Comparaison des deux méthodes de diagnostic du VIH

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Processus de la sélection médicale

Les candidats au don sont accueillis par un(e) assistant (e) social (e) qui vérifie d’abord les critères d’âge (entre 18 et 60 ans) et de poids (qui devait être ≥ à 50 Kg) et procède ensuite à son enregistrement. Le candidat au don est ensuite reçu par un médecin qui est formé à la technique de sélection des donneurs de sang. Cet entretien se fait à l’aide du questionnaire remis par l’assistant (e) social (e) contenant le code d’identification du donneur, l’état civil, les antécédents médicaux-chirurgicaux et le mode de vie. A la fin de la sélection médicale, un examen, clinique sommaire est fait, pour rechercher certaines affections pouvant contre-indiquer le don [16,21].

PRELEVEMENT

Le sang humain ou l’un de ses constituants ne peuvent être prélevés que par un personnel habilité à cet effet, sous la responsabilité d’un médecin. Le numéro figurant sur la fiche doit être identique à celui de la poche et des tubes d’échantillons. Chez les candidats autorisés, un poche de sang de 450 ml est prélevée, et deux tubes de 5 ml pour la réalisation des tests sérologiques. Pour les candidats exclus (présentant des critères de sélection de don non conformes aux normes du don de sang) c’est soit une exclusion temporaire ou définitive. Le volume maximum de sang total unitairement prélevé est de 8ml par kg de poids corporel sans dépasser 500 ml. Après le don, le donneur reçoit une collation sous surveillance d’un personnel de santé et avant de partir un geste chaleureux de remerciement lui est adressé. Les poches de sang ainsi que les tubes sont conservés au frais entre 2° C et 6°C avant la réalisation des bilans biologiques (dépistage des Ac anti-VIH, Ag HBs, Ac-HCV, et la réaction de Bordet Wassermann (BW) et le groupage sanguin). Les poches recueillies lors des collectes mobiles sont placées dans des conteneurs isothermes à une température de +2°C à +8°C hermétiquement fermés, et sont acheminées dans les 4 heures qui suivent le prélèvement de la première poche au CNTS [22, 23].

PREPARATION DES PRODUITS SANGUINS LABILES

On regroupe sous le terme de Produits Sanguins Labiles (PSL) l’ensemble des dérivés thérapeutiques obtenus à partir du don de sang total ou d’aphérèse, collectés, préparés et conservés dans les centres de transfusion sanguine. Chacun de ces dérivés est le résultat de la séparation de constituants du sang par des procédés physiques (Figure 1) [24].
Les Opérations de préparation des produits sanguins labiles (PSL)
La préparation des produits sanguins labiles concerne l’ensemble des étapes depuis la salle de prélèvement jusqu’à la délivrance des PSL.
– La réception : confirmation de la concordance entre la poche et les identifiants du don sur la poche.
– La pesée : sert à mesurer le poids des PSL.
– La centrifugation : étape de mise en pots des poches à centrifuger et l’équilibrage.
– La séparation : extracteur de plasma (manuel, semi-automatique ou automatique).
– La soudure : pour clamper les poches après le don et éviter la contamination.
– La connexion stérile : permet une connexion de façon stérile d’une tubulure à une autre.
– Leuco réduction (déleucocytation) consiste à soustraire aseptiquement la majeure partie des leucocytes d’un produit sanguin labile à usage thérapeutique.
– La congélation et la décongélation,
– Le mélange de produits,
– la déplasmatisation consiste à éliminer la majeure partie du plasma.
– L’irradiation : c’est l’exposition à une source de rayonnement ionisant, la dose reçue étant comprise entre 25 et 45 grays.
Etiquète : Un étiquetage clair et correct des prélèvements sanguins est indispensable pour garantir la sécurité de la transfusion prévue. Cela permet d’assurer aussi une bonne traçabilité des produits.
– Conservation des produits sanguins [24].
La délivrance : une fiche de distribution norminative (FDN) accompagne chaque délivrance de PSL [24].
Les dérivés sanguins cellulaires
Les principaux dérivés de produits sanguins labiles sont les suivants : les Concentrés des Globules Rouges (CGR), les Concentrés de Plaquettes Standards (CPS), les Concentrés de Plaquettes obtenus par Aphérèse (CPA) et les Concentrés de Granulocytes (CGA).
Les dérivés sanguins plasmatiques
Les principaux dérivés sanguins plasmatiques labiles se composent de Plaquettes Frais Congelés (PFC), le Cryoprécipité et le Plasma Dépourvu de Cryoprécipité ont été retiré de la liste officielle [24].

Diagnostic de l’infection par le VHB

Le diagnostic d’une infection par le VHB utilise à la fois les techniques sérologiques et les techniques de biologie moléculaire.

Marqueurs directs du VHB.

– L’Antigène HBs (Ag HBs) : C’est le premier antigène qui apparaît et témoigne aussi de la présence du virus dans le sang, il est très immunogène. Il disparaît après l’arrêt de la réplication virale dans le foie. Sa persistance au-delà de 6 mois signe l’évolution vers la chronicité [25, 26].
– L’Antigène HBe : l’Ag HBe est sécrété par les cellules infectées. Il est codé par le gène C et est présent sous forme soluble dans le plasma ou le sérum. Il traduit une réplication active du VHB. Sa disparition notifie un arrêt de la réplication virale.
– L’Antigène HBc : L’Ag HBc est intra-hépatocytaire, il n’est pas détecté dans le plasma/sérum. En revanche on le détecte sur une coupe de foie par immunofluorescence ou immuno-peroxydase [26].
– L’ADN du VHB.
L’ADN-VHB peut être détecté et quantifié dans le sérum ou le plasma par des techniques d’hybridation au moyen de sondes spécifiques ou par amplification génique. Les techniques d’amplification par PCR sont les plus sensibles et permettent après séquençage de révéler les variants mutants (test qualitatif). Le Cobas AmpliPrep/Cobas TaqMan de Roche a une sensibilité environ de 10 à 20 UI/ml. Ainsi, la recherche de l’ADN-VHB est utilisée dans le dépistage et la détection précoce (de l’ordre d’une semaine) de l’infection ; dans l’évaluation de l’efficacité d’un traitement antiviral [27,28].

Marqueurs indirects

 Les anticorps anti-HBs (Ac- anti-HBs) : sont détectables habituellement 2 à 8 semaines après la disparition de l’Ag HBs, souvent après la guérison clinique.
 Les anticorps anti-HBe (Ac anti-HBe) : apparaissent dès la disparition de l’antigène HBe. Leur présence indique une évolution favorable de l’hépatite ou en cas de mutants pré-core une évolution défavorable.
 Les anticorps anti-HBc (Ac anti-HBc) : dirigés contre la capside virale, est d’apparition systématique après l’infection par le VHB [27,28].
 Les transaminases: l’élévation des ALAT et ASAT permet de mettre en évidence une cytolyse hépatique [26, 27,28].
 La bilirubine: elle varie évidemment en fonction de l’ictère mais ne dépasse que rarement 200 μmoles /litre et porte essentiellement sur la fraction conjuguée [28,29].
 Le taux de prothrombine(TP) : il est abaissé dans l’hépatite sévère (TP<50%). Dans les hépatites fulminantes, le TP est inférieur à 30%.
– La VS est élevée et le taux de lymphocyte est abaissé en cas d’hépatite sévère [27,28].
Autres profils sérologiques
– Anticorps anti-HBc isolé est fréquemment retrouvé chez les donneurs de sang [27].

Cinétique des marqueurs

Les deux formes d’hépatites les plus courantes sont les hépatites aiguës et les hépatites chroniques. Dans les hépatites aiguës, les Ag HBs sont décelés vers la quatrième semaine tandis que les Ac anti-HBs apparaissent plusieurs mois après la disparition de l’Ag HBs. Les Ag HBe sont décelés à partir de la cinquième semaine du contage. L’ADN du VHB est détecté dans le plasma/sérum à la troisième semaine de la réplication virale [29,30]. (Figure 2).

CONTEXTE ET CADRE D’ETUDE

La transfusion de sang et de ses dérivés (PSL), peuvent être à l’origine de la transmission de certains agents pathogènes dont le VIH, le VHB et le VHC. Ces trois virus, constituant un réel problème de santé publique, doivent être systématiquement recherchés dans tous les produits sanguins selon les recommandations de l’OMS. Ce dépistage se fait habituellement dans les pays à ressources limitées en utilisant uniquement des tests sérologiques. Ces tests, malgré leur grande sensibilité ne se positivent qu’après une période déterminée (fenêtre sérologique). La durée de cette fenêtre sérologique est de 22 jours pour le VIH, 56 jours pour le VHB et 66 jours pour le VHC après le contage.
L’avènement des techniques moléculaires a changé les pratiques dans les pays du Nord où les techniques de virologie moléculaire sont mises à contribution dans la sécurité transfusionnelle.
Au CNTS de Dakar, ces trois virus sont systématiquement recherchés dans les produits sanguins par des tests sérologiques. Cette étude a été menée dans le but d’évaluer la faisabilité et les apports de la technique de recherche des acides nucléiques viraux dans la sécurité transfusionnelle.
Cadre d’Etude
Notre étude a été réalisée au Centre National de Transfusion Sanguine de Dakar (CNTS-Dakar) et au Laboratoire de Bactériologie Virologie (LBV) de l’Hôpital Aristide Le Dantec de Dakar.
Situé en face de l’avenue Cheikh Anta Diop, le CNTS de Dakar a été créé le 28 Avril 1951 sous le nom de Centre Fédéral de Transfusion Sanguine. Il a pour mission : la collecte, le traitement et la distribution des produits sanguins labiles sur toute l’étendue du territoire national sénégalais selon les normes internationales de sécurité transfusionnelle. Il a également pour rôle de superviser et de centraliser l’ensemble des données administratives et techniques des banques de sang placées sous sa tutelle. Il a en charge la mise en place et la gouvernance de la politique nationale de transfusion sanguine au Sénégal. Enfin, le CNTS participe à la formation du personnel et des étudiants mais aussi à la recherche scientifique.
Le Laboratoire de Bactériologie-Virologie du CHU Aristide Le Dantec, plus précisément son unité de Virologie Moléculaire est un laboratoire hospitalo-universitaire qui a pour vocation le diagnostic biologique des infections bactériennes et virales. Il participe à la formation du personnel et des étudiants mais aussi à la recherche scientifique. C’est le centre de référence des IST et du VIH au Sénégal. Il a été accrédité en 2015 par IQMH (Société Canadienne).

METHODOLOGIE

Type et période d’étude

L’étude s’est déroulée sur une période allant du mois de Juillet 2016 au mois de février 2017. Il s’agit d’une étude prospective transversale et descriptive.

Population d’étude

Nous avons inclus les donneurs de sang en cabine fixe et en équipe mobile. Les donneurs de sang répondaient parfaitement aux critères exigés : âge entre 18 et 60 ans, poids ≥ 50 kg, état général et antécédents médico-chirurgicaux, risques liés aux agents transmissibles, tolérance au don.
Critère d’inclusion
 La réalisation des tests moléculaires a porté sur l’ensemble des 10 échantillons positifs pour le VIH par les méthodes sérologiques pendant la période d’étude complété à 300 par des échantillons négatifs choisis au hasard. Nous avons retenus tous les prélèvements qui présentaient un volume de plasma suffisant au moins 2 ml pour pouvoir réaliser l’ensemble des tests moléculaires.
 Pour le VHB, la détection de l’ADN a été réalisée sur les mêmes échantillons négatifs au dépistage sérologique en faisant un « pas » de 5 et sur des échantillons positifs pour l’Ag HBs de façon à avoir un total de 300 échantillons.
Critères de non inclusion
Ont été exclus de l’étude, tous les prélèvements insuffisants pour le test sérologique et moléculaire pour les deux Virus VIH et VHB. Les donneurs de sang dont certains paramètres épidémiologiques manquaient sur la fiche de dons de sang, n’ont pas été inclus dans le calcul en ce qui concerne les résultats épidémiologiques.

Echantillonnage

Pour les tests sérologiques : nous avons inclus tous les donneurs de sang de notre étude.
Pour les tests moléculaires :
 Nous avons inclus tous les échantillons dépistés positifs au VIH avec la sérologie et avons complété avec des échantillons négatifs jusqu’à disposer d’un total de 300 échantillons.
 Nous avons également inclus 300 échantillons pour l’Ag HBs dont 10 échantillons positifs à l’Ag HBs et 290 échantillons négatifs à l’Ag HBs au dépistage sérologique. . Les 10 échantillons positifs à l’Ag HBs ont été pris au hasard sur l’ensemble des échantillons Ag HBs positifs en sérologie de la période d’étude.

Algorithme des dépistages sérologiques:

 VIH : un échantillon positif (réactif) au dépistage par la technique par chimiluminescence est repris en double sur l’Architect, puis retesté par deux autres tests (Immuno- Combs II et Bispots).
 VHB et VHC : un échantillon positif (réactif) au dépistage par la technique par chimiluminescence est repris en double sur l’Architect.

Algorithme des tests moléculaires

Nous avons fait la recherche des acides nucléiques viraux sur 300 échantillons :
 La recherche de l’ARN du VIH a été effectuée sur 10 échantillons dépistés positifs au VIH et 290 échantillons négatifs après les avoir mis en pool de 10 échantillons (soit 29 tests).
 La recherche de l’ADN du VHB a été effectuée sur 10 échantillons dépistés positifs et 58 échantillons négatifs au VHB.

Techniques d’analyses

Prélèvement

– Dans un premier temps, 5 ml de sang veineux des donneurs de sang ont été prélevés dans des tubes EDTA à partir des poches satellites. Après centrifugation, les plasmas ont été analysés par l’automate ARCHITECT i1000SR pour la recherche et l’identification des virus VIH, le VHB et le VHC.
– Dans un second temps, les plasmas issus des tubes de sang prélevés et répondant aux critères d’inclusion, ont été aliquotés dans les cryotubes. Le temps qui doit s’écouler entre le début du prélèvement du sang était de 6 heures. Chaque cryotube a porté un numéro d’ordre de prélèvement qui correspond au numéro du code barre du tube EDTA du CNTS de Dakar. La cryo-boîte contenant les cryotubes ont été placées dans une glacière avec « ices box » pour le transport vers l’Unité de Biologie moléculaire dans le laboratoire de bactériologie virologie de l’ HALD de Dakar. Les plasmas ont été conservés à – 80 °C dans l’attente des tests moléculaires. Les données sociodémographiques des donneurs ont été récupérées sur les fiches de dons de sang. Quant aux résultats, ils ont été obtenus sur les fiches des résultats..

Dépistage du VHB

Principe de la méthode :
Dans le dosage ARCHITECT HBs Ag Qualitative II, l’échantillon est mis en présence avec les microparticules paramagnétiques et le conjugué d’anticorps anti-HBs marqué à l’acridinium pour former un mélange réactionnel. L’Ag HBs présent dans l’échantillon se lie aux microparticules recouvertes d’anticorps anti-HBs et au conjugué d’anticorps anti-HBs marqué à l’acridinium.
Après deux cycles de lavage successifs, les solutions de pré activation et d’activation sont ajoutées au mélange réactionnel. La réaction chimiluminescence qui en résulte est mesurée en URL.

Dépistage du VHC

Principe de la méthode
L’échantillon est mis en présence avec les microparticules paramagnétiques recouvertes d’antigène VHC et le diluant de dosage. Les Ac anti-VHC présents dans l’échantillon se lient aux microparticules paramagnétiques recouvertes d’Ag VHC. Après lavage, le conjugué d’anticorps anti-humain marqué à l’acridinium est ajouté pour créer un mélange réactionnel. Après un autre cycle de lavage, les solutions de pré activation et d’activation sont ajoutées au mélange réactionnel. La réaction chimiluminescence qui en résulte est mesurée en URL.

Interprétation des résultats de l’Architect

Il existe une relation directe entre la quantité des marqueurs du VIH, du VHB et du VHC présents dans l’échantillon et les URL détectées par le système optique ARCHITECT. La présence ou l’absence de ces marqueurs dans l’échantillon est déterminée en comparant les URL du signal chimiluminescent de la réaction aux URL du signal de la valeur seuil déterminé à l’aide d’une courbe de calibration active. Si le URL du signal chimiluminescent de la réaction est inférieur (signal moins intense) au URL du signal de la valeur seuil, l’échantillon est considéré non réactif (négatif) pour ces différents marqueurs. Si il est supérieur alors l’échantillon est réactif donc positif.
– Les échantillons dont la valeur de l’index (S/CO) est < 1,00 sont considérés comme non réactifs (NR) donc négatifs.
– Les échantillons dont la valeur de l’index (S/CO) est > 1,00 sont considérés comme réactifs (R) donc positifs.

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Table des matières

PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. PROMOTION DU DON DE SANG
2. SELECTION DES DONNEURS DE SANG
2.1. Sélection pré don
2.2. Processus de la sélection médicale
3. PRELEVEMENT
4. PREPARATION DES PRODUITS SANGUINS LABILES
5. DEPISTAGE DES AGENTS INFECTIEUX
5.1. Diagnostic de l’infection par le VHB
5.1.1. Marqueurs directs du VHB
5.1.2. Marqueurs indirects
5.1.3. Cinétique des marqueurs
5.1.4. Techniques de recherche du VHB
5.2. Diagnostic de l’infection par le VIH
5.2.1. Marqueurs biologiques
5.2.2. Méthodes indirectes
5.2.2.1. Test ELISA
5.2.2.2. Méthode par la chimiluminescence
5.2.2.3. Tests rapides
5.2.3. Méthodes directes
6. AUTRES STRATEGIES DE PREVENTION DU RISQUE INFECTIEUX
DEUXIEME PARTIE : MATERIEL ET METHODES
7. OBJECTIFS
7.1. Objectif général
7.2. Objectifs spécifiques
8. CONTEXTE ET CADRE D’ETUDE
9. METHODOLOGIE
9.1. Type et période d’étude
9.2. Population d’étude
9.3. Echantillonnage
9.4. Variables étudiées
9.5. Algorithme des dépistages sérologiques:
9.6. Algorithme des tests moléculaires
9.7. Techniques d’analyses
9.7.1. Prélèvement
9.7.2. Tests sérologiques
9.7.2.1. Techniques par chimiluminescence
9.7.2.1.1. Dépistage du VIH
9.7.2.1.2. Dépistage du VHB
9.7.2.1.3. Dépistage du VHC
9.7.2.1.4. Interprétation des résultats de l’Architect
9.7.3. Techniques moléculaires de détection du VIH-1.
9.7.4. Technique moléculaire de détection de l’ADN du VHB.
9.8. Analyses statistiques.
10. CONSIDERATIONS ETHIQUES
11. RESULTATS
11.1. Caractéristiques de la population d’étude.
11.1.1. Répartition de la population d’étude selon l’âge
11.1.2. Répartition de la population d’étude selon le sexe
11.1.3. Répartition de la population d’étude selon le nombre de dons de sang
11.1.4. Répartition de la population d’étude selon la cabine fixe et la cabine mobile
11.2. Résultats sérologiques
11.2.1. Sérologie VHB, VHC et VIH
11.2.2. Prévalence des profils sérologiques VHB et VIH selon le site de prélèvement
11.2.3. Prévalence sérologique des VHB et VIH en fonction du nombre de dons de sang.
11.3. Dépistage Génomique Viral (DGV)
11.3.1. Comparaison des deux méthodes de diagnostic du VIH
11.3.2.
12. DISCUSSION
CONCLUSION
PERSPECTIVES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES

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