CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS 

CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS 

Réparation des ovocytes receveurs

Pour le transfert nucléaire, on utilise des ovocytes mûrs qui, en l’absence de fécondation ou d’activation, sont normalement arrêtés au stade métaphase II de la méiose, stade où leur cytoplasme est compétent normalement pour la fécondation et ici, pour la greffe d’un noyau étranger (28, 30, 47). Dans les conditions naturelles, cette phase de métaphase II est celle où les ovocytes se trouvent au moment de l’ovulation (30, 47). Les ovocytes employés lors du clonage des bovins peuvent donc être prélevés in vivo juste après l’ovulation. Mais nous allons voir qu’ils peuvent aussi être obtenus par maturation in vitro. Dans tous les cas, ils ne nécessitent pas de provenir de vaches de haute valeur génétique .

Maturation in vitro des ovocytes receveurs

Méthode
Chez les bovins, lors des premières expérimentations de clonage par transplantation de noyaux, les ovocytes étaient recueillis in vivo après un traitement de superovulation de génisses ou de vaches qui devaient être abattues dans les quelques heures qui suivaient l’ovulation, et dont on perfusait les oviductes. La récupération post-mortem des ovocytes à partir des oviductes avait alors lieu environ 36 heures après le début des chaleurs, soit 8 à 12 heures après l’ovulation (28, 29, 41, 53, 57). Ces méthodes ont été rapidement abandonnées parce que, même si la qualité des ovocytes ainsi obtenus était optimale, leur maturation ayant eu lieu in vivo, elles étaient très onéreuses en raison des limites de la superovulation et de la nécessité de l’abattage des animaux, et leur réalisation demandait par ailleurs beaucoup de temps.
Depuis, il a été montré que des cytoplasmes préparés à partir d’ovocytes sélectionnés et maturés in vitro peuvent être tout aussi compétents que des cytoplasmes préparés à partir d’ovocytes maturés in vivo pour assurer le développement à terme d’embryons bovins reconstitués par transfert de noyaux (1). Et si, initialement, les ovocytes étaient produits in vivo, les progrès réalisés au niveau des recherches sur la maturation et la fécondation in vitro chez les bovins permettent désormais de produire entièrement in vitro des ovocytes receveurs en grand nombre (plusieurs centaines) et à un coût très réduit, tout en contrôlant étroitement leur maturité.
1. Ovocyte de vache obtenu par maturation in vitro. 2. Enucléation de l’ovocyte par micromanipulation. 3. Ovocyte énucléé ou cytoplasme receveur. 4. Contrôle de l’énucléation : chromosomes de la plaque métaphasique fluorescents dans la micropipette. 5. Embryon donneur au stade morula. 6. Groupe de cellules (ou blastomères) issu de cet embryon. 7. Reconstitution d’un embryon par micromanipulation à partir d’un blastomère et du cytoplasme receveur. 8. Fusion des membranes et obtention d’un embryon de stade 1 cellule. 9. Embryon cloné après 24 heures de culture (stade 2 cellules). 10. Embryon cloné après 7 jours de culture (stade blastocyste). 11. Clone de cinq veaux mâles issu du même embryon donneur.
En pratique, les ovaires de vaches de réforme sont récupérés à l’abattoir et transportés jusqu’au laboratoire dans une solution saline dont la température est, selon les équipes, maintenue entre 20°C et 38,5°C (12, 13, 30, 36, 41, 42, 47, 53, 62, 72). Les ovocytes sont alors ponctionnés de façon aseptique depuis des follicules à antrum de 1 à 10 mm de diamètre sous forme de complexes cumulus-ovocytes (1, 3, 14, 19, 27, 29, 36, 41). Seuls les complexes présentant un important espace périvitellin, des couches de cellules du cumulus assez nombreuses et intactes, ainsi qu’un cytoplasme ovocytaire homogène, sont sélectionnés pour subir une maturation in vitro . La maturation in vitro proprement dite reprend les protocoles de maturation utilisés durant la fécondation in vitro dans l’espèce bovine (12, 27, 41, 64) : les complexes cumulus-ovocytes sélectionnés sont cultivés in vitro pendant 22 à 24 heures à 38,5°C ou 39°C sur des monocouches de cellules de granulosa, dans un milieu M199 généralement supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal, 5 µg/mL de FSH (follicle stimulating hormone) bovine, 5 µg/mL de LH (luteinising hormone) bovine, 1 µg/mL d’œstradiol 17ß, et des antibiotiques (100 UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine), l’ensemble étant placé dans une atmosphère saturée en eau contenant 5% de CO2 dans l’air.A l’issue de cette période de maturation in vitro, plus de 90% des ovocytes ont atteint le stade métaphase II et peuvent donc être utilisés en grand nombre pour préparer des cytoplasmes receveurs .

Qualité sanitaire des ovocytes maturés in vitro

Lorsqu’on utilise le transfert nucléaire, il est impératif de se préoccuper des risques éventuels de contamination des embryons clonés. Et dans cette optique, il convient de faire spécialement attention aux conditions sanitaires de la maturation in vitro des ovocytes. A ce sujet, Thibier et Guérin (64) rapportent trois études françaises traitant des possibles infections, par divers agents pathogènes, d’ovocytes utilisés lors d’un protocole de fécondation in vitro (FIV). Etant donné que les différentes étapes de la maturation in vitro des ovocytes sont semblables, lors d’une procédure de fécondation in vitro ou bien lors d’un protocole de transplantation de noyaux, il nous est apparu intéressant, dans le cadre de notre travail, de relater les conclusions de ces recherches.
La première de ces études (Guérin et al., 1988) montre que des prélèvements d’ovocytes de vaches tout venant, mais dont certaines étaient éliminées dans le cadre des programmes nationaux prophylactiques (brucellose et leucose bovine enzootique), pouvaient être effectués sans que les agents pathogènes ne contaminent les ovocytes ou les liquides folliculaires. Dans la seconde investigation (Guérin et al., 1989) portant sur des ovocytes prélevés sur des vaches expérimentalement contaminées par le virus de l’IBR (infectious bovine rhinotracheitis), et en phase aiguë de l’infection, il a été montré qu’en fonction du statut infectieux de l’appareil génital (ovaires, liquides folliculaires et oviductes) de ces femelles, le virus pouvait être retrouvé dans les ovocytes et le milieu de maturation.La dernière publication (Guérin et al., 1990) ouvre, quant à elle, bien d’autres perspectives, car elle tend à démontrer qu’après contamination d’ovocytes au cours de leur maturation in vitro par le virus de l’IBR, le virus se trouve encore présent après neuf ou dix lavages. De plus, l’aptitude au développement des ovocytes infectés est inférieure.
Cependant, le risque de contamination d’un lot d’ovocytes par une vache en phase aiguë d’infection par le virus de l’IBR est extrêmement faible. Et en pratique, les équipes réalisant la maturation in vitro n’effectuent pas de contrôle sanitaire sur les vaches abattues dont les ovaires sont collectés. En France, les Directions des Services Vétérinaires imposent toutefois la destruction des ovaires et des ovocytes si un des animaux abattus se révèle positif au test de détection de l’ESB (encéphalopathie spongiforme bovine). La législation n’impose, quant à elle, que des contrôles virologiques (IBR – BVD (bovine viral diarrhoea)) et bactériologiques annuels sur les milieux de maturation qui sont collectés et congelés lors de chaque maturation in vitro (Chastant, communication personnelle).

Enucléation des ovocytes receveurs

Même si les ovocytes obtenus par maturation in vitro se trouvent au stade métaphase II, ils ne sont pas pour autant compétents pour la transplantation nucléaire : ils doivent encore être énucléés .Ainsi que nous l’avons évoqué précédemment, il est très difficile d’effectuer l’énucléation des ovocytes bovins par micromanipulation sans provoquer de lyse cellulaire. Pour éviter ceci, McGrath et Solter (cités par 28, 34, 41, 48, 49, 53, 54, 55, 61) ont mis au point, en 1983, à l’occasion de travaux menés sur des souris, un procédé permettant de rendre les techniques d’énucléation plus efficaces. Ces derniers ont en effet montré qu’en traitant, préalablement à l’énucléation, les ovocytes avec des drogues telles que la cytochalasine B ou la colchicine, qui inhibent la polymérisation des microfilaments d’actine et des microtubules du cytosquelette de la cellule, on pouvait assouplir suffisamment la membrane plasmique de façon à aspirer directement le noyau à l’intérieur d’une petite vésicule de cytoplasme, sans provoquer de rupture des cellules. C’est cette approche qui est actuellement communément utilisée chez les bovins.L’autre difficulté de l’énucléation est liée, comme nous l’avons également signalé auparavant, à la grande opacité du cytoplasme de l’ovocyte de vache. De ce fait, l’extraction des chromosomes était initialement réalisée « en aveugle » (41, 57). Le principe de l’aspiration « en aveugle » repose sur le constat que les chromosomes de l’ovocyte bovin au stade métaphase II sont disposés suivant une plaque située à proximité du globule polaire : en introduisant la pipette d’extraction au voisinage de ce globule polaire, et en aspirant la portion de cytoplasme adjacente, un expérimentateur confirmé est donc théoriquement capable de procéder à une énucléation complète de l’ovocyte. En théorie seulement, car d’une part, il arrive que le globule polaire dégénère ou migre loin des chromosomes, et d’autre part, à mesure que les ovocytes vieillissent, les chromosomes ont tendance à migrer vers le centre de l’ovocyte, loin du globule polaire (57). Dans ces conditions, les repères pour une intervention « en aveugle » sont donc modifiés, et du coup, l’énucléation des ovocytes n’est pas toujours bien accomplie puisque, par cette procédure, on considère que la proportion d’ovocytes effectivement énucléée ne dépasse pas 60% (41). Or, l’énucléation complète des ovocytes étant indispensable pour le développement des embryons issus de transplantation de noyaux, une autre technique, développée au laboratoire par Chesné et al. (13), est aujourd’hui adoptée : les ovocytes sont incubés en présence d’un fluorochrome spécifique de l’ADN à faible concentration (marqueur bisbenzimide Hœchst 33342). Les ovocytes sont ensuite soumis à une faible excitation dans l’ultraviolet et une amplification du signal émis par une caméra à basse énergie ; il est alors possible de visualiser, avec un microscope équipé en épifluorescence, les chromosomes de la plaque métaphasique. De cette façon, on peut directement contrôler la présence des chromosomes dans la pipette d’aspiration et avoir une fiabilité de l’énucléation des ovocytes proche de 100% (27, 28, 36, 41, 48, 53). De plus, cette méthode n’altère en rien la viabilité des cellules, ce qui est essentiel (28, 29, 41).

Au total, la procédure complète d’énucléation est la suivante : les ovocytes obtenus par maturation in vitro sont d’abord débarrassés de leurs cellules péri-ovocytaires par un traitement enzymatique à la hyaluronidase (0,5 mg/mL) associé à une aspiration répétée dans une pipette calibrée au diamètre ovocytaire (3, 28, 36, 41, 65). Les ovocytes sont ensuite incubés, pendant 10 à 15 minutes, en présence de cytochalasine B à une concentration variant entre 5 et 7,5 µg/mL (3, 12, 18, 28, 29, 44), et pendant 15 à 30 minutes, en présence de bisbenzimide (Hœchst 33342) à une concentration comprise entre 0,5 et 3 µg/mL (12, 13, 14, 29, 41, 62, 65). L’énucléation proprement dite peut donc commencer : pour cela, chaque ovocyte est immobilisé par une micropipette de maintien dans la chambre de manipulation d’un microscope inversé (28, 48). Cette micropipette exerce une aspiration permanente. Une seconde micropipette spécialement biseautée, fixée sur un micromanipulateur, vient alors percer la zone pellucide de l’ovocyte et aspirer le globule polaire ainsi qu’une fraction de cytoplasme adjacent contenant les chromosomes de la métaphase. Le contenu de la pipette est ensuite contrôlé sous fluorescence : on doit y trouver la plaque métaphasique et le noyau du globule polaire (3, 14, 28, 36, 57, 62). En pratiquant de la sorte, on estime que le taux d’énucléation des ovocytes est supérieur à 95%, les 5% restants étant lysés lors du processus d’énucléation lorsque les configurations de la métaphase et du globule polaire ne permettent pas leur extraction (53).

Table des matières

TABLE DES MATIERES
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES
INTRODUCTION
I. LA TECHNIQUE DE CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS
A. FONDEMENT THEORIQUE DE LA TECHNIQUE DE CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE (figure 1)
B. PROBLEMES A RESOUDRE POUR L’ETABLISSEMENT D’UNE PROCEDURE FIABLE ET EFFICACE DE CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS
1. Problèmes d’ordre technique
1.1. Obtention d’un grand nombre d’ovocytes receveurs utilisables pour le transfert nucléaire
1.1.1. Disponibilité en ovocytes receveurs
1.1.2. Enucléation des ovocytes receveurs
1.2. Fusion des membranes de l’ovocyte receveur et de la cellule donneuse
1.3. Activation des ovocytes receveurs
1.4. Culture des embryons reconstitués par transfert nucléaire
1.5. Variabilité des résultats
2. Problèmes d’ordre biologique
C. ETUDE DE LA TECHNIQUE DE CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS A PARTIR DE L’EXEMPLE DU CLONAGE EMBRYONNAIRE
1. Préparation des ovocytes receveurs
1.1. Maturation in vitro des ovocytes receveurs
1.1.1. Méthode
1.1.2. Qualité sanitaire des ovocytes maturés in vitro
1.2. Enucléation des ovocytes receveurs
1.3. Pré-activation des ovocytes receveurs
1.4. Congélation des ovocytes receveurs
2. Préparation des cellules donneuses
2.1. Origine de l’embryon donneur
2.2. Isolement des cellules donneuses
2.3. Congélation de l’embryon donneur
3. Reconstitution en série d’embryons par transfert nucléaire
3.1. Insertion du blastomère sous la zone pellucide
3.2. Fusion des membranes cellulaires du blastomère et de l’ovocyte receveur
3.3. Activation de l’ovocyte receveur
4. Culture des embryons reconstitués
5. Transplantation des embryons clonés dans l’utérus de receveuses
6. Rendement de la procédure – Taille des clones
D. ASPECTS FONDAMENTAUX DU CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE : REMODELAGE ET REPROGRAMMATION
1. Remodelage
2. Reprogrammation
3. Mécanismes responsables du remodelage et de la reprogrammation
¾ POINTS FORTS A RETENIR
II. NOUVELLES DONNES EN MATIERE DE CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS
A. LES NOUVELLES SOURCES DE NOYAUX DONNEURS
4.1.3. La percée : Dolly
4.2. Les succès du clonage somatique dans l’espèce bovine
Etude 1
Etude 2
4.3. Espoirs
B. CONGELATION DES EMBRYONS CLONES
C. CLONAGE ET SEXAGE
¾ POINTS FORTS A RETENIR
III. RENDEMENTS ET POTENTIALITES DE DEVELOPPEMENT DU CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS
A. EFFICACITE GLOBALE DU CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS
1. Clonage embryonnaire chez les bovins : revue non exhaustive
2. Clonage somatique chez les bovins : revue non exhaustive
B. DEVELOPPEMENT IN VITRO DES EMBRYONS BOVINS CLONES
1. Développement in vitro des embryons bovins reconstitués par transfert de noyaux embryonnaires
1.1. Efficacité moyenne
1.2. Qualité morphologique des blastocystes clonés
2. Développement in vitro des embryons bovins reconstitués par transfert de noyaux somatiques
2.1. Efficacité moyenne
2.2. Qualité morphologique des blastocystes clonés
3. Facteurs de variation du rendement in vitro
3.1. Variabilité du développement in vitro des embryons reconstitués
3.2 Influence du cycle cellulaire sur le rendement du clonage
3.2.1. Rappels sur le cycle cellulaire
3.2.1.1. Le cycle mitotique (Métézeau et al. (1994) et Etienne (1998), d’après Fréret (22))
3.2.1.2. L’état de quiescence (Métézeau et al. (1994) et Campbell (1999), d’après Fréret (22))
3.2.1.3. Les protéines de régulation du cycle cellulaire (Etienne (1998), d’après Fréret (22))
3.2.1.4. La méiose et la maturation ovocytaire (Campbell et al. (1996), d’après Fréret (22))
3.2.2. Effets du MPF sur le noyau transféré : interactions nucléocytoplasmiques
3.2.3. Maintien de la diploïdie dans les embryons reconstitués et effets sur le développement in vitro des embryons reconstitués
3.2.4. Quiescence des cellules donneuses de noyaux et effets sur le développement in vitro des embryons reconstitués
3.3. Qualités intrinsèques des cellules donneuses bovines
3.3.1. Influence du stade de développement de l’embryon donneur lors de clonage embryonnaire
3.3.2. Influence de l’âge, du nombre et de la taille des cellules d’un embryon donneur sur l’efficacité de la procédure de clonage embryonnaire
3.3.2.1. Influence de l’âge et du nombre de cellules de l’embryon donneur sur le développement des embryons reconstitués par transfert nucléaire
3.3.2.2. Influence de la taille des blastomères de l’embryon donneur sur le développement des embryons reconstitués par transfert nucléaire
3.3.3. Influence de l’état de différenciation cellulaire des cellules donneuses
3.3.3.1. Rappels sur la différenciation cellulaire (Alberts et al. (1995), d’après Fréret (22))
3.3.3.2. Variation des résultats du clonage en fonction du type cellulaire
3.4. Qualités intrinsèques des ovocytes receveurs bovins
3.4.1. Influence de l’âge de l’ovocyte receveur
3.4.2. Critères morphologiques de sélection des ovocytes maturés in vitro pour le clonage par transfert nucléaire
3.5. Conditions de culture in vitro des ovocytes et des embryons reconstitués
3.5.1. Influence des conditions de la maturation in vitro des ovocytes sur le développement des embryons reconstitués par transfert nucléaire (35)
3.5.2. Influence des conditions de culture in vitro des embryons reconstitués par transfert nucléaire sur leur développement ultérieur (35)
C. DEVELOPPEMENT IN VIVO DES EMBRYONS BOVINS CLONES
1. Efficacité moyenne
1.1. Développement in vivo des embryons bovins reconstitués par transfert de noyaux embryonnaires
1.2. Développement in vivo des embryons bovins reconstitués par transfert de noyaux somatiques
2. Variabilité du développement in vivo des embryons bovins clonés
3. Syndrome placentaire
¾ POINTS FORTS A RETENIR
IV. NORMALITE ET IDENTITE DES BOVINS CLONES
A. CARACTERISTIQUES DES VEAUX CLONES A LA NAISSANCE
1. Quelques études
Etude 1
Etude 2
Etude 3
Etude 4
Etude 5
2. Le syndrome du « gros veau »
2.1. Bases physiologiques et moléculaires du syndrome du « gros veau »
2.1.1. L’empreinte génomique
2.1.2. Les facteurs cytoplasmiques
2.2. L’hérédité du syndrome du « gros veau »
2.3. Conséquences cliniques et économiques du syndrome du « gros veau »
B. CARACTERISTIQUES DE CROISSANCE DES VEAUX CLONES
C. CARACTERISTIQUES DES BOVINS CLONES ADULTES
D. LES CLONES : DES INDIVIDUS IDENTIQUES ?
1. Les variations génétiques
2. Les facteurs environnementaux
3. Discussion
E. QUEL EST L’AGE DES BOVINS CLONES ? POINTS FORTS A RETENIR
V. INTERETS DU CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE DES BOVINS
A. INTERETS DU TRANSFERT NUCLEAIRE CHEZ LES BOVINS POUR LA RECHERCHE FONDAMENTALE
B. INTERETS DES CLONES BOVINS EN EXPERIMENTATION ANIMALE
1. Diminution du nombre d’animaux nécessaires (16)
2. Utilisation des clones bovins pour l’expérimentation
2.1. Utilisation des clones bovins en immunopathologie
2.2. Etude de l’influence des facteurs d’environnement
2.3. Etude du comportement alimentaire
2.4. Autres applications
C. INTERETS DU CLONAGE PAR TRANSFERT NUCLEAIRE DANS LA GESTION DES RESSOURCES GENETIQUES BOVINES
1. Créer un fonds génétique dans l’espèce bovine
2. Aider à la réalisation de programmes de croisement originaux
3. Gestion des races de petits effectifs
D. LES CLONES BOVINS ET L’ELEVAGE
1. Les stratégies de sélection actuelles dans l’élevage bovin
1.1. Déterminisme génétique des caractères (15)
1.2. Les facteurs du progrès génétique (15)
2. Perspectives d’application du clonage par transfert nucléaire dans l’élevage bovin
2.1. Amélioration de la connaissance de la valeur génétique des reproducteurs .156
2.1.1. Exemple en production laitière (15, 16)
2.1.2. Exemple en production de viande (16)
2.2. Diffusion de génotypes d’élite bien connus (15, 16)
2.3. Diffusion commerciale potentielle de clones bovins « terminaux »
2.4. Synergie entre le clonage et les biotechnologies de la connaissance du génome (15, 16, 42)
E. CLONAGE ET TRANSGENESE
1. La transgénèse : généralités (4)
2. Modalités d’obtention des bovins transgéniques (figure 12)
2.1. Micro-injection d’ADN dans le pronucléus de l’œuf fécondé
2.2. Transfert de noyaux transgéniques de cellules somatiques cultivées bovines dans des ovocytes énucléés
3. Clonage des bovins et transgénèse : perspectives d’application
3.1. Production de protéines à usage pharmaceutique et médical
3.2. Création de nouveaux modèles animaux
3.3. Thérapies cellulaires et xénotransplantations
¾ POINTS FORTS A RETENIR
VI. PROBLEMES POSES PAR L’UTILISATION DU CLONAGE CHEZ LES BOVINS
A. LIMITES POUR L’ELEVAGE BOVIN
1. Préservation de la variabilité génétique
2. Le contexte agricole actuel
B. CONDITIONS NECESSAIRES POUR L’APPLICATION COMMERCIALE DU CLONAGE DES BOVINS
C. LE CONTEXTE ECONOMIQUE ACTUEL DE L’ACTIVITE SCIENTIFIQUE DE RECHERCHE RELATIVE AU CLONAGE
D. LES POSITIONS DU PUBLIC VIS-A-VIS DU CLONAGE
1. Les clones bovins inquiètent les associations de consommateurs japonais (40)
2. Perspectives révélées par une étude canadienne (21)
E. CLONAGE : DE L’ETHIQUE A LA POLITIQUE, DE L’ANIMAL A L’HOMME
¾ POINTS FORTS A RETENIR
CONCLUSION
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

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