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Collaboration entre la méthylation de l’ADN et les modifications des histones
Désacétylation des histones, méthylation de H3K9 et de l’ADN
Il existe une « conversation » épigénétique entre les histones et l’ADN qui concerne la méthylation des cytosines, la désacétylation des histones et la méthylation de H3K9 dont l’objectif porte sur la répression transcriptionnelle. Toutefois, la chronologie des processus est encore assez floue89. De prime abord, il est affirmé que le schéma des modifications post-traductionnelles des histones est dépendant de la méthylation de l’ADN. Il s’avèrerait alors que la méthylation de l’ADN puisse être le facteur clef du maintien de la répression de la transcription des gènes hyperméthylés qui est constatée au niveau des tumeurs malignes72,90. Une autre théorie explique qu’une modification des histones en particulier la methylation des histones H3 serait une condition requise à la méthylation de l’ADN. D’ailleurs, la présence de méthylation au niveau de la lysine 9 de l’histone H3 se veut être une alerte à la méthylation de l’ADN chez les champignons, les plantes ainsi que les mammifères. Incontestablement, la méthylation de l’histone H3 au niveau de la lysine 9 est requise dans la méthylation subséquente de l’ADN51 91,92 complémentairement à un mécanisme de couplage de la protéine HP1 qui va venir se fixer au niveau du H3K9 méthylée pour se lier à une DNMT et entrainer le processus de la méthylation des cytosines. Ainsi, la méthylation de l’ADN interviendrait de manière complémentaire dans l’extinction génique en méthylant au niveau des sites CpG les gènes qui sont uniquement réprimés par des mécanismes autres72. Cela se rencontre par exemple dans les cas de leucémie aigüe promyélocytaire dont la répression des gènes cibles de RARα est effectuée par la protéine de fusion PML-RAR par fixation des HDACs suivi d’une mobilisation d’enzymes DNMT et H3K9 méthyltransférases, entraînant ainsi l’inhibition permanente des gènes93.
Ce fut également le cas dans l’inhibition de gènes qui code les ARN ribosomaux. La méthylation de l’ADN serait fonction de la désacétylation antérieure des histones94. Malgré le fait que la méthylation de l’ADN semble être précéder par celle de la lysine 9 de l’histone H3, il existerait un rétrocontrôle positif effectué par la méthylation de l’ADN elle-même sur la méthylation de H3K9, ce qui confirme l’extinction épigénétique ainsi que l’auto-reproduction de ce cycle et par conséquent une répression permanente51. Incontestablement, la liaison des protéines MBD, comme MeCP2 (methyl- CpG-binding protein 2), sur l’ADN serait favorisée par la méthylation de l’ADN par les DNMTs. Les protéines MBD vont ensuite mobilisées des H3K9 méthyltransférases pour permettre la méthylation de la lysine 9 de l’histone H351,72. En conclusion, il existe donc un modèle de régulation et de contrôle qui fait interagir la méthylation de l’ADN au sein d’un processus de répression épigénétique impliquant :
– la méthylation de la lysine 9 de l’histone H3 par une H3K9 méthyltransférase
– la création d’un lieu de liaison pour une protéine adaptatrice (probablement HP1)
– la mobilisation d’une ADN méthyltransférase qui va catalyser la méthylation des CpG, pour permettre la fixation des protéines MBD à l’ADN.
Ces protéines MBD mobiliseraient des complexes possédant des HDACs afin de pouvoir désacétyler la lysine 9 des histones H3 dans le but de les préparer subséquemment à une méthylation. De surcroît, ce schéma suggérerait une association des protéines MBD à des H3K9 méthyltransférases51,72.
Lien entre méthylation de H3K27 et méthylation de l’ADN
Outre la méthylation de H3K9, il existe d’autres mécanismes de modifications d’histones qui peuvent concourir avec l’ADN méthylé. Comme la catalyse de la méthylation de l’histone H3 sur la lysine 27 via les complexes répresseurs PRC2 et PRC3 (Polycombrepressivecomplex) qui assurent des activités histones méthyltransférases, en particulier la sous-unité catalytique représentée par la protéine E(Z) (enhancer of zeste) à domaine SET (ou son homologue humain EZH2). Une protéine Polycomb à chromodomaine qui fait partie du complexe répresseur PRC1(Polycombrepressivecomplex 1) est donc capable de reconnaître H3K27 méthylée. D’ailleurs, sa liaison engendre une répression de la transcription suivant des mécanismes encore indeterminés51,95.
Epigénétique et Cancer
Fréquemment mentionnées dans les cancers, les perturbations épigénétiques interviendraient dans la dérégulation de l’expression de gènes ainsi que dans l’instabilité génomique. Cependant, il est nécessaire de déterminer si réellement ces perturbations épigénétiques sont la cause ou encore la conséquence de ces processus de dérégulation qui sont des phénomènes clés dans les cancers. Dans cette partie de l’introduction seront exposés des concepts quant à l’origine des cancers avant de poursuivre sur les perturbations épigénétiques majeures dont les hémopathies malignes et de continuer sur les perspectives d’innovation thérapeutique.
De l’origine épigénétique des cancers : « epigenetic progenitor of cancer » ?
Les altérations épigénétiques, en particulier celles impactant sur les modifications post-traductionnelles des histones sont majoritairement constatées dans les cellules cancéreuses et semblent impacter dans le pronostic du patient. Or, récemment, une étude a mis en exergue que les altérations des modifications des histones pouvaient être utilisées comme facteur de prédiction à la survie d’un patient atteint de cancer de la prostate96. En effet, une analyse immunohistochimique a permis de démontrer la capacité de deux modifications post-traductionnelles des histones à savoir : H3K4me2 et H3K18ac, à prédire ce pronostic. Le taux d’acétylation de H3K9 semble également être un facteur prédictif à la survie des patients atteints d’un adénocarcinome du poumon de stade I 97.
Une autre étude a par ailleurs démontré une corrélation entre la perte de la méthylation de l’ADN ainsi que l’hypoacétylation de H3K9 et une exacerbation de la progression tumorale dans les cas de cancers de la prostate 98 . Indiquant un rôle essentiel des dérégulations épigénétiques des histones dans l’apparition et l’évolution du cancer, rôle en tant qu’outil de diagnostic et de pronostic. Le cancer se conçoit comme une perturbation des propriétés biologiques subséquentes à des changements épigénétiques qui vont faire intervenir des gènes tant suppresseurs de tumeurs qu’oncogènes. Toutefois, l’origine de l’apparition du cancer et du développement du cancer serait l’altération épigénétique polyclonale de cellules souches / progénitrices. Effectivement, c’est sur ce modèle que s’appuie et propose Feinberg et al. : le modèle d’« epigenetic progenitor of cancer »99 (Figure 16). Il est intéressant de noter que l’apparition précoce des changements épigénétiques dans la tumorigenèse amène à s’interroger sur le probable rôle en amont de ces cellules progénitrices. Ce qui fait de la cellule souche une cible potentielle à l’apparition de processus inducteurs de cancer 100 ,82. Les propriétés hétérogènes qui sont intimement liées à la prolifération tumorale, aux métastases et même la résistance à la thérapie, pourraient alors s’expliquer par ces différents changements épigénétiques précoces. Feinberg et al ont ainsi proposé une modélisation de l’apparition de cancers selon trois étapes:
– en premier lieur surviendrait une perturbation épigénétique des cellules progénitrices
– en second lieu une mutation initiatrice
– en dernier lieu une plasticité génétique et épigénétique82
TPG, TumourProgenitorGenes ; GKM, GateKeeper Mutation ; TSG, Tumour-Suppressor Gene ; ONC, oncogene82.
D’ailleurs, l’existence de « cellules souches cancéreuses » (CSC) a été supposée dès 1994, cellules identifiées par leur faible fraction dans les tumeurs et qui peuvent induire la formation de nouvelles colonies in vitro ou d’initier la formation d’une nouvelle tumeur lorsqu’elles sont injectées dans un hôte in vivo101,102,103,104,105,106,107. Pareillement aux cellules souches normales, les cellules souches cancéreuses seraient également douées de la propriété d’auto-renouvellement conjointement à leur forte capacité proliférante et leur capacité à se différencier. Il apparaît qu’une régulation génétique, distincte des cellules souches normales, contrôle ces cellules souches cancéreuses108 . Afin de mieux axer la thérapie, il est alors essentiel de tenir compte du phénomène de silencing épigénétique qui interviendrait dans le mécanisme de régulation entre les cellules souches normales et cancéreuses109.
Perturbations épigénétiques dans les cancers
L’hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeurs est la principale caractéristique des cellules cancéreuses. En effet, cette hyperméthylation va agir en inhibant l’expression des gènes de même que par une hypométhylation générale du génome suivi d’un déséquilibre génomique évident110,111,112,113.
Inhibiteurs de la méthylation
Les inhibiteurs de la méthylation de l’ADN
Principalement, il s’agit de la 5-azacytidine, la 5-aza-2’-désoxycytidine et de leurs analogues. Elles agissent en inhibant les DNMT par phénomène de piégeage lorsque celles-ci viennent s’intégrer dans l’ADN à la place des résidus cytosine. Il y a ainsi réexpression de gènes suppresseurs de tumeur qui a été inhibée par l’hyperméthylation mais pas toujours ! En outre, des dérivés de ces composés permettraient de réduire leur cytotoxicité tout en augmentant leur stabilité. Des résultats significatifs ont par ailleurs été observés dans le traitement de différents types de leucémie121 (Figure 18).
Classification et usage clinique
Les inhibiteurs de DNMT peuvent être classés en deux groupes : les inhibiteurs nucléosidiques et les inhibiteurs non-nucléosidiques122.
Les inhibiteurs nucléosidiques : regroupe les molécules comme la 5-azacytidine (5-aza-CR), la 5-aza-2′-déoxycytidine (5-aza-CdR ou décitabine) ainsi que la zébularine. Ils agissent en mimant par analogie les nucléosides ce qui leur confère la capacité à s’insérer au niveau de la molécule d’ADN et de prendre la place de la cytosine qui ne pourra pas être méthylée. Ainsi, il y aura donc inhibition de toute méthylation de l’ADN néosynthétisé après division cellulaire123,124 (Figure 19).
Les inhibiteurs nucléosidiques fréquemment utilisés étant la 5-aza-CR et la 5-aza-CdR. Il est à noter que la 5-aza-CR provoque l’apoptose au niveau des cellules cancéreuses125. De plus, son efficacité a été démontrée, seule ou en association avec le valproate, dans le traitement de la leucémie myéloïde aigüe126,127 ,128. Toutefois, il est essentiel de tenir compte de leur faible stabilité associée à leur forte toxicité. La zébularine plus stable 129 , 130 et avec une faible toxicité131, en association avec le SAHA, un inhibiteur des HDACs, le Vorinostat, induirait l’apoptose conjointement à l’arrêt du cycle cellulaire chez les lignées cellulaires rencontrées dans le cancer du pancréas132.
Les inhibiteurs non-nucléosidiques : regroupe la procaïne, l'(-)-epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG) et le RG108 qui vont agir par inhibition des DNMT soit par blocage du site actif de l’enzyme (EGCG et RG108) soit par fixation au niveau des régions CpG de l’ADN afin d’inhiber la liaison des DNMT à l’ADN (procaïne). L’EGCG qui est un polyphénol du thé vert agit par inhibition de l’activité méthyltransférase de cellules cancéreuses humaines 133 . Le RG108 agit par blocage de l’activité méthyltransférase in vitro, et permet ainsi la déméthylation de l’ADN du génome, permettant ainsi la réactivation de certains gènes suppresseurs de tumeurs134 qui ont été réprimés. La procaïne, en tant qu’inhibiteur de DNA méthyltransférase, a donné des résultats efficaces en particulier chez les cellules cancéreuses des lignées du cancer du sein104.
Les inhibiteurs des HDACs (HDACi)
Classification des inhibiteurs des HDACs
Le recours à des molécules qui vont agir par inhibition des HDACs s’avère être une approche thérapeutique pertinente135. Principalement, les inhibiteurs des HDACs de classes I, II, III et VI qui ont fait l’objet de nombreux essais cliniques ces dernières années. Les inhibiteurs des HDACs sont répartis en quatre principales classes chimiques136,137,138:
– Les acides gras à courte chaîne : butyrate de sodium, phénylbutyrate de sodium, valproate de sodium et AN-9.
– Les dérivés de l’acide hydroxamique : trichostatine A, SAHA (suberoylanilide hydroxamicacid), CBHA (m-carboxycinnamicacidbishydroxamicacid) et ses dérivés (LAQ-824 et PXD-101), panobinostat, et oxamflatine.
– Les benzamides : MS-275 et CI-994.
– Les peptides cycliques : depsipeptide (FR901228 ou FK-228), apicidine A, trapoxine A et CHAP (cyclichydroxamicacid-containing peptide).
Inhibiteurs des HDACs en développement clinique
A courte chaîne, les inhibiteurs d’HDACs de la classe des acides gras sont faibles et n’agissent qu’à des concentrations de l’ordre du μM. Testés en essais cliniques, leur courte demi-vie complémentairement à la nécessité de doses élevées pour avoir un effet thérapeutique n’en font pas d’intéressantes molécules thérapeutiques119,121. A titre d’informations, l’AN-9 a été utilisé en essai de phase II ; phénylbutyrate de sodium en essai de phase I ; et l’acide valproïque en essai de phase I/II. Contrairement à cette classe des acides gras, les dérivés de l’acide hydroxamique possèdent une demi-vie plus longue avec des concentrations efficaces relevant du nM. Toxique malgré son origine naturelle, la trichostatine A (TSA) n’a pas été développée en clinique121. A contrario, certains dérivés synthétiques du groupe hydroxymate sont retrouvés en phases II et III d’essais cliniques, comme le cas du SAHA ou Vorinostat qui a obtenu une AMM dans l’indication des lymphomes T cutanés réfrataire avec sa forme d’administration orale ayant permis d’obtenir des résultats concluants par rapport à la forme intraveineuse. Le SAHA semble avoir une efficacité large compte tenu de son efficacité dans les différentes tumeurs hématologiques, il est également mieux toléré119,76. Le MS-275 est la molécule la plus active du groupe des dérivés benzamides. D’ailleurs, des résultats concluants sont retrouvés in vitro malgré la forte toxicité observée lors de schéma d’administration journalière assez inadéquate compte tenu de sa demie-vie longue (80 heures)76,119. Le depsipeptide évalué en phase II en association avec des autres molécules anticancéreuses ou utilisé seul, offre une perspective d’efficacité sur les types de tumeurs solides et hématologiques119. Les HDACs s’avèrent ainsi être des cibles thérapeutiques non dénouées d’intérêt bien que requérant un approfondissement et développement additionnel.
Inhibiteurs des HDAC dans les lymphopathies
Le Zolinza® (Vorinostat) à la dose de 400mg/j a permis d’avoir des résultats généraux dans le traitement du lymphome T cutané 140 . Le Zolinza® est indiqué pour le traitement des manifestations cutanées du lymphome cutané à cellules T (LCCT) à un stade avancé chez les patients qui présentent une maladie évolutive, persistante ou récurrente après l’essai de traitements systémiques antérieurs. Ainsi, sur une durée de traitement de 30 semaines de patients ayant déjà suivis au moins deux types de traitements, le Zolinza® a permis l’obtention d’un taux de réponse de 24% contre 36% dans le syndrome de Sézary. Pour le même cas de patients, le depsipeptide (FK-228) et le panobinostat (LBH-589) ont permis d’avoir un même taux de réponse similaire à celui obtenu par le vorinostat lors d’essais en phase II141. Des études en combinaison HDACi (vorinostat) et DNMT inhibiteur (Azacitidine ou décitabine) dans les lymphomes non hodgkiniens en rechute ou réfractaire ont montré en phase 1b une efficacité prometteuse sans augmenttation de la toxicité obtenue en monothérapie142. D’autres études (Phase II) en combinaison comme le panobinostat avec le rituximab dans les lymphomes diffus à grandes cellules B ont montré une efficacité imporatnte de la part du panobinostat qui induit des réponses très durables chez certains patients ayant rechuté avec un lymphome diffus à grande cellule B143.
Thérapie épigénétique “nouvelle génération” : mécanismes d’action des inhibiteurs des protéines BET
Les facteurs de régulation épigénétique ont émergé récemment comme de nouvelles cibles des traitements anticancéreux . Parmi ceux-ci, les protéines BET (protéines à Bromodomain and ExtraTerminal domain) , qui reconnaissent les histones acétylées pour réguler l’activité génique, soulèvent un vif intérêt. Les protéines BET sont au nombre de 4 : BRD2, BRD3, BRD4 et BRDT. Ces protéines ont en commun la présence d’un double bromodomaine N-terminal (B) et d’un domaine C-terminal dit “extraterminal”. Les protéines BET sont impliquées dans la régulation génique via des interactions avec la chromatine acétylée, soit au niveau des promoteurs de gènes, soit au niveau d’éléments enhancers responsables de la régulation transcriptionnelle tissu spécifique à distance. Les protéines BET ont une expression et/ou une activité dérégulée dans les cancers dans lesquels elles sont des acteurs majeurs dans le maintien du phénotype transformé et la résistance thérapeutique. L’introduction récente de petites molécules inhibitrices des protéines BET offre la possibilité d’abroger leurs fonctions oncogéniques. Cet article présente les principaux mécanismes responsables de l’activité antitumorale de cette nouvelle classe de thérapie épigénétique. Les mécanismes de résistance aux inhibiteurs BET, qui commencent à être décrits, seront également évoqués144.
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Table des matières
Introduction
I – Organisation, fonction et régulation du génome et de l’épigénome
I -1 La chromatine, support de l’information génétique et épigénétique
I-1-a) Structure et compaction de la chromatine
Nucléosome : unité de base de la chromatine
I-1-b) L’euchromatine et l’hétérochromatine
L’hétérochromatine :
L’euchromatine :
I-2 Régulation et fonction de la chromatine
I-2-a) Qu’est-ce que l’épigénétique ?
I-2-a1) La méthylation de l’ADN
α Méthylation de novo de l’ADN
β Méthylation de maintien de l’ADN
γ Rôle de la protéine DNMT2 (ou TRDMT1) dans la méthylation de l’ADN
δ Méthylation de l’ADN et contrôle de l’expression génique
1-2-a2 La déméthylation de l’ADN
α Déméthylation passive de l’ADN
β Déméthylation active de l’ADN
1 Déméthylation par hydroxylation et oxydation
2 Déméthylation par hydroxylation et déamination
3. Déméthylation par déamination δ Déméthylation impliquant les protéines DNMT3A et DNMT3B
Ω À propos des DNA demethylating associated proteins
I-2-a3) Les modifications post-traductionnelles des histones
α L’acétylation des histones
1°Les histonedéacétylases – HDAC
2° Les histoneacétyltransférases – HAT
β La méthylation des histones
1° Les histoneméthyltransférases – HMT
2° Les histonedéméthylases – HMD
I-2-b) Les protéines liant l’ADN méthylé : les MBD
I-2-c) Les protéines à chromodomaine
I-2-c1) La famille SUV39
I-2-c2) La famille HP1
I-2-c3) La famille Polycomb (EZH2)
I-2-d) Collaboration entre la méthylation de l’ADN et les modifications des histones
I-2-d1) Désacétylation des histones, méthylation de H3K9 et de l’ADN
I-2-d2) Lien entre méthylation de H3K27 et méthylation de l’ADN
1-3 Epigénétique et Cancer
I-3-a) De l’origine épigénétique des cancers : « epigenetic progenitor of cancer » ?
I-3-b) Perturbations épigénétiques dans les cancers
I-4 Approche de la thérapie épigénétique
I-4-a) Inhibiteurs de la méthylation
I-4-a1) Les inhibiteurs de la méthylation de l’ADN
I-4-a2) Classification et usage clinique
I-4-b) Les inhibiteurs des HDACs (HDACi)
I-4-b1) Classification des inhibiteurs des HDACs
I-4-b2) Effets cellulaires des inhibiteurs des HDACs
I-4-b3) Inhibiteurs des HDACs en développement clinique
I-4-b4) Inhibiteurs des HDAC dans les lymphopathies
I-4-c) Thérapie épigénétique “nouvelle génération” : mécanismes d’action des inhibiteurs des protéines BET
II- HACE1 (HECT domain and ankyrin repeat containing E3 ubiquitin-protein ligase
1) un gène du chromosome 6q
II-1 Chromosomes 6q et délétion
II-2 HACE1 un gène suppresseur de tumeur codant pour une ubiquitine ligase de type E3
II-2-a) Ubiquitine et proteasome
II-2-a1) L’ubiquitinylation des protéines
II-2-a2) Ubiquitinylation et ciblage
II-2-a3) Structure et organisation du proteasome
α Le proteasome 20S
β Le proteasome 26S
II-3) Cibles de la protéine HACE1 (HECT domain and ankyrin repeat containing E3 ubiquitin-protein ligase 1)
II-3-a) La rhoGTPase RAC1
II-3-b) Protéine OPTN
III-Les lymphomes non Hodgkiniens
III-1 Définition et classification
III-2 Génétique des lymphomes non-Hodgkiniens –LNH
III-2-a) Chromosomes et cancers
III-2-b) Altérations génétiques dans les lymphomes B
III-2-c) Profil épigénétique dans les lymphomes B
III-2-d) Anomalies primaires et lymphomagenèse
III-2-d1) Analyse chromosomique
III-2-d2) Conséquences moléculaires des anomalies primaires
α Lymphome folliculaire et translocation t(14;18)(q32;q21) – BCL2
β Lymphomes B diffus à grandes cellules B et anomalies génétiques
Matériels et méthodes
I. Les échantillons
1- Conditions de culture :
2- Effecteurs pharmacologiques
3- ADAM assay
II. Les techniques de détection d’anomalies de nombre de copies de gènes
1 – La QMPSF (Quantitative Multiplex PCR of Short Fragments)
2- L’hybridation génomique comparative (CGH array)
III. Electrophorèse sur gel d’agarose
IV. Etude de méthylation
1 – La MSP (Methylation Specific PCR)
2 – Le pyroséquençage
V. Quantification de l’expression du transcrit
VI. Expression des protéines par Immunohistochimie
VII. Etude des modifications post-traductionnelles des histones au niveau du promoteur HACE1 par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP)
VIII. Analyse du cycle cellulaire et de l’apoptose par cytométrie en flux
XI. Extraction de lymphocyte B du sang périphérique :
OBJECTIF DU TRAVAIL
Resulats
I-Article 1
I-1- Résumé Article 1
I-2- Discussion Article 1
I-3- Résultats supplémentaires pour l’article 1
I-3-a Hypométhylation de l’îlot CpG 88 au niveau du promoteur HACE1-
I-3-b- Effet de la Trichostatine-A sur l’apoptose des cellules de Lymphome-B
I-3-c Résulats de d’hybridation génomique comparative (aCGH) et de profils d’expression génique (GEP)
I-3-d Résultats cliniques
II-Article 2
II-1- Résumé Article 2
II-2 Discussion Article 2
Discussion et perspectives
I – Existence d’une coopération étroite entre la méthylation de l’ADN, la méthylation des histones H3K9me2 et la désacétylation des histones au niveau du promoteur du gèneHACE1.
a) Quel rôle pour l’hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur du gène HACE1 dans les lymphomes de type B ?
b) L’augmentation de l’expression du gène HACE1 subséquente au traitement avec un inhibiteur des HDAC, la TSA.
c) Le rôle de la méthylation H3K9me2 des histones dans la sous-expression du gène HACE1
d) La méthylation de l’ADN, une conséquence de la méthylation et de la désacétylation des histones ?
II – Le code histone peut-il expliquer l’expression basale du gène HACE1 malgré une conformation répressive de la chromatine au niveau de son promoteur ?
III – La Voie Polycomb : la proteine EZH2 régulerait-elle l’expression du gène HACE1 ?
IV – Le gène HACE1 serait-il donc un gène suppresseur de tumeur impliqué dans la lymphomagénèse ?
V – Intérêt et avenir de la thérapie épigénétique
Bibliographie
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