Soutenance mémoire
Méthodes de détection des métaux
Les méthodes de détection des métaux sont variées et permettent de répondre à des questions différentes. Les techniques basées sur l’analyse élémentaire (spectrométrie par torche à plasma), la spectrométrie de masse (ICP-MS, NanoSIMS), ou les rayons X (XAS), détectent directement le métal, ce qui donne accès à la concentration totale en métal. La sensibilité et la résolution spatiale de ces méthodes augmentent, mais ne permettent pas d’imager la répartition du métal au sein d’une cellule unique. Ces techniques sont utilisées pour quantifier la répartition des métaux au sein d’un organisme, ou d’un tissu.
Par ailleurs, toutes ces techniques permettent d’imager uniquement la quantité totale de métal. Les sondes fluorescentes sont complémentaires, car elles permettent uniquement d’imager le métal qu’elles sont capables de lier, c’est-à-dire le métal mobile. L’utilisation de sondes fluorescentes permet d’imager de manière dynamique la répartition du métal au niveau subcellulaire. Les informations obtenues sont donc complémentaires de celles obtenues par d’autres techniques. La fluorescence est une technique peu onéreuse et son utilisation est répandue. Il existe deux types de sondes : les sondes synthétiques (souvent de petites molécules organiques) et les sondes codées génétiquement (protéines).
Sondes fluorescentes
Les sondes organiques sont composées d’un chromophore et d’une partie permettant de lier le métal. Certaines sondes entrent dans les cellules sous cette forme, pour d’autres il est nécessaire de masquer les fonctions trop hydrophiles ou d’ajouter un peptide aidant à la pénétration cellulaire . En effet, certaines séquences peptidiques sont connues pour faire entrer des protéines de taille conséquente dans les cellules. L’adressage de ces peptides à l’intérieur de la cellule est en revanche souvent mal connu. Enfin, les sondes peuvent être microinjectée, ce qui permet de mieux contrôler la quantité de sonde à l’intérieur de la cellule.
Les sondes codées génétiquement ont l’avantage et l’inconvénient d’être directement exprimées dans les cellules. Elles ne souffrent pas de difficultés pour entrer dans la cellule mais ne sont utilisables que dans les cellules capables de les exprimer. Ces protéines correspondent à l’association de protéines fluorescentes et de protéines complexant le métal.
Critères pour une sonde idéale
Les critères pour la conception d’une sonde sont de nature biochimique et photophysique.
• D’un point de vue biochimique, la sonde doit être sélective et spécifique d’un métal.
Dans la cellule de nombreux métaux de la première période du bloc d sont présents (Fe, Cu, Zn, Mn, Ni, V). Il faut que la sonde soit capable de complexer sélectivement un métal qui n’est pas nécessairement le plus abondant ou le plus compétitif de la série d’Ivring-Williams (Mn 2+ < Fe 2+ < Co 2+ < Ni 2+ < Cu 2+ > Zn 2+).
• La cinétique et la thermodynamique de la complexation du métal par la sonde doiventêtre ajustées. La complexation du métal doit être réversible et rapide pour mesurer la distribution de manière dynamique. L’affinité de la sonde doit être telle que la constante de dissociation soit dans la gamme de concentration en métal mobile. Si l’affinité est trop faible, la sonde ne complexera pas le métal. Si l’affinité est trop importante, toute la sonde sera sous forme complexée, ce qui peut faire varier la quantité de métal disponible et perturber le fonctionnement de la cellule.
Cependant la « bonne » affinité dépend de la concentration en sonde à l’intérieur de la cellule. En effet, si la concentration en sonde est plus importante que la concentration en métal à imager, la sonde peut séquestrer tout le métal labile. Cet effet peut être contrebalancé par la décomplexation du métal stocké par la cellule. Mais si la concentration en sonde est plus importante que le stock, alors la sonde entre en compétition avec les protéines utilisant le métal comme cofacteur, ce qui perturbe le fonctionnement cellulaire.
• Enfin la sonde doit être capable d’entrer dans les cellules et de ne pas perturber leur fonctionnement. Les sondes doivent être stables, c’est-à-dire ne doivent pas réagir avec le milieu cellulaire, et être non toxiques.
• La concentration locale de la sonde doit être connue ou mesurable pour ne pas confondre une forte concentration en métal avec une concentration localement élevée en sonde libre. Une des possibilités pour éviter de déterminer la concentration locale en sonde, est de concevoir une sonde ratiométrique, c’est-à-dire d’ajouter à la sonde qui s’allume en présence de métal, un signal référence dont l’intensité ne varie pas (fig.1.10). Plus généralement, il faut que les deux signaux varient de manières indépendantes lors de la complexation du métal. Ces deux signaux peuvent être l’émission à deux longueurs d’onde différentes pour une même longueur d’onde d’excitation, ou bien l’émission à une longueur d’onde donnée pour deux longueurs d’onde d’excitation (fig.1.9).
Projet de sonde
Dans la conception des sondes, nous nous sommes inspirés de métalloprotéines pour leur sélectivité et leur spécificité vis-à-vis d’un métal particulier. Nous avons utilisé des peptides d’une vingtaine d’acide aminés qui modélisent le site de liaison du métal de la protéine.
La structure peptidique peut permettre d’éviter les problèmes d’agrégation rencontrés par les sondes organiques, et d’assurer une certaine biocompatibilité. Certains peptides sont capables d’entrer passivement dans les cellules, d’autres entrent grâce à des séquences de pénétration cellulaire . Grâce à la flexibilité de la synthèse peptidique, il est possible de greffer ces séquences à nos peptides.
L’utilisation de peptides permet également d’ajuster finement l’affinité pour le métal en mutant les acides aminés directement liés au métal, ou en modifiant la seconde sphère de coordination, ou encore en influant sur le repliement du peptide . Par exemple, pour le peptide consensus , modèle de doigt de zinc ???, la formation du cœur hydrophobe lors de la complexation du zinc augmente l’affinité pour le zinc.
Pour l’émission de la sonde, nous utilisons des complexes de lanthanides (cf § 1.3). Selon le lanthanide utilisé, l’émission se fait dans le visible (excitation dans l’ultraviolet) ou le proche infrarouge (excitation dans le visible). Les lanthanides proche infrarouge sont plus adaptés à l’imagerie, mais ils nécessitent des détecteurs appropriés dont nous ne disposons pas au laboratoire. Étant donné que les lanthanides ont des propriétés chimiques semblables, il est aisé de mettre au point les sondes avec des lanthanides émettant dans le visible, et seulement dans un deuxième temps de changer le lanthanide pour émettre dans le proche infrarouge.
Propriétés magnétiques
Le néodyme entre dans la composition d’aimants permanents puissants en alliage avec du fer et du bore. Ces aimants sont utilisés dans les générateurs des éoliennes, les moteurs électriques des voitures hybrides, ou encore dans les moteurs des disques durs.
Le gadolinium avec ses 7 électrons non appariés, possède la propriété de réduire fortement le temps de relaxation du milieu environnant. C’est pourquoi il est utilisé comme agent de contraste. Bien que la toxicité des lanthanides soit encore peu décrite , dans le cas du gadolinium, la toxicité aiguë des agents de contrastes chez les personnes souffrant d’insuffisance rénale à été montrée . Pour limiter la toxicité du gadolinium, les agents de contraste utilisés en IRM sont des complexes de gadolinium. Les chélates utilisés sont des polyaminocarboxylates cycliques (DOTA-Gd), ou linéraires (DTPA-Gd) (fig.1.21). Pour que ces agents de contraste ne soient pas toxiques, il faut notamment que les complexes soient stables thermodynamiquement et cinétiquement. Pour nos sondes, nous utiliserons donc des dérivés de ces chélates, qui présentent en plus l’avantage d’être commerciaux.
Propriétés de luminescence
L’émission des lanthanides est dû à trois types de transitions électroniques : les transitions f-f, les transitions 4f-5d, et s’ils sont complexés les transitions dues à des transferts de charge métal-ligand (MLCT) ou ligand-métal (LMCT) [72] . Les transitions 4f-5d et celles dues à des transferts de charge MLCT et LMCT sont hautes en énergie [66] et conduisent à des transitions
dans l’UV lointain. Nous nous intéresserons donc uniquement aux transitions f-f.
Les transitions f-f sont des transitions entre états de même symétrie, elles sont donc interdites par un mécanisme de type dipolaire (règles de sélection de Laporte) [73] . C’est pourquoi les coefficients d’absorption molaires des lanthanides sont faibles (1-10 L.mol −1 .cm −1 ). L’intensité des transitions est décrite par la théorie de Judd-Ofelt [74,75] . Ces règles établies pour un ion isolé sont partiellement relaxées lorsque l’environnement du lanthanide est non centrosymétrique. Cependant l’excitation directe des lanthanides reste peu efficace.
Les lanthanides sont en général excités par un transfert d’énergie provenant d’un chromophore organique, appelé antenne. On parle alors d’effet d’antenne . Pour que le transfert soit efficace, il faut que l’antenne soit adaptée en énergie au lanthanide. Dans le cas de du terbium, les meilleurs rendements quantiques sont obtenus lorsque l’état excité de l’antenne transférant au lanthanide est située entre 2000 et 5000 cm −1 au-dessus de l’état accepteur 5 ? 4 . En dessous de 2000 cm−1 , la probabilité de transfert retour est importante et le rendement du transfert diminue [78] . L’europium présente plusieurs états excités proches en énergie pouvant intervenir dans le transfert d’énergie [77] . La corrélation entre le rendement quantique et la position de l’état transférant au lanthanide est plus délicate que pour le terbium. Empiriquement, de bon rendements quantiques sont observés lorsque l’état excité de l’antenne transférant au lanthanide se situe au niveau de l’état 5 ? 2 de l’europium [78] . Par exemple, le tryptophane est une antenne adaptée au terbium (fig.1.22) car son état triplet [79] , à 24 600 cm−1[79] , se situe 4000 cm −1 au dessus de l’état5 ? 4 du terbium (20 500 cm −1 ) [80] . L’état de l’antenne qui transfère au lanthanide est souventl’état triplet, mais des transferts via l’état singulet ou un état de transfert de charge sont possibles.
Conception des sondes
Les sondes utilisées au laboratoire sont basées sur des peptides modèles de métalloprotéines, sur lesquels des complexes de lanthanides ont été greffés. La position du lanthanide par rapport à l’antenne est déterminée en fonction du principe qui permet à la sonde de s’allumer en présence du métal. Les sondes à zinc et à cuivre fonctionnent sur des principes différents.
Sondes à zinc
Pour pouvoir faire une sonde basée sur une modulation du transfert d’énergie (FRET), il faut s’inspirer d’une protéine pour laquelle le changement structural est important lors de la complexation du zinc.
Le nombre de protéines à zinc est estimé par génomique à 3000 chez l’Homme [19,20,92] . 80% de ces protéines contiendraient des domaines doigts de zinc. Les doigts de zinc sont de petits domaines dans lesquels le zinc joue un rôle structural et contribue à la stabilité du domaine. Ils sont notamment impliqués dans des processus d’interaction avec l’ADN, ARN ou avec d’autres protéines . Il existe plusieurs classifications de ces doigts de zinc basées sur leur structure. Pour concevoir la sonde à zinc, nous nous sommes basés sur le doigt zinc classique ??? (fig.1.30), car ce domaine est connu pour se structurer uniquement en présence de zinc. De plus, les peptides modèles de ce doigt de zinc sont linéaires, ce qui facilite la synthèse.
Principe de la sonde et conception du peptide modèle
Dans CusF, le tryptophane est un ligand du cuivre(I). Le tryptophane est également connu pour être capable de sensibiliser le terbium. On peut donc imaginer un peptide modèle de CusF, pour lequel le tryptophane serait à la fois ligand du cuivre et antenne du terbium.
La complexation du cuivre par le peptide modèle modifie les propriétés du tryptophane, et notamment augmenterait le croisement intersystèmes vers l’état triplet du tryptophane. Or le tryptophane sensibilise le terbium par un transfert d’énergie depuis l’état triplet. Il est donc probable que le transfert d’énergie du tryptophane vers le terbium soit modifié en présencede cuivre(I) (fig.1.41).
L’examen de la structure cristallographique de CusF montre que les quatre acides aminés liant le cuivre sont tous situés dans la même boucle. Le peptide modèle utilisé comporte 16 acides aminés de cette boucle. Pour préorganiser le site de liaison au métal, deux acides aminés non naturels ont été ajoutés pour former un peptide cyclique. Ces deux acides aminés, un Aib (méthylalanine) et une D Proline (fig.1.42), sont connus pour induire les feuillets ? vrillés comme ceux de la boucle de CusF. Enfin le terbium est complexé par un DOTA introduit sur une chaîne latérale d’une lysine proche du tryptophane dans la séquence peptidique (fig.1.43) pour que le transfert d’énergie soit efficace. Ce peptide est noté CC9[Tb].
Synthèse
La synthèse du peptide CC9[Tb] (fig.2.2) est composée d’étapes de synthèse peptidique en phase solide (SPPS) et d’étapes en solution (cyclisation, greffage du DOTA-( u� Bu) 3 , décrochage des groupements protecteurs). La synthèse peptidique est effectuée du côté C-terminal vers le côté N-terminal. La cyclisation du peptide peut conduire à la racémisation de l’acide aminé en C-ter par formation d’une oxazolone . La synthèse est donc amorcée au niveau de la glycine, qui n’est pas chirale, pour éviter tout problème de racémisation lors de la cyclisation.
Complexation du cuivre(I) et interaction cation-?
Complexation du cuivre(I)
Les peptides sont chiraux, car tous les acides aminés naturels qui les constituent sont chiraux, de configuration L selon la projection de Fisher. Les structures secondaires (hélices, feuillets) sont également chirales, et présentent une signature en dichroïsme circulaire . Une modification de la structure du peptide est donc visible par cette technique. Les transitions ayant lieu dans un environnement chiral peuvent également participer au spectre de dichroïsme circulaire.
Le spectre de dichroïsme circulaire du peptide libre est négatif à 200 nm, et ne présente pas de maximum ou minimum local. Ce type de spectre est caractéristique d’un peptide sans structure secondaire particulière. L’ajout de cuivre(I) modifie le spectre du peptide : le signal à 200 nm devient moins négatif et un minimum local apparaît à 225 nm. Ces variations sont caractéristiques de la formation de structures secondaires. Le peptide se structure en présence de cuivre(I). Le signal de dichroïsme circulaire est modifié de manière linéaire jusqu’à l’ajout d’un équivalent de cuivre(I) par rapport au peptide, puis reste constant. Le complexe cuivre : peptide formé est de stœchiométrie.
|
Table des matières
1 Introduction
1.1 Le zinc et le cuivre
1.1.1 Propriétés de ces métaux
1.1.2 Homéostasie
1.1.2.1 Homéostasie du zinc
1.1.2.2 Homéostasie du cuivre
1.1.2.3 Homéostasie et sphère de coordination
1.2 Méthodes de détection des métaux
1.2.1 Sondes fluorescentes
1.2.1.1 Critères pour une sonde idéale
1.2.1.2 État de l’art
1.2.2 Projet de sonde
1.3 Lanthanides
1.3.1 Propriétés atomiques et chimiques
1.3.2 Propriétés magnétiques
1.3.3 Propriétés de luminescence
1.3.4 Sondes optiques utilisant des lanthanides
1.4 Conception des sondes
1.4.1 Sondes à zinc
1.4.1.1 Peptides doigts de zinc
1.4.1.2 Principe de la sonde
1.4.2 Sonde à cuivre
1.4.2.1 CusF
1.4.2.2 Principe de la sonde et conception du peptide modèle
1.4.3 Stratégie
2 Sondes visibles à Cu + et Ag +
2.1 Le cuivre(I)
2.2 Synthèse
2.3 Complexation du cuivre(I) et interaction cation-?
2.3.1 Complexation du cuivre(I)
2.3.2 Interaction cation-?
2.3.3 Propriétés d’émission
2.4 Sélectivité
2.4.1 Sélectivité vis-à-vis des métaux physiologiques
2.4.2 Cas particulier de l’argent(I)
2.5 Détermination de l’affinité
2.5.1 Compétition avec l’imidazole
2.5.2 Compétition avec l’acétonitrile
2.5.3 Comparaison de l’affinité du peptide CC9 et de CusF pour le cuivre(I)
2.6 Mécanisme spectroscopique
2.6.1 Nombre de molécules d’eau
2.6.2 Spectroscopie en temps résolu
2.7 Discussion
3 Modifications de la sonde à Cu+
3.1 Modifications de la séquence
3.1.1 Conception de la sonde CC9[Tb]
3.1.2 Modification du coude, position des prolines
3.2 Modification de l’affinité
3.2.1 Mutation en vue d’augmenter l’affinité pour le cuivre(I)
3.2.2 Mutation en vue d’augmenter l’affinité pour l’argent(I)
3.2.3 Discussion sur la modification de la séquence du peptide
3.3 Modification de l’antenne
3.3.1 Synthèse
3.3.2 Sensibilisation des lanthanides proche infrarouge
3.3.3 Formation de l’interaction cation-?
3.3.4 Discussion sur la modification des antennes
3.4 Cas de l’antenne naphtalène
3.4.1 Complexation du cuivre(I)
3.4.2 Interaction cation-?
3.4.3 Émission de l’europium
3.4.3.1 Constantes d’affinité
3.4.4 Mécanisme spectroscopique
3.4.4.1 Échelle de la nanoseconde
3.4.4.2 Échelle de la microseconde
3.4.4.3 Échelle de la milliseconde
3.4.5 Discussion sur le peptide CC10(Nap)[Eu]
3.5 Conclusion et perspectives
4 Sondes à zinc émettant dans le visible
4.1 Validation du principe
4.1.1 Synthèse du peptide
4.1.2 Coordination du zinc
4.1.3 Émission de la sonde
4.1.4 Sélectivité
4.2 Sondes ratiométriques
4.2.1 Conception des peptides ratiométriques
4.2.2 Synthèse
4.2.2.1 Synthèse peptidique
4.2.2.2 Métallation du peptide par deux lanthanides
4.2.3 Émission des peptides
4.2.3.1 Peptide SP2[Eu T -Tb O ]
4.2.3.2 Comparaison de la fluorescence des quatre peptides
4.2.3.3 Comparaison de la luminescence des lanthanides
4.2.4 Sélectivité
4.3 Discussion
4.4 Conclusion
5 Sonde à zinc émettant dans le proche infrarouge
5.1 Synthèse
5.2 Caractérisations
5.2.1 Étude du TTHA dans le visible
5.2.2 Complexation du zinc
5.2.3 Propriétés spectroscopiques
5.3 Tests cellulaires
5.4 Discussion
6 Conclusion et perspectives
6.1 Conclusion
6.2 Perspectives
Bibliographie
7 Partie expérimentale
7.1 Materials and methods
7.2 Synthesis
7.2.1 Copper(I) probes
7.2.1.1 CC9 synthesis
7.2.1.2 Other copper(I) probe
7.2.2 Zinc(II) probes
7.2.2.1 SP2[? O -? T ] peptidic synthesis
7.2.2.2 Selective metallation
7.2.2.3 Other zinc(II) probes
7.2.2.4 SP2(NBD)[Nd DOTA ] and SP2(NBD)[Nd TTHA ] synthesis
7.3 Spectroscopy
7.3.1 Sample preparation
7.3.1.1 Copper(I)/silver(I) probes
7.3.1.2 Zinc(II) probes
7.3.1.3 Selectivity
7.3.2 Spectroscopies
7.4 Références
Annexes
1 Détermination de la constante ?
ternaire
