Classification et génétique des angioedèmes bradykiniques

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Matériel et méthodes

Design de l’étude

Il s’agit d’une étude clinique non médicamenteuse, prospective et comparative, menée dans le cadre de « l’appel d’offre jeune chercheur 2018 » au CHU de Rouen (protocole n°2018/349/HP), intitulée « MONOBRAD ».

Population de l’étude

Les critères d’inclusion étaient les suivants : patients majeurs, ayant un AOH de type I ou II, défini par une baisse du C1-inhibiteur < 50% de la valeur normale, associée à des épisodes répétés de crises d’angioedèmes. Ces patients étaient appariés à des volontaires sains, et l’appariement prenait en compte l’âge, le sexe et les facteurs de risque cardiovasculaires (hypertension artérielle, hypercholestérolémie, tabac, diabète).
Les critères d’exclusion étaient une contre-indication à l’utilisation de trinitrine ; une crise d’angioedème datant de moins d’un mois, la coexistence d’une autre pathologie chronique inflammatoire (polyarthrite rhumatoïde, maladie de Crohn…) ou une infection active traitée ou non par antibiothérapie.
Tous les participants ont donné leur consentement écrit de façon libre et éclairée.

Évaluation du phénotype vasculaire

La caractérisation vasculaire des patients a été faite via plusieurs méthodes :
– Fonction endothéliale par l’évaluation de la dilatation médiée par le flux : il s’agit de la mesure de la dilatation de l’artère humérale ou radiale en réponse à une augmentation du débit artériel secondaire à une ischémie provoquée par un brassard gonflé à une pression supérieure à la pression systolique artérielle pendant plusieurs minutes. Initialement le débit est donc fortement réduit avant d’augmenter brutalement à la levée de l’ischémie après dégonflage rapide du brassard. La dilatation artérielle est mesurée par échographie en réponse à cette augmentation de débit. (figure 8)
– Évaluation de l’épaisseur intima-media (figure 9) : Il s’agit d’une mesure échographique réalisée au niveau des artères carotides communes, évaluant l’épaisseur conjointe de l’intima (couche la plus interne du vaisseau) et de la media (couche intermédiaire du vaisseau). Cette zone est la première à être impactée par le processus d’athérosclérose, et l’augmentation de son épaisseur constitue un marqueur précoce en faveur d’un risque cardiovasculaire augmenté.
– Mesure de la rigidité artérielle et des propriétés géométriques et élastiques de la carotide : vitesse de l’onde de pouls carotido-fémorale, distensibilité carotidienne.
– Évaluation du glycocalyx à l’aide du MicroScan® de la société Microvision Medical. Ce dispositif permet d’évaluer la microcirculation sublinguale via une caméra connectée à un ordinateur portable dédié. Cette caméra est placée sous la langue. L’analyse est réalisée de façon automatique grâce au logiciel GlycoCheck, qui calcule le PBR (perfusion boundary region) qui correspond à l’espace de perfusion des capillaires, reflet indirect de l’épaisseur du glycocalyx.
Figure 8 : Schéma d’une dilatation médiée par le flux (FMD) : on mesure le diamètre artériel basal puis une phase d’ischémie de quelques minutes est créée, entrainant une baisse du débit et du diamètre artériel. A la levée de l’ischémie, le débit et le diamètre artériel en réponse augmentent, jusqu’à atteindre un diamètre de pic, avant de diminuer pour retourner à l’état basal. La FMD (exprimée en %) est ensuite calculée à partir de ces différents éléments.
Figure 9 : Mesure intima media en échographie sur une carotide commune. Le trait vert correspondant à l’interface sang intima, le trait orange correspondant à l’interface media adventice. L’épaisseur intima media est l’espace situé entre ces deux interfaces.
Un prélèvement sanguin comprenant 2 tubes a été pratiqué : 1 pour une extraction de sérum, 1 pour des analyses de laboratoire (NFS, profil lipidique, CRP, créatinine, glycémie à jeun)

Extraction monocytaire et culture cellulaire

Pour chaque patient, 10 tubes EDTA ont été prélevés, afin d’isoler les monocytes via une sélection immuno-magnétique négative à l’aide d’un kit Easysep™ (laboratoire Stemcell©).
Le kit se compose d’un cocktail de tétramères d’anticorps ciblant toutes les cellules à l’exception des monocytes marqués CD14+ CD16-, et de billes magnétiques se fixant sur les tétramères d’anticorps, ainsi que d’un aimant adapté (figure 10 et 11)
Figure 10 : cocktail de tétramères d’anticorps Figure 11 : aimant adapté à la méthode de sélection immuno-magnétique négative
Le sang complet a été incubé avec les anticorps et les billes magnétiques, puis l’extraction a été réalisée en mettant en contact le prélèvement avec l’aimant après un temps d’incubation, permettant de piéger la quasi-totalité des cellules n’étant pas des monocytes sur les parois du tube. Ensuite le surnageant a été récupéré et réincubé à nouveau pour optimiser le rendement monocytaire. Cette méthode a permis de récupérer 75 à 80% des monocytes contenus dans l’échantillon, avec une quasi absence de contamination par d’autres types cellulaires.
Les monocytes ont ensuite été en partie mis en culture dans des plaques 6 puits selon le schéma suivant: 1 à 2 puits (selon la quantité de monocytes extraite) contrôle négatif; 1 à 2 puits avec une stimulation B1 spécifique avec de la des-Arg-bradykinine (produit de dégradation de la bradykinine ayant une plus forte affinité pour le récepteur B1 que la bradykinine) à la concentration de 10 μM; 1 à 2 puits avec une stimulation B2 spécifique avec de la bradykinine à la concentration de 10 μM, et 1 à 2 puits avec une stimulation par le LPS à la concentration d’1 mM comme contrôle positif.
Le choix des concentrations s’est basé sur une publication de 2007 [45], où des cellules dendritiques dérivées de monocytes étaient stimulées selon les modalités ci-dessus, ce qui permettait d’augmenter l’expression protéique des récepteurs B1 et B2.
Le milieu de culture était composé de PBS, de sérum de veau foetal et d’EDTA à 500 mM.

Extraction d’ARN et de protéine

Une partie des monocytes a été utilisée pour réaliser une extraction protéique à l’aide d’un tampon RIPA couplé à de l’antiphosphatase et de l’antiprotéase.
Les monocytes restants ont été utilisés pour réaliser une extraction d’ARN avec un kit Nucleospin RNA™ (laboratoire Macherey-Nagel©) (figure 12), permettant une extraction plus pure d’ARN comparée à d’autres méthodes d’extraction, ce qui est adapté dans notre étude au vu de la faible production d’ARN des monocytes (nécessité d’en moyenne 2 à 3 millions de monocyte pour obtenir une quantité d’ARN suffisante, pour un rendement variant de 150 à 500 000 cellules par mL de sang). Cette méthode permet également d’extraire l’ARN de façon rapide (temps de manipulation totale aux alentours d’une heure).
Figure 12 : colonne d’extraction d’ARN Nucleospin RNA™ permettant d’avoir une purification d’ARN supérieure à la méthode au Trizol.
L’ARN et les protéines ont été conservés à -20°C en attendant d’être analysés.
Après 24h de culture, les cellules ont été récupérées, pour réaliser une nouvelle extraction protéique.

Expression protéique et génétique des récepteurs B1 et B2

L’expression génique des récepteurs monocytaires B1 et B2 a été mesurée par RTqPCR avec des primers adaptés (BDKRB1 pour le récepteur B1 et BDKRB2 pour le récepteur B2, du laboratoire Thermofisher©) après validation des primers sur des cellules endothéliales.
L’expression protéique des récepteurs monocytaires B1 et B2 a été mesurée par Western Blot à l’aide de gels Stainfree™ (laboratoire Biorad©) et d’anticorps dirigés contre les récepteurs B1 et B2 (anticorps polyclonaux de lapin, laboratoire Abcam©).
L’utilisation de gels Stainfree™ est justifiée par le fait que le poids moléculaire du récepteur B1 est quasiment similaire à celui du marqueur de comparaison de référence du laboratoire, rendant l’interprétation du résultat difficile en cas de superposition des deux bandes.
Le gel Stainfree™ permet de rapporter la quantité de la protéine recherchée sur les protéines totales présentes dans chaque puits, permettant ainsi à chaque puits d’être sa propre valeur étalon.

Inflammation et niveau de stress oxydatif

Le niveau d’inflammation a été évalué par un dosage du TNFα, de l’IL-1 et de l’IL-6 avec un kit ELISA multiplex dans le sérum des sujets. Le TNFα a été évalué sur les surnageants de culture après stimulations par un kit ELISA.
Le niveau de stress oxydatif est étudié par mesure colorimétrique des TBARs dans le sérum des sujets.
Figure 13 : Schéma résumé des manipulations de laboratoire : les patients sont prélevés de plusieurs tubes de sang, une partie sert au dosage colorimétrique des TBARs et à la mesure des cytokines inflammatoires en ELISA, et 10 tubes servent à l’extraction monocytaire par immunosélection magnétique négative.
Après extraction, une partie des monocytes sont lysés pour récupérer protéines et ARN qui sont analysés respectivement par Western Blot et PCR. L’autre partie des cellules est mise en culture selon différentes conditions, puis le surnageant est analysé pour mesure des cytokines inflammatoires en ELISA, et les cellules sont lysées pour réaliser un nouveau dosage protéique.

Analyse statistique

Les variables continues sont exprimées en médianes [25-75ème percentile], et les variables discrètes sous formes d’effectifs (pourcentage). Les variables continues sont comparées par test de Mann-Whitney ou t-test de Student si applicable. La normalité de la population est évaluée par un test de Shapiro-Wilk. Les variables discrètes sont comparées par test exact de Fisher ou test du Chi2 lorsqu’applicable.
Les tests statistiques étaient considérés comme significatifs pour un p bilatéral inférieur à 0.05 (risque  d’erreur de 5%).
L’ensemble des analyses a été réalisée avec le logiciel Prism (version 8.3.0)

Table des matières

I – Introduction
1 – Généralités
2 – Classification et génétique des angioedèmes bradykiniques
3 – Physiopathologie de l’angioedème bradykinique
4 – Récepteurs à la bradykinine
5 – Prise en charge de l’angioedème bradykinique
A – Traitements disponibles
B – Stratégie thérapeutique
6 – Angioedème bradykinique et dysfonction endothéliale
7 – Monocyte et dysfonction endothéliale chez les patients porteurs d’AOH
II – Objectifs de l’étude
III – Matériel et méthodes
1 – Design de l’étude
2 – Population de l’étude
3 – Évaluation du phénotype vasculaire
4 – Extraction monocytaire et culture cellulaire
5 – Extraction d’ARN et de protéine
6 – Expression protéique et génétique des récepteurs B1 et B2
7 – Inflammation et niveau de stress oxydatif
8 – Analyse statistique
IV – Résultats
1 – Caractéristiques démographiques
2 – Critère de jugement principal
3 – Critères de jugement secondaires
A – Expressions protéiques à l’état basal
B – Expressions protéiques après stimulation
C – Marqueurs d’inflammation et de stress oxydatifs
D – Évaluation du phénotype vasculaire
V – Discussion
1 – Expression génique des récepteurs
2 – Expression protéique des récepteurs à l’état basal
3 – Valeurs post stimulation par les agonistes spécifiques
4 – Stress oxydant et inflammation
5 – Confirmation de l’existence d’une dysfonction endothéliale chez les patients AOH
6 – Synthèse physiopathologique
7 – Points forts et faibles de l’étude MONOBRAD
VI – Conclusion
VII – Bibliographie

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