctionnement de la spermatogenèse au sein du testicule sain controlatéral. Chez les patients atteints d’un lymphome Hodgkinien (LH), de multiples altérations du spermogramme ont été rapportées (Rueffer et al., 2001) dont une diminution de la concentration en spermatozoïdes (Caponecchia et al., 2016) mais sans relation significative avec les différents stades de la maladie (Fait et al., 2001). Ces résultats ne sont pas retrouvés dans toutes les études : entre 75% (Paoli et al., 2016) et 81% (O’Flaherty et al., 2008) des patients atteints d’un LH sont normozoospermiques. Le dysfonctionnement gonadique observé dans le lymphome est probablement la conséquence soit d’un stress entrainant une altération du taux des catécholamines et une hyperprolactinémie (Ribeiro et al., 2008), soit d’un effet systémique de la maladie via l’augmentation d’acteurs pro-inflammatoires tels que les cytokines qui peuvent provoquer une hyalinisation des tubes séminifères (O’Donovan et al., 2005). Un taux élevé d’interleukines (IL-1, IL-6) et de cytokines (TNFα) dans le liquide séminal et dans le sérum, a été retrouvé chez des patients ayant une spermatogenèse sévèrement altérée (Rueffer et al., 2001 ; Stahl et al., 2009). En revanche, l’étude de O’Donovan et al. (2005), examinant plusieurs types de cancers, n’a montré aucune altération de la numération ou de la mobilité spermatique chez les patients atteints d’un CT, d’un LH, d’un LNH, d’une leucémie et d’un cancer solide (CS) non urologique par rapport aux hommes issus d’une population contrôle fertile.
Ces données contradictoires peuvent s’expliquer par une hétérogénéité des méthodes, des pathologies, des patients étudiés ainsi que de la population contrôle qui est soit une population d’hommes en bonne santé, soit des hommes infertiles ou des donneurs de spermatozoïdes fertiles. Par ailleurs, les effectifs restent souvent faibles.

Impact des cancers sur l’ADN spermatique

L’évaluation des altérations de l’ADN spermatique dans le contexte du cancer s’effectue généralement par la quantification des cassures de l’ADN simple ou double brin, l’analyse du niveau de condensation de la chromatine et du taux d’aneuploïdie des spermatozoïdes. Ces études se sont intéressées à différents types de cancers, et soulèvent d’importantes controverses notamment dû à l’utilisation de différentes méthodes d’analyse.
Chez les patients atteints d’un CT, le taux de fragmentation de l’ADN spermatique ou de cassures de l’ADN simple brin est soit normal (Ribeiro et al., 2008 ; Smit et al., 2010 ; McDowell et al., 2013) soit augmenté (O’Donovan et al., 2005 ; Spermon et al., 2006 ; Meseguer et al., 2008 ; O’Flaherty et al., 2008 ; Stahl et al., 2009). Par ailleurs, les anomalies de condensation de la chromatine spermatique sont augmentées chez les patients atteints d’un CT (Spermon et al., 2006). Enfin, l’aneuploïdie spermatique n’est pas modifiée dans le CT par comparaison à une population contrôle (Tempest et al., 2008). Cependant, une étude récente révèle une augmentation des disomies X et Y dans le même contexte (Rives et al., 2017).
Chez les patients atteints d’un LH, plusieurs études montrent une réelle augmentation de la fragmentation de l’ADN spermatique (O’Donovan et al., 2005 ; Meseguer et al., 2008 ; O’Flaherty et al., 2008) et des taux de cassures de l’ADN simple brin normaux (Smit et al., 2010 ; McDowell et al., 2013) ou augmentés (Stahl et al., 2009 ; O’Flaherty et al., 2008). Par ailleurs, les anomalies de condensation de la chromatine spermatique sont augmentées chez les patients atteints d’un LH (O’Flaherty et al., 2008). Enfin, l’aneuploïdie spermatique est augmentée dans le LH par comparaison à une population contrôle (Fait et al., 2001 ; Frias et al., 2003 ; Tempest et al., 2008). Le taux de fragmentation de l’ADN spermatique ne varie pas entre différents types de cancers (CT, leucémie, LH, LNH) (O’Donovan et al., 2005 ; Meseguer et al., 2008) même si le taux de cassures de l’ADN simple brin semble être augmenté dans le LNH (Smit et al., 2010), tandis qu’il semble normal chez les patients atteints d’une leucémie (Smit et al., 2010 ; McDowell et al., 2013) ou d’un CS non urologique (McDowell et al., 2013). Par ailleurs, les anomalies de condensation de la chromatine spermatique sont augmentées chez les patients tout type de cancer confondu (leucémie, LH, LNH et CT) (O’Donovan et al., 2005).
Les études ayant envisagé une exploration simultanée de différentes altérations du noyau spermatique dans ce contexte restent peu nombreuses (O’Flaherty et al., 2008). De plus, les données de la littérature restent très controversées et ne permettent pas d’évaluer précisément l’impact du cancer sur la spermatogenèse. Par ailleurs, aucune étude n’a, à ce jour, évalué l’impact du type histologique du cancer, au moment de la conservation des spermatozoïdes et avant toute prise en charge thérapeutique, sur le nombre et la longueur des télomères ainsi que sur l’épigénome du spermatozoïde.

Objectif du travail

Les dommages à l’ADN spermatique peuvent avoir un effet négatif sur le taux de fécondation in vitro, entraver le développement embryonnaire et également être pro-mutagènes (Kopeika et al., 2015). Ces altérations peuvent conduire à une fausse couche, une mort fœtale in utero, une mort subite du nourrisson, des malformations infantiles, la transmission de maladies génétiques incluant les cancers et la transmission de maladies épigénétiques (Frias et al., 2003 ; Marchetti et al., 2005 ; Siderakis et Tarsounas, 2007 ; Reig-Viader et al., 2014 ; Kopeika et al., 2015). Ainsi, l’intégrité de l’ADN spermatique joue un rôle fondamental dans les chances de paternité. C’est pour cela qu’une amélioration des connaissances sur les dommages spécifiques de l’ADN spermatique induits par le cancer semble indispensable pour identifier des facteurs prédictifs de chance de succès des techniques d’Assistance Médicale à la Procréation (AMP) par utilisation de ces spermatozoïdes conservés au moment du diagnostic de la maladie.
Les objectifs de ce projet de recherche ont été (i) d’explorer le noyau spermatique dans le champ du cancer en appréhendant par différentes approches méthodologiques les dommages à l’ADN spermatique et (ii) de caractériser ces anomalies en fonction du type de cancer [CT, LH, LNH, CS, leucémie aigüe (LA)].
Dans notre étude, l’évaluation des altérations nucléaires spermatiques a été réalisée chez 50 patients et 30 témoins, par l’analyse de l’aneuploïdie (FISH), le nombre et la longueur relative des télomères (PNA Q-FISH), la fragmentation de l’ADN (TUNEL), la condensation de la chromatine (Bleu d’aniline), les dommages oxydatifs à l’ADN (8 OHdG) et l’évaluation de la méthylation de deux gènes soumis à empreinte parentale, H19 paternelle et MEST maternelle (Pyroséquençage précédé d’un traitement de l’ADN au bisulfite).

Matériels et méthodes

Population étudiée et échantillons biologiques

Cette étude a été conduite dans une population de 50 hommes, âgés entre 17 et 48 ans, ayant consulté dans 5 laboratoires français de Biologie de la Reproduction-CECOS [Rouen (n=42), Lille (n=1), Caen (n=1), Cochin (n=4) et Tenon (n=2)] pour une conservation de spermatozoïdes avant la prise en charge thérapeutique d’un cancer, entre le 1er Janvier 1986 et le 31 Décembre 2013. Aucun patient n’avait reçu de traitement gonadotoxique préalablement à la préservation de leur fertilité. Ces patients ont décidé d’arrêter la conservation de leurs spermatozoïdes et de faire don de ceux-ci pour la recherche après signature d’un consentement éclairé. Les échantillons de sperme ont été collectés par masturbation après un délai d’abstinence sexuelle de 2 à 7 jours mais face à l’urgence thérapeutique pour certains cancers, 8 patients ont présenté un délai d’abstinence sexuelle supérieur à 7 jours. Les paramètres spermatiques conventionnels ont été interprétés selon les critères de l’Organisation Mondiale de la Santé définis en 2011 (OMS, 2011), après liquéfaction du sperme (20 à 30 minutes à température ambiante). Les paramètres spermatiques conventionnels étudiés comprenaient le volume de l’éjaculat (mL), la concentration spermatique (millions/mL), la numération spermatique (millions/éjaculat), la mobilité progressive (a+b, %), la vitalité spermatique (%) et la morphologie qui a été interprétée selon les critères de David modifiés (Auger et al., 2001). Le sperme a été, par la suite, dilué avec le cryoprotecteur, conditionné dans des paillettes et congelé via un appareil de congélation automatisé. Le stockage des paillettes était effectué dans l’azote liquide à -196°C. Un test de décongélation a été réalisé avant l’exploration nucléaire spermatique, en utilisant une paillette (250L) de sperme réchauffée pendant 5 minutes à 37°C afin d’estimer la mobilité progressive (a+b, %) post-décongélation. Ces spermatozoïdes congelés destinés à la recherche sont conservés dans le Centre de Ressources Biologiques certifié « Germethèque » (ISO 9001, 091031/1020F). Nous avons défini 5 groupes de patients selon le type de cancer : (i) groupe 1, CT (n=10) ; (ii) groupe 2, LH (n=10) ; (iii) groupe 3, LNH (n=10), (iv) groupe 4, CS non urologique (n=10) ; (v) groupe 5, LA myéloïde ou lymphoïde (n=10). Une exploration des altérations nucléaires spermatiques sur spermatozoïdes congelés a été réalisée et incluait une analyse du taux d’anomalies chromosomiques par hybridation in situ en fluorescence (FISH), une analyse du nombre et de la longueur relative des télomères par hybridation in situ en fluorescence quantitative à l’aide de sondes d’acides nucléiques peptidiques (PNA Peptide Nucleic Acid) et couplées à un fluorochrome (PNA Q-FISH), une détection de la fragmentation de l’ADN par la technique Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labelling (TUNEL), de la condensation de l’ADN par la coloration au bleu d’aniline (BA), de l’oxydation de l’ADN par la détection du 8 hydroxy-2-désoxyguanosine (8 OHdG) et d’une analyse de la méthylation de deux GSE parentale (H19 paternelle et MEST maternelle) par la technique du pyrosequençage précédé d’un traitement de l’ADN au bisulfite.
Une population de 30 hommes fertiles, en bonne santé, âgés entre 24 et 46 ans, donneurs de spermatozoïdes, aux paramètres spermatiques normaux selon les critères de l’OMS (2011) et avec un caryotype constitutionnel normal a été utilisée comme témoins.

Analyse de la qualité nucléaire spermatique

Technique FISH

La FISH en triple marquage est une technique moléculaire de cytogénétique qui évaluait le taux  d’aneuploïdie spermatique des chromosomes sexuels (X et Y) et d’un autosome (18).
Les spermatozoïdes, après 3 lavages avec du Phosphate-Buffered Saline (PBS, BioMérieux, Marcy l’Etoile, France) 1X pendant 10 minutes à 2000 tours/minute, étaient fixés sur des lames Superfrost (Polylysine Slides®, Menzel Gläser, Braunschwein, Allemagne) avec du méthanol pur (Méthanol RPE, Carlo Erba Reagents, Val de Reuil, France) durant 30 minutes à -20°C. Les noyaux spermatiques étaient décondensés à l’aide d’une solution de NaOH 1M pendant 3 minutes après avoir été rincés dans du PBS pendant 2 minutes. La décondensation des noyaux était stoppée par immersion des lames dans deux bains de 2 minutes successifs dans du tampon SSC 2X. La FISH en triple marquage utilisait des sondes centromériques couplées au fluorochrome rouge (CEP Y Sat III Spectrum Orange, Abbott, Rungis, France) pour identifier le chromosome Y, au fluorochrome vert (CEP X Spectrum Green, Abbott, Rungis, France) pour le chromosome X et au fluorochrome bleu (CEP 18 Spectrum Blue, Abbott, Rungis, France) pour le chromosome 18. Le mélange des sondes diluées au 1/3 dans le tampon d’hybridation (CEP Hybridization Buffer®, Abbott, Rungis, France) était déposé entre lame et lamelle. L’ADN spermatique et les sondes étaient dénaturés à 73°C pendant 2 minutes et hybridés à 37°C toute une nuit dans un appareil d’hybridation (Hybaid, Omnigene, Teddington, Royaume-Uni). Après lavage post-hybridation dans deux bains successifs, l’un contenant du SSC 0,4X / NP40 0,3% (Igepal®, Sigma, Chemical Co, St Louis, MO) (73°C, 2 minutes) et l’autre contenant du SSC 2X / NP40 0,1% (température ambiante, 1 minute) et déshydratation dans des bains d’alcool (70°, 90° et 100° ; 1 minute chacun), les noyaux étaient contre-colorés au 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Counterstain 1®, Adgenix, Voisin le Bretonneux, France). L’observation des lames s’effectuait à l’aide d’un microscope à fluorescence automatisé (Olympus BX61, Tokyo, Japon) associé à un analyseur d’image (Bioview Duet ver. 2.3®, Nes Ziona, Israël) au grossissement 900 (Figure 7). Un minimum de 5000 spermatozoïdes était étudié.

Technique PNA Q-FISH

L’évaluation du nombre et de la longueur relative des télomères spermatiques était effectuée via la FISH quantitative (Q-FISH) à l’aide de sondes PNA (Peptide Nucleic Acid) couplées à un fluorochrome.
Les spermatozoïdes, après 3 lavages avec du PBS pendant 10 minutes à 2000 tours/minute, étaient fixés sur des lames Superfrost avec du méthanol pur durant 30 minutes à -20°C. Les noyaux spermatiques étaient décondensés par la solution de NaOH 1M pendant 3 minutes. Après 2 minutes de rinçage dans du SSC 2X à deux reprises et 2 minutes dans du Tris-buffered saline 1X (TBS, Dako, Les Ulis, France), les spermatozoïdes étaient fixés dans du formaldéhyde à 3,7% pendant 2 minutes. Puis, ils étaient à nouveau lavés à deux reprises dans du TBS pendant 5 min. Selon les instructions du fournisseur, les sondes PNA pan-télomériques conjuguées à un fluorochrome CY3 et celles du centromère du chromosome 2 conjuguées au fluorochrome CEP2 (K5326 par DakoCytomation, Copenhague, Danemark) étaient déposées entre lame et lamelle. Les noyaux spermatiques et les sondes étaient simultanément dénaturés pendant 5 minutes à 80°C avant une hybridation pendant 2 heures à 22°C. L’hybridation était arrêtée par la solution de rinçage VIAL3 (VIAL3, K5326, DakoCytomation) pendant 1 minute à température ambiante. Les noyaux spermatiques étaient ensuite lavés avec la solution de lavage VIAL4 (VIAL4, K5326, DakoCytomation) pendant 5 minutes au bain-marie à 65°C avant déshydratation dans des bains d’alcool (70°, 90°, 100°, 2 minutes chacun). Les noyaux spermatiques étaient contre-colorés par le DAPI. Les lames étaient observées au grossissement 900x à immersion à l’aide d’un microscope automatique à épifluorescence (Olympus BX61) associé à un analyseur d’image (Bioview Duet® version 2.3). Un programme informatique dédié à la quantification de la mesure de la longueur des télomères a été développé spécifiquement par le fournisseur pour le laboratoire. L’intensité de fluorescence intégrée du centromère du chromosome 2 et des télomères a été déterminée automatiquement pour chacun des noyaux spermatiques et calculée après soustraction de l’intensité de fluorescence de fond (autofluorescence) et correction pour les temps d’exposition d’image et d’acquisition. La longueur des télomères évaluée par la technique Q-FISH correspondait à une longueur relative exprimée en Fluorescence Relative Units (FRU) et calculée selon la formule suivante : FRU = (Intensité de fluorescence des télomères/Intensité de fluorescence du centromère du chromosome 2) x 100. Au total, 200 noyaux spermatiques étaient analysés (Figure 8).

Technique TUNEL

La technique TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP Nick End Labelling) permettait d’observer in situ la fragmentation de l’ADN spermatique.
Les spermatozoïdes, après 3 lavages dans du PBS pendant 10 minutes à 2000 tours/minute, étaient fixés sur des lames Superfrost avec du méthanol pur durant 30 minutes à -20°C et devenaient perméables via la solution d’acétone (Carlo Erba Réactifs, Val de Reuil, France) pendant 2 minutes. Puis, les lames étaient incubées pendant 1 heure en chambre humide à 37°C avec le réactif composé de l’enzyme et de son substrat (nucléotides marqués au FITC), conformément aux recommandations du fournisseur (In Situ Cell Death Kit Detection POD®, Roche, Mannheim, Allemagne). Chaque lame était rincée deux fois dans du PBS 1X (10 minutes par rinçage) puis déshydratée dans des bains d’alcool (70°, 90° et 100°, 1 minute chacun). Le témoin négatif était obtenu via l’incubation de lames avec le substrat mais sans l’enzyme. L’obtention d’un témoin positif était faite via l’incubation de lames avec de la DNAse I (1mg/mL, 15 minutes, en chambre humide, à 37°C).
Les spermatozoïdes étaient contre-colorés par du iodure de propidium (Star*FISH© Kit Components, Cambio, Cambridge, UK) dilué au 1/1000ème dans de l’antifade (Antifade®, MP-QBio-Gene, Illkirch, France). Les lames étaient observées à l’aide d’un microscope à fluorescence au grossissement 1000x à immersion (DMRB®, LEICA, Solms, Allemagne) couplé à un analyseur d’image (MacProbe® version 3.3, Perspective Scientific International LTD, Chester, Angleterre). Au total, 500 spermatozoïdes étaient analysés pour chaque patient (Figure 9).

Coloration au Bleu d’aniline

La coloration au bleu d’aniline (BA) permettait de définir le degré de condensation du noyau spermatique et ainsi, le niveau de maturité nucléaire du spermatozoïde.
Les spermatozoïdes, après 3 lavages dans du PBS pendant 10 minutes à 2000 tours/minute, étaient fixés sur des lames Superfrost avec de la glutaraldéhyde 3% (30 minutes, température ambiante) (Glutaraldéhyde®, Sigma, St Louis, MO, Etats-Unis). Les lames étaient rincées deux fois à l’eau distillée puis colorées par un bain de bleu d’aniline à 5%, pH 3,5, pendant 5 minutes (Gurr®, BDH Laboratory Supplies, Angleterre). Elles étaient ensuite rapidement rincées deux fois à l’eau distillée puis déshydratées dans des bains d’alcool (70°, 90°, 100°, 1 minute chacun) avant d’être montées en Eukitt (Eukitt, EUK 100, CML, Nemours, France). La lecture était faite sur 500 spermatozoïdes sous lumière blanche au grossissement 1000x et en immersion (Leitz DMRD®, Leica, Solms, Allemagne) (Figure 10).

Marquage au 8 OHdG

L’immunofluorescence par un anticorps dirigé contre le 8 hydroxy-2-désoxyguanosine (8 OHdG) permettait de mettre en évidence l’ADN spermatique oxydé.
Les spermatozoïdes, après 3 lavages dans du PBS pendant 10 minutes à 2000 tours/minute, étaient fixés sur des lames Superfrost avec du paraformaldéhyde 4% (PFA, Sigma-Aldrich) pendant 15 minutes à 4°C. Après une réhydratation en PBST (PBS, BioMérieux et Tween 20©, Sigma-Aldrich), les noyaux spermatiques subissaient une décondensation par NaOH 1M pendant 2 minutes. Après saturation des sites non spécifiques par de l’albumine sérique bovine 5% (BSA, Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO)

Description de la population

Au total, 50 patients atteints d’un cancer ont été inclus dans cette étude parmi lesquels 46% présentaient une fertilité antérieure au diagnostic. Les caractéristiques générales de la population masculine sont représentées dans la figure 13 et le tableau 2. La figure 13 montre la répartition des anomalies spermatiques de la population masculine étudiée. Vingt-quatre patients (48%) inclus dans cette étude présentaient des paramètres spermatiques normaux (OMS, 2010). Neuf patients (35%) parmi les vingt-six patients qui présentaient un spermogramme altéré étaient fertiles. Dix hommes (20%) présentaient une tératozoospermie isolée (Té), un homme (2%) une oligozoospermie isolée (O), deux hommes (4%) une asthénozoospermie isolée (As), un homme (2%) une oligo-tératozoospermie (OT), sept hommes (14%) une asthéno-tératozoospermie (AT), trois hommes (6%) une oligo-asthénozoospermie (OA) et deux hommes (4%) une oligo-asthéno-tératozoospermie (OAT).
Les témoins étaient tous fertiles, présentaient des paramètres spermatiques normaux et avaient un caryotype sanguin normal.

Analyses comparatives entre la population étudiée d’hommes atteints d’un cancer (Patients) et le groupe contrôle (Témoins)

Comparaison des paramètres spermatiques conventionnels

Le tableau 2 résume les données comparatives entre les patients et les témoins. Les patients atteints d’un cancer sont plus jeunes (30,1 ± 7,7 vs 34,8 ± 6,1, p=0,0055) et ont une numération spermatique plus faible (150,1 ± 141,2 vs 188,7 ± 113,8, p=0,0287) que les témoins. Aucune différence significative n’a été observée entre les deux groupes, concernant le délai d’abstinence, le volume de l’éjaculat, la concentration spermatique, la morphologie, la mobilité progressive (a+b) évaluée avant congélation et après décongélation et la vitalité spermatique.
Aneuploïdie : 24,XY ; 24,XX ; 24YY ; 24,X+18 ; 24,Y+18 ; Anomalies chromosomiques totales : Aneuploïdie + Diploïdie ; BA : bleu d’aniline ; Diploïdie : 46,XX ; 46,YY ; 46,XY ; FRU : Unité de fluorescence relative ; spz : spermatozoïde ; TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP Nick End Labelling

Comparaison des altérations nucléaires spermatiques

La figure 14 présente les données comparatives de l’exploration du noyau spermatique entre les deux groupes. Les patients présentent une longueur relative des télomères (115,7 ± 61,6 vs 68,1 ± 35,6, p<0,0001 ; Figure 14 B), une fragmentation de l’ADN spermatique (11,7 ± 9,5 vs 4,4 ± 4, p<0,0001 ; Figure 14 C), des anomalies de condensation de la chromatine (15,4 ± 6,7 vs 6,2 ± 4,2, p<0,0001 ; Figure 14 D) et une méthylation moyenne du GSE maternelle MEST (5,8 ± 8,2 vs 2,8 ± 1,3, p=0,0015 ; Figure 14 F) significativement plus élevés que les témoins. Néanmoins, aucune différence significative n’a été observée entre les deux groupes concernant les anomalies chromosomiques (p=0,7091 ; Figure 14 A), le nombre moyen de télomères par spermatozoïde (p=0,6872 ; Figure 14 B), les dommages oxydatifs de l’ADN spermatique (p=0,9626 ; Figure 14 E) et la méthylation moyenne du GSE paternelle H19 (p=0,0851 ; Figure 14 F). Pourtant, en analysant la méthylation moyenne de chaque CpG du GSE H19 entre ces deux groupes, nous remarquons que deux d’entre eux sont significativement différents (Figures 14 G et 14 H). En effet, les patients ont une hypométhylation significative du CpG 6 (58,8 ± 11,5 vs 64,4 ± 5, p=0,0403) et du CpG 11 (75,8 ± 11,9 vs 80,1 ± 10,2, p=0,0374) par rapport à la population contrôle. Quant au GSE maternelle MEST, les patients présentent une hyperméthylation sur tous les CpG étudiés par rapport aux témoins (Figures 14 G et 14 H) : CpG 1 (4,5 ± 6,5 vs 1,9 ± 1,1, p=0,0026), CpG 2 (5,9 ± 7,7 vs 3 ± 1,2, p=0,008), CpG 3 (4,2 ± 6,6 vs 1,9 ± 1,3, p=0,0298), CpG 4 (10 ± 14,4 vs 5,2 ± 1,6, p=0,0061), CpG 5 (4,6 ± 7,5 vs 1,9 ± 1,4, p=0,0039).
De plus, nous n’observons aucune corrélation significative entre la longueur relative des télomères et l’âge (rp=0,0004, p=0,92 ; rT=0,105, p=0,22) ni entre la longueur relative des télomères et l’année de naissance (rp=0,005, p=0,73 ; rT=0,07, p=0,30) des patients et des témoins (Figures 15 A et 15 B).

Table des matières

Liste des tableaux
I. Introduction
I.1 Noyau du spermatozoïde
I.2 Impact des cancers sur les paramètres spermatiques conventionnels
I.3 Impact des cancers sur l’ADN spermatique
I.4 Objectif du travail
II. Matériels et méthodes
II.1 Population étudiée et échantillons biologiques
II.2 Analyse de la qualité nucléaire spermatique
II.2.1 Technique FISH
II.2.2 Technique PNA Q-FISH
II.2.3 Technique TUNEL
II.2.4 Coloration au Bleu d’aniline
II.2.5 Marquage au 8 OHdG
II.2.6 Pyroséquençage
II.3 Analyses statistiques
III. Résultats
III.1 Description de la population
III.2 Analyses comparatives entre la population étudiée d’hommes atteints d’un cancer (Patients) et le groupe contrôle (Témoins)
III.2.1 Comparaison des paramètres spermatiques conventionnels
III.2.2 Comparaison des altérations nucléaires spermatiques
III.2.3 Analyse des patients présentant des altérations nucléaires spermatiques
III.3 Analyse comparative des altérations du noyau spermatique entre la population étudiée en fonction du type de cancer et par comparaison aux témoins
III.4 Analyse comparative des altérations du noyau spermatique entre la population étudiée en fonction du spermogramme et le groupe contrôle
III.5 Corrélations entre les différents paramètres spermatiques conventionnels et nucléaires chez les patients atteints d’un cancer
IV. Discussion et conclusion
Bibliographie

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