Comparaison des identifications par MALDI/TOF et du séquençage de la région ITS

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Zygomycota

Le phylum des Zygomycota est constitué de champignons filamenteux ayant une reproduction sexuée avec des zygospores (1). Quant à la reproduction asexuée, elle aboutit à la formation de sporangium contenant des sporangiospores (Figure 2). Leur appareil végétatif est constitué d’hyphes non cloisonnés et ils sont considérés comme des champignons dits « inférieurs ». Au sein de la classe des zygomycètes
(2) on rencontre par exemple l’ordre des mucorales regroupant environ 260 espèces dont 38 déclarées pathogènes pour l’homme (3), à l’origine des mucormycoses (pathologies rares en France, mais d’évolution rapidement invasive et réputées difficiles à traiter). Cette classe regroupe plusieurs centaines d’autres espèces. (4)

Ascomycota

Les ascomycètes font partie des champignons dits « supérieurs » aux côtés des basidiomycètes. La reproduction sexuée produit des ascospores tandis que la multiplication asexuée aboutit à des conidies au sommet d’un conidiophore (Figure 3). Parmi les milliers d’espèces regroupées au sein de ce phylum, plusieurs sont d’intérêt majeur en pathologie humaine : que ce soit parmi les champignons filamenteux ou les levures (Aspergillus species ou Candida species).

Basidiomycota

Les basidiomycètes renferment une multitude de champignons divers et variés ; on rencontre à la fois des levures unicellulaires encapsulées pathogènes pour l’Homme comme Cryptococcus sp., des champignons filamenteux et des macromycètes sans intérêt majeur en pathologie humaine. Ils produisent des basidiospores au sommet de basides au cours de leur reproduction sexuée ; leurs hyphes sont cloisonnés comme chez les ascomycètes.

Identification fongique

L’identification précise des espèces fongiques est indispensable pour la mise en place d’un traitement antifongique adapté chez les patients. L’enjeu est le diagnostic le plus précoce possible pour améliorer le pronostic qui peut être parfois très sombre dans certaines infections fongiques invasives notamment chez les patients immunodéprimés.
L’examen direct, étape la plus rapide et précoce de la démarche diagnostique au laboratoire, s’effectue directement à partir du prélèvement soit à l’état frais, soit après coloration ou marquage (May-Grünwald-Giemsa, calcofluor etc.). Bien que de faible sensibilité, il permet parfois de mettre en évidence des levures, des spores, des filaments mycéliens ou encore des pseudofilaments, et donc signe la présence d’éléments fongiques.
L’identification fongique à partir des cultures positives repose principalement sur des critères macroscopiques (aspect, couleur, forme des colonies), microscopiques (spores, thalle, etc.) et peut s’appuyer également sur les conditions de culture (vitesse de croissance, température optimale de pousse, sensibilité à certains agents). Cette approche reste d’actualité malgré l’avènement de techniques récentes comme la technologie MALDI/TOF ou de biologie moléculaire (méthode diagnostique indirecte par PCR associée ou non au séquençage).

Conditions de culture mycologique

La mise en culture des prélèvements se fait essentiellement sur gélose Sabouraud, du fait du pH acide de 5,6 la croissance de nombreuses bactéries est limitée. Il s’agit d’un milieu d’isolement non sélectif pour les champignons filamenteux et levures. Le milieu Sabouraud peut être additionné d’antibiotiques pour constituer des milieux plus sélectifs (chloramphénicol, gentamicine) ou de cycloheximide afin d’inhiber certains champignons saprophytes et levures permettant par exemple l’isolement plus aisé des dermatophytes.
Afin d’augmenter la sensibilité, il convient d’ensemencer des volumes importants (de l’ordre de 0,5 mL si possible).
Selon le type de prélèvement (superficiels ou profonds) et les espèces fongiques attendues (levures ou filamenteux), les températures d’incubation sont à adapter (Tableau III). Le délai de culture varie généralement de quelques jours pour les levures, mais peut aller jusqu’à plusieurs semaines pour certains dermatophytes par exemple.
Les cultures sont ensuite lues soit quotidiennement soit de manière bihebdomadaire jusqu’à l’observation d’une ou plusieurs colonies de taille suffisante pour permettre une identification.

Aspect macroscopique

À partir des cultures positives, une première orientation sur le diagnostic du genre fongique est faite via l’aspect des colonies qui seront plutôt petites, glabres, et brillantes pour les levures contrairement aux champignons filamenteux souvent d’aspect plus étendu et aérien, duveteux ou cotonneux. L’observation de la couleur des colonies (recto et verso des géloses) peut être un précieux indice concernant la classe et la famille des champignons, par exemple avec les dématiés (champignons noirs) ou certains dermatophytes.

 Aspect icroscopique

L’examen microscopique au bleu de lactophénol entre lame et lamelle (grossissement x400) permet l’observation du mycélium, des spores et des organes de fructification. Il est réalisé sur la culture (à partir d’un tube ou d’une gélose Sabouraud) à l’aide d’une oese et d’un morceau de cellophane adhésive directement apposé à la surface de la culture et déposé en sandwich entre deux gouttes de colorant (Figure 4).
Quelques exemples d’aspects macroscopiques et microscopiques de plusieurs champignons pour illustrer leur grande diversité morphologique (Figure 5) : (6)
L’aspect macroscopique et microscopique, au vu de la large diversité des champignons en pathologie humaine, peut conduire le mycologue avisé à identifier au niveau du genre, voire même du complexe d’espèces, certains isolats. Cependant les caractéristiques morphologiques sont parfois limitées pour permettre une identification précise ; d’où l’intérêt grandissant de mettre en place des techniques complémentaires comme la technologie MALDI/TOF couplée à la spectrométrie de masse ou la génétique moléculaire.

Identification par MALDI/TOF

Le technologie MALDI/TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation/Time Of Flight) s’est imposée depuis la fin des années 2000 comme une technologie indispensable dans les laboratoires de microbiologie (7) ; initialement pour l’identification bactérienne de par sa rapidité d’analyse et sa simplicité d’utilisation. Aujourd’hui, il a également sa place au sein des laboratoires de Mycologie dans le cadre d’identifications des levures et champignons filamenteux. Cet automate comporte une source d’ionisation laser, un analyseur de temps de vol et un détecteur couplé à un spectromètre de masse, le tout étant analysé informatiquement.

Méthodologie et principe de fonctionnement du MALDI/TOF

Chaque échantillon à identifier est déposé en fine couche homogène sur une plaque métallique de 96 puits (après une étape d’extraction protéique pour certains champignons). Le dépôt est ensuite recouvert après séchage par une matrice permettant d’une part de le protéger et d’autre part de faciliter son analyse dans l’automate. Au sein de l’appareil, un rayon laser vient irradier et ioniser l’échantillon en transférant des charges positives aux analytes (majoritairement des protéines mais également lipides, polysaccharides, etc.). Les molécules ionisées obtenues vont ensuite accélérer et migrer vers le détecteur dans l’analyseur (colonne d’environ 1 mètre). Le temps de vol entre ces deux points est enregistré, il est inversement proportionnel à la taille des molécules de même charge (8) ; ainsi la vélocité des molécules dépend du ratio masse/charge. Ces données sont traduites sous forme d’empreintes spectrales et superposées à des spectres de référence dans une base de données (Figure 6). Les spectres varient selon l’âge des colonies prélevées ou encore le milieu de culture utilisé, mais l’identification précise ne sera rendue que si les scores d’identification sont suffisamment bons (9).

Génétique moléculaire

Généralités sur l’amplification génique

Les techniques d’amplification génique par Polymerase Chain Reaction (PCR), permettent l’identification de pathogènes ciblés (par détection de l’ADN fongique) à l’aide d’amorces spécifiques de genre ou d’espèce (Candida sp., Aspergillus fumigatus, Pneumocystis jirovecii…). Elles peuvent également être « panfongiques » grâce à des amorces plus universelles, et l’identification au rang d’espèce pourra se faire grâce à un séquençage ultérieur.

Séquençage

Depuis la fin du XXème siècle, les techniques de séquençage se développent et leurs coûts décroissent, les rendant de plus en plus accessibles au sein des laboratoires (10). Ainsi, seulement quelques décennies après la découverte de la structure de l’ADN en double hélice par James Watson et Francis Crick en 1953 (11) il est désormais possible de déterminer la succession des nucléotides le composant. Diverses méthodes de séquençages ont été élaborées ces dernières années, mais le principe de Sanger mis au point dans les années 1970 est toujours largement utilisé (12,13).

Méthodologie et principe du séquençage par méthode Sanger

Plusieurs étapes préalables sont nécessaires avant l’utilisation du séquenceur. Il faut d’abord réaliser une extraction d’ADN, puis une réaction de PCR à l’aide d’amorces appropriées ciblant le ou les fragments d’intérêt. Après purification des amplicons obtenus suite à la première PCR, une autre PCR : dite « séquence » est réalisée, qui diffère des PCR classiques par l’ajout de didéoxynucléotides (ddNTPs) bloquant l’ADN polymérase contrairement aux déoxynucléotides (dNTPs). Une fois incorporés les ddNTPs mettent fin à l’élongation du brin complémentaire car ils ne possèdent pas de groupement hydroxyle en position 3’ rendant impossible l’incorporation d’un nouveau nucléotide. Dans le mélange réactionnel, l’enzyme incorpore aléatoirement les dNTPs ou les ddNTPs en plus faible concentration, créant de multiples fragments de tailles différentes selon l’endroit où les ddNTPs se sont insérés. Chaque ddNTPs est marqué par un fluorophore selon s’il s’agit d’Adénine, de Thymine, de Cytosine ou de Guanine. Après l’étape d’amplification, les fragments vont migrer par électrophorèse pour être discriminés selon leur poids moléculaire (Figure 7).
Les séquences ADN obtenues peuvent être identifiées, grâce à des bases de données constamment enrichies, par comparaison avec des séquences de références ou bien des séquences déposées par des laboratoires de recherche. Des programmes informatiques tels que BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) permettent l’alignement de séquences homologues et le calcul d’un score d’identification par rapport à une séquence d’intérêt.

Analyse bibliographique

Bien que les critères morphologiques macroscopiques et microscopiques soient essentiels dans le cadre de l’identification fongique, ils restent cependant limités et ne permettent pas une discrimination au rang d’espèce stricto sensu. Cette approche reste communément employée dans les laboratoires de Mycologie, mais demande des compétences approfondies et une certaine expérience. Certaines caractéristiques de la reproduction sexuée ou asexuée, sur lesquelles se base l’identification, ne sont parfois pas observables en culture. De ce fait, l’identification au complexe d’espèces n’est pas toujours possible au vu des caractères morphologiques et culturaux. De plus, la diversité fongique est telle que de nombreuses espèces n’ont pas encore été étudiées. La publication de Blackwell en 2011 estimait à plus de 5 millions le nombre d’espèces de champignons sur Terre (14) dont environ 100 000 seraient décrites, soit seulement 2%.
Toutefois en pathologie humaine, une identification correcte et rapide au niveau d’espèce peut être cruciale pour la mise en route d’un traitement antifongique adapté. Par exemple pour le genre Aspergillus sp., couramment impliqué dans les infections fongiques invasives chez l’Homme, l’espèce A. fumigatus sera sensible à l’amphotéricine B tandis qu’A. terreus sera quant à lui résistant naturellement à cet antifongique (15).
Pour toutes ces raisons, il a été nécessaire de mettre au point de nouvelles méthodes d’identification et de classification fongique basées sur la séquence ADN. Depuis les années 1980 – 1990 des amorces universelles ont été recherchées pour amplifier certains fragments d’intérêt et analyser les relations phylogénétiques entre les champignons. L’enjeu était de concevoir des amorces sur des gènes présents dans la majorité voire la totalité des génomes étudiés, avec une amplification et un séquençage facilités ; les gènes ciblés devant néanmoins contenir des régions variables non codantes, pouvant subir des mutations, permettant de discriminer les différentes espèces fongiques. Les amorces « panfongiques » ciblent des régions codantes très conservées et sont constituées en général d’une vingtaine de paires de bases (pb) ; elles permettent d’amplifier des fragments d’environ 700 pb (compromis entre une amplification facilitée et une variabilité suffisante) comportant une ou plusieurs régions variables.
Les séquences d’ADN ribosomal sont rapidement apparues comme séquences de choix : en 1982 Walker et Doolittle (16) ont été les premiers à utiliser la séquence du gène ribosomal ARNr 5S pour séquencer certains basidiomycètes. Par la suite White et al. en 1990 (17) ont marqué un tournant dans l’histoire du séquençage fongique en développant des amorces universelles fongiques au niveau de la région ITS (Internal Transcribed Spacer), largement utilisées aujourd’hui.

ADN ribosomal et région ITS

Les gènes ribosomiques se répètent en de multiples copies en tandem au sein du génome fongique ce qui facilite l’amplification ; les occurrences de ce gène peuvent différer selon l’espèce fongique, mais dépassent souvent la centaine de copies. Les régions codant pour les ARN ribosomiques sont très conservées et peu variables, ainsi les amorces sont souvent conçues sur la base de leurs séquences. Par ailleurs ces précurseurs d’ARNr sont séparés par des régions variables ITS, transcrites mais non codantes, présentant une grande variabilité inter espèces. La région ITS entière représente environ 600 pb et comporte les zones ITS 1 et ITS 2 encadrant la région codant pour l’ARNr 5,8S. En 5’ de ITS 1 on trouve l’ARNr 18S (SSU small-subunit) et en 3’ de ITS 2 l’ARNr 28S (LSU large-subunit). La région 28S contient deux domaines D1 et D2 hypervariables où plusieurs amorces ont également été conçues.
D’une part les ARNr matures 18S vont s’associer à d’autres protéines pour former la petite sous unité ribosomique 40S tandis que d’autre part les ARNr matures 5,8S, 28S et 5S (provenant d’un autre locus) vont former un complexe ribonucléoprotéique avec d’autres protéines aboutissant à la grande sous unité 60S. Le tout constituant le ribosome eucaryote (Figure 8).

Code-barres fongique

En 2003, la notion de code-barres génétique a été introduite par Hebert et al. (18). En partant du principe qu’à chaque position de la séquence ADN, l’incorporation d’un des quatre nucléotides différents est possible, cela engendre par exemple pour une séquence de seulement 15 nucléotides plus d’un milliard de« codes » possibles. Ainsi, en supposant que des mutations apparaissent sur des régions variables, il est envisageable de penser que chaque espèce possède un « code » qui lui est propre constituant en quelque sorte son « code-barres » d’identification.
Le Consortium for the Barcode of Life (CBOL), créé en 2004, a permis de réunir de nombreux scientifiques internationaux pour étudier tous les organismes vivants, à l’exception des bactéries, afin de promouvoir et de standardiser l’utilisation des codes-barres à ADN dans l’identification et l’étude des relations phylogénétiques. L’objectif étant d’appliquer la technologie du séquençage à haut débit au criblage à grande échelle d’un ou plusieurs gènes définis comme référence.
La région de 650 pb de la sous-unité 1 du cytochrome c oxydase mitochondrial (CO1) constitue le code-barres pour le règne animal. Cependant, il a été exclu comme marqueur pour le règne des champignons à cause de ses difficultés à être amplifié et sa variabilité insuffisante (19).
Le groupe de travail formé s’est penché, en ce qui concerne le règne fongique, sur diverses régions ADN pour établir le meilleur candidat au code-barres à ADN fongique à savoir : SSU (small subunit), LSU (low subunit), ITS (internal transcrib spacer), RPB1 (RNA polymerase II largest subunit), RPB2 (RNA polymerase II 2nd largest subunit) et MCM7 (Minichromosome maintenance complex component 7) (20). Dans l’idéal la région code-barres doit avoir une séquence constante et unique pour chaque espèce, la variation interspécifique doit être bien supérieure à la variation intraspécifique (19). La différence entre la variabilité génétique d’isolats de la même espèce et la variabilité entre différentes espèces est nommée « barcode gap » (Figure 9) ; pour permettre une bonne différenciation et ne pas conduire à une identification erronée cet écart doit être positif (pas de chevauchement) entre deux espèces proches (21).
Les mycologues au sein de l’initiative internationale du CBOL ont finalement défini la région ITS comme la région code-barres universelle pour les champignons.
Un des objectifs de l’international Barcode of Life (iBOL) a été de créer une base de données accessible à tous pour mettre en commun les travaux de chaque nation. En 2015, déjà 500 000 espèces (du règne animal, végétal et fongique) ont pu être intégrées dans cette base de données et ce nombre ne cesse de croitre à l’aide des nouvelles techniques de séquençage. Leur objectif est d’étendre ce nombre à 2 millions d’espèces d’ici 2026 (https://ibol.org/programs/program-overview/). Concernant le règne fongique, de nombreuses séquences ITS ont été ajoutées à la bibliothèque du Barcode of Life Data System BOLD (http://v4.boldsystems.org/) ce qui porte à près de 30 000 le nombre d’espèces fongiques avec une séquence ITS connue en 2019 (~16 000 Ascomycètes, ~12 000 Basidiomycètes, ~500 zygomycètes, etc.).
Dans l’article de Schoch et al., basé sur l’étude du « barcode gap », ont été comparées les performances en matière d’identification des régions ITS, LSU, SSU et RBP1. En ce qui concerne RBP1, il présente une meilleure discrimination entre les espèces que la région ITS, cependant il présente un taux de succès par amplification PCR bien inférieur. Ces données renforcent encore une fois l’utilisation de la région ITS comme code-barres de référence avec son taux élevé d’amplification PCR à plus de 90% de succès et sa probabilité d’identification correcte (PCI) pour différentes espèces tout à fait convenable (73% pour ITS contre 76% pour RBP1) (19). Le calcul du PCI est complexe et non standardisé dans le milieu scientifique, globalement ce calcul est basé sur la mesure du « barcode gap » (22) ; il s’agit du nombre d’espèces correctement identifiées, c’est-à-dire que la distance intraspécifique maximale est inférieure à la distance interspécifique minimale, sur le nombre total d’espèces (23).

Limites de la région ITS et marqueurs secondaires

Au vu de l’incroyable diversité du règne fongique, il est utopique de penser qu’une seule région code-barres puisse permettre d’identifier chaque spécimen au rang d’espèce. De ce fait, lorsque la séquence ITS n’est pas suffisante, des codes-barres de deuxième voire de troisième ligne ont été cherchés.
Dans l’article de Stielow et al. datant de 2015, les auteurs, formés de membres issus de plusieurs équipes internationales, ont passé en revue de nombreux candidats comme code-barres ADN secondaires à la région ITS (24). Ils ont testé des amorces déjà connues et employées (Tableau IV) et les ont comparées avec de nouvelles amorces créées (ciblant des régions déjà étudiées ou non) amplifiant entre autres TEF1-alpha (translation elongation factor 1-alpha), TEF3 (translation elongation factor 3), TOPI (DNA topoisomerase I), PGK (phosphoglycerate kinase), LNS2 (Lipin/Ned1/Smp2), etc.
Ils ont évalué l’efficience de l’amplification pour les différentes amorces et ce pour différents genres et familles de champignons. Il en ressort premièrement que la région ITS, déjà considérée comme code-barres fongique universel, présente un taux de succès pour la PCR d’environ 92% (résultats très proches de ceux obtenus par Schoch et al. en 2012) suivi de près par la région LSU avec 88%. Par ailleurs, parmi les amorces nouvellement mises au point sur la région TEF1-alpha, le couple EF1-1018F/EF1-1620R montre lui aussi un taux de succès intéressant qui s’élève à 82%.
À ce stade, d’autres paires d’amorces semblent prometteuses ciblant le gène de gamma-actine (ACT) et de béta-tubuline (TUB2) avec respectivement un taux de succès de 80% et 85%, mais leur efficience n’est pas homogène entre les différents taxons et les amplicons souvent de mauvaise qualité.
En plus d’avoir une amplification et un séquençage efficace pour différents taxons, les potentiels codes-barres secondaires se doivent d’avoir un pouvoir discriminant important entre différentes espèces ce qui est évalué à l’aide du « barcode gap » évoqué précédemment. L’analyse comparative du « barcode gap » montre, entre autres, une meilleure résolution pour les régions PGK, TOP1 et TEF1-alpha que pour ITS.
Au total, avec plus de 500 paires d’amorces évaluées sur plus de 1500 espèces fongiques, il en ressort que la région TEF1-alpha, et plus particulièrement les amorces EF1-1018F/EF1-1620R, possède à l’heure actuelle le plus grand potentiel pour être définie comme code-barres secondaire.

Région TEF1-alpha

Le gène TEF1-alpha comprend environ 1 600 pb avec trois introns. Il code pour le facteur d’élongation 1-alpha, protéine ubiquitaire nécessaire à la synthèse protéique (Figure 10). Plusieurs amorces ont été mises au point sur ce gène depuis 2005 par Rehner et Buckley (25) et améliorées au cours de la décennie, aboutissant à des amorces universelles de plus haute fidélité.

Identification au rang d’espèce

La région ITS n’est pas idéale pour certains genres comprenant de nombreuses espèces notamment Cladosporium (26), Penicillium (27), Fusarium (28), Trichoderma (20) et Aspergillus (29) à cause d’un manque de variabilité inter espèces. Dans ce cas, l’identification au rang d’espèce peut nécessiter l’utilisation de couples d’amorces plus spécifiques des genres étudiés. Le tableau V résume les différents locus ciblés et les amorces correspondantes pouvant être utiles pour l’identification fongique de manière générale ainsi que les principaux candidats proposés pour l’identification des genres cités ci-dessus.

Table des matières

Table des matières
Liste des tableaux
Liste des figures
Liste des abréviations
I. Introduction
II. Généralités
1. Bilan annuel
2. Classification
2.1. Zygomycota
2.2. Ascomycota
2.3. Basidiomycota
3. Identification fongique
3.1. Conditions de culture mycologique
3.2. Aspect macroscopique
3.3. Aspect microscopique
3.4. Identification par MALDI/TOF
3.4.1 Méthodologie et principe de fonctionnement du MALDI/TOF
3.5. Génétique moléculaire
3.5.1 Généralités sur l’amplification génique
3.5.2 Séquençage
3.5.3 Méthodologie et principe du séquençage par méthode Sanger
4. Analyse bibliographique
4.1. ADN ribosomal et région ITS
4.2. Code-barres fongique
4.3. Limites de la région ITS et marqueurs secondaires
4.3.1 Région TEF1-alpha
4.4. Identification au rang d’espèce
5. Objectif de la thèse
III. Matériel et méthode
1. Souches
2. Conditions de culture et préparation des échantillons
3. Technique MALDI/TOF
4. Extraction des échantillons en vue du séquençage
4.1. Extraction par technique PowerFecal
4.2. Extraction en EZ1
5. Amplification des extraits par PCR
6. Révélation des amplicons
7. Purification et PCR séquence
7.1. Purification post PCR séquence
8. Séquençage
9. Évaluation des performances de sensibilité de la technique
IV. Résultats
1. Bilan des identifications fongiques par technique MALDI/TOF
2. Évaluation des techniques d’extraction
3. Tests de la limite de détection
4. Optimisation de l’étape de PCR séquence
5. Comparaison des identifications par MALDI/TOF et du séquençage de la région ITS
6. Identification des souches non identifiées par MALDI/TOF
6.1. Première intention : séquençage de la région ITS
6.2. Seconde intention : séquençage des régions LSU et TEF1-alpha
6.2.1 Séquençage de la région LSU
6.2.2 Séquençage de la région TEF1-alpha
7. Comparaison des identifications par séquençage de la région ITS avec les régions LSU et TEF1-alpha
8. Contexte clinique et pathogénicité
V. Discussion
VI. Conclusion
VII. Annexes
VIII. Références

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