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LES CIRCONSTANCES DE DECOUVERTE
Elles sont très variables vu la diversité syndromique, allant de la découverte fortuite sur un hémogramme de routine à des tableaux compliqués. Les différents symptômes rencontrés peuvent être regroupés en un syndrome tumoral en rapport avec la prolifération blastique et en un syndrome d’insuffisance médullaire.
Syndrome d’insuffisance médullaire
L’insuffisance médullaire est liée à l’accumulation clonale de cellules blastiques sécrétant des cytokines inhibitrices de l’hématopoïèse au niveau de l’espace médullaire aboutissant à un défaut de production des lignées normales par la moelle leucémique. Le tableau clinique comporte de façon plus ou moins complète : un syndrome anémique, un syndrome infectieux et un syndrome hémorragique.
Le syndrome anémique
Il se manifeste à l’examen clinique par une pâleur cutanéo-muqueuse d’importance variable, d’apparition progressive ou brutale en cas d’hémorragie associée et une asthénie importante, assez fréquemment inaugurale. En outre elle associe selon le degré, une dyspnée d’effort voire de repos, des vertiges, des palpitations, des crises d’angor et un souffle systolique fonctionnel à l’auscultation [15].
Un syndrome infectieux
Il est présent dans la moitié des cas, se manifestant par une fièvre modérée avec ou sans foyer cliniquement décelable et ne régressant pas sous antibiothérapie. Les sites infectieux les plus fréquents sont la bouche (mucites), la sphère ORL (angines parfois ulcéronécrotiques, otite), la peau (abcès), la région périnéale et le poumon. Parfois, la fièvre n’est pas de cause infectieuse, mais spécifique de l’hémopathie, on parle de fièvre leucémique qui disparaît après le début de traitement chimiothérapique [16, 17].
Un syndrome hémorragique
Le plus souvent dû à une thrombopénie centrale, parfois de consommation (coagulation intravasculaire disséminée) en cas de LAM3 mettant en jeu le pronostic vital.
La thrombopénie peut être responsable en dessous d’un certain seuil, de purpura, d’ecchymoses (en particulier aux points de ponction veineuse), de saignements muqueux, d’épistaxis ou de gingivorragies [16].
Syndrome tumoral
Le syndrome tumoral est plus fréquent dans la LAL (quasi-constant) que dans la LAM (50% des cas), et il est la conséquence de la masse tumorale leucémique. Dans la LAM il est présent surtout dans les formes myélomonocytaires LAM4, et monoblastiques LAM5, il est habituellement absent dans les formes promyélocytaire LAM3.
L’hypertrophie des organes hématopoïétiques se manifeste par la splénomégalie qui est fréquente, de volume modéré, parfois associée à une hépatomégalie, et des adénopathies diffuses, symétriques et indolores.
Adénopathies
Les adénopathies superficielles (cervicales, inguinales, axillaires…) sont davantage observées dans les LAL (80 % des cas). Les adénopathies profondes (médiastinales, abdominales responsable de douleur et individualisable à l’échographie) sont très évocatrices de LAL de type T et peuvent occasionner un syndrome compressif. Les LAL de type Burkitt s’accompagnent fréquemment d’une masse maxillo-faciale ou ganglionnaire abdominale de croissance rapide.
Splénomégalie
C’est un élément commun au cours des LAL (75 % des cas), et des LAM (50 %) dans les formes monocytaires, elle est franchement palpable, parfois très volumineuse atteignant ou dépassant l’ombilic, et de consistance ferme.
Hépatomégalie
Une hépatomégalie associée peut se rencontrer dans 50 % des LAL et un peu moins souvent dans les types M4 et M5.
Autres atteintes
Un syndrome de leucostase rencontré dans les formes hyperleucocytaires des LAM et se traduisant par des phénomènes thrombotiques (occlusion des artérioles cérébrales et pulmonaires par les agrégats blastiques) ou hémorragiques (en particulier intracérébraux) de même que des atteintes neuro-méningée et osseuse ont également été rapportées.
Immunophénotypage
L’immunophénotypage par cytométrie en flux (CMF) permet d’étudier à haut débit, par immunofluorescence, toute préparation cellulaire en suspension et en premier lieu le sang. Il se présente comme un outil majeur dans la démarche diagnostique des leucémies aigues, en complément de l’analyse cytologique, notamment grâce à sa mise en oeuvre rapide. Il permet de déterminer l’appartenance à une lignée cellulaire et de préciser le niveau de différenciation pour identifier et/ou préciser le diagnostic des diverses formes de LA (classification WHO 2008 des LA).
Certaines structures cellulaires peuvent également être mises en évidence directement, sans anticorps. Il peut avoir un rôle pronostique par la mise en évidence d’un phénotype corrélé à des anomalies cytogénétiques et/ou moléculaires ;
Il peut permettre d’identifier la présence de certains marqueurs au sein des blastes en vue d’une utilisation d’une thérapeutique ciblée par anticorps monoclonaux. Il permet en outre de détecter le profil antigénique aberrant des blastes pouvant se révéler utile pour suivre la maladie résiduelle.
La classification immunophenotypique du Groupe Européen de caractérisation Immunologique des Leucémies aigues (EGIL)
La mise en évidence par cytométrie en flux de marqueurs cellulaires membranaires et intra cytoplasmiques a permis d’affirmer la nature myéloïde ou lymphoïde des blastes, de distinguer les LAL à précurseurs B (LAL-B) et les LAL à précurseurs T (LAL-T) puis d’individualiser différents sous-groupes. Les phénotypes immunologiques des LAL sont définis à partir des stades physiologiques de la maturation des cellules lymphoïdes dans la moelle osseuse et le thymus : la classification de l’EGIL.
Cette classification propose de classer les leucémies aigues en se basant uniquement sur l’immunophénotype et toute sa puissance réside sur le fait qu’elle propose des critères standardisés définissant une leucémie aigue comme myéloïde, lymphoïde T, lymphoïde B ou biphénotypique. Elle permet également de distinguer les LA biphénotypiques des LAM avec expression aberrante de marqueurs lymphoïdes de même que les LAL avec expression aberrante de marqueurs myéloïdes.
Règles d’interpretation selon l’European Group for Immunological characterization of Leukemia (EGIL) (tableaux I, II, III et IV)
LAL de la lignée lymphoïde B
– La positivité d’au moins deux marqueurs B : CD19/CD22/CD79a
– Et la négativité d’au moins trois des marqueurs T : CD3/CD2/CD5/CD7/CD8
– Et la négativité des marqueurs myéloïdes : CD13/CD33/CD117/MPO
LAL de la lignée lymphoïde T
– La positivité du CD3
– La négativité d’au moins deux marqueurs B : CD19/CD22/CD79a
– Et la négativité d’au moins trois des marqueurs myéloïdes : CD13/CD33/CD117/MPO
Il n’existe pas de classification aussi stricte pour les LAM mais certains marqueurs sont assez caractéristiques (Tableau I).
Etude cytogénétique et biologie moléculaire
L’examen cytogénétique est devenu un élément fondamental de la prise en charge des leucémies aigues, surtout des LAL, contribuant à en démontrer pour cette dernière l’hétérogénéité. Un caryotype est réalisé sur les cellules blastiques médullaires ou sanguines, permettant de rechercher des anomalies numériques (hyperdiploïdie…) et qualitatives (translocations…) des chromosomes. La valeur pronostique de certaines anomalies caryotypiques est reconnue et prise en compte dans les indications thérapeutiques.
Les techniques de biologie moléculaire, de plus en plus modernes, permettent :
– de confirmer la clonalité des cellules leucémiques en retrouvant un réarrangement soit des gènes codant pour le récepteur de l’antigène (lignée T), soit de ceux codants pour la synthèse des immunoglobulines (lignées B, à partir du stade II de maturation),
– de mettre en évidence des translocations chromosomiques non trouvées au caryotype,
– de rechercher des amplifications ou des délétions de régions codantes,
– d’évaluer quantitativement, après la mise en route du traitement, la maladie résiduelle (ensemble des cellules malignes persistant dans l’organisme et non détectables par les techniques morphologiques classiques).
CLASSIFICATION DE L’ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE (OMS) DE 2008
La nouvelle classification de 2008 des leucémies aigues proposée par l’OMS intègre des données génétiques et cliniques aux données morphologiques et immunophénotypiques déjà utilisées dans les précédentes classifications du groupe FAB et du groupe EGIL (European Group for the Immunological Characterization of Leukemias). Ainsi sont prises en considération la valeur pronostique de certaines anomalies génétiques, qui est désormais bien établie, et l’existence d’un traitement cytotoxique antérieur ou d’un antécédent de myélodysplasie qui conditionne le devenir de l’affection. La classification OMS établit le seuil de la blastose à 20 %. En effet, de nombreuses études cliniques ont montré que le pronostic des patients dont la blastose se situait entre 20 et 30 % était similaire à celui des LAM avec un taux de blastes supérieur à 30 %. Ainsi les AREB-T disparaissent de la classification des syndromes myélodysplasiques pour faire partie de celle des leucémies aiguës. La mise en évidence d’anomalies génétiques spécifiques de certains types de leucémies a abouti aux nouvelles propositions de l’OMS qui sont fondées sur :
– l’intégration des anomalies génétiques récurrentes
– la prise en considération de la dysmyélopoïèse ou des antécédents de syndrome myélodysplasique.
– la prise en considération des antécédents thérapeutiques (chimiothérapie ou radiothérapie). Cette notion de caractère secondaire d’une leucémie aiguë est totalement nouvelle. Ceci permet d’insister sur le caractère pronostique défavorable des LAM secondaires par rapport aux LAM de novo.
Quatre groupes principaux sont ainsi reconnus pour les LAM.
LAM avec anomalies cytogénétiques récurrentes :
– LAM avec t (8; 21) (q22; q22) ; RUNX1-RUNX1T1. Cette entité est apparentée sur le plan morphologique à la LAM 2. La présence de blastes avec un corps d’Auer piqué dans le noyau est pathognomonique de cette translocation.
– LAM avec t (15; 17) (q22; q12); PML-RARα. Cette translocation est caractéristique de la leucémie aiguë à promyélocytes (LAM 3).
– LAM avec éosinophiles médullaires anormaux et anomalies sur le chromosome 16 : inv. (16) (p13; q22) ou t (16; 16) (p13; q22) ; CBFβ-MYH11. L’inversion du 16 est ainsi une anomalie caractéristique de la LAM4 à éosinophiles.
– LAM avec anomalies chromosomiques 11q23 (MLL)
LAM avec anomalies associées aux myélodysplasies
– faisant suite à un SMD ou SMD/SMP
– ou présentant des anomalies cytogénétiques identiques à celles des SMD ou présentant une dysplasie sur plus de 50 % des cellules d’au moins 2 lignées.
LAM post-chimiothérapie quel que soit le traitement
LAM sans spécificité particulière : LAM de la classification FAB
Dans le cadre des LAL, la classification OMS actualise la classification FAB en tenant compte des éléments de la morphologie, de l’immunophénotype, des caractères cytogénétiques et du tableau clinique. Elle ajoute également la notion d’envahissement primaire d’un site ganglionnaire ou extra nodulaire en introduisant le terme de lymphome/leucémie lymphoblastique, en effet lorsqu’un patient présente une masse nodulaire et des lymphoblastes dans la moelle osseuse, la distinction entre une leucémie et un lymphome devient arbitraire. L’étude cytogénétique étant désormais indispensable au pronostic et décisionnelle sur la nature du traitement, l’OMS prend en compte les anomalies spécifiques à certaines entités. C’est ainsi qu’elle a classé les LAL en :
Leucémie aiguës / lymphomes lymphoblastiques B
– Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B sans autre spécification
– Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec anomalies cytogénétiques récurrentes :
o Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec (t9; 22) (q34; q11.2) ; BCR-ABL1
o Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec t (v; 11q23); MLL réarrangé
o Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec t (12; 21) (p13; q22) TEL-AML1 (ETV6-RUNX1)
o Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec hyperdiploïdie
o Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec hypo diploïdie
o Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec t (5; 14) (q31; q32) IL3-IGH
o Leucémie aiguë / lymphome lymphoblastique B avec t (1; 19) (q23; p13.3) TCF3 – PBX1
Marquage extracellulaire : Lyse avec lavage
Préparer les tubes
– Distribuer 1 μl (anti CD45) et 3 μl autres anticorps
– Distribuer 100 μl de prélèvement de sang
– Incuber 15 min à température ambiante et à l’obscurité
– Ajouter 2 ml de Lyse (dilué au dixième en eau distillée)
– Passer au vortex 2mn
– Incuber 10 min à température ambiante et à l’obscurité
– Centrifuger 5 min à 1500 tr/mn température ambiante
– Vider le surnageant par retournement
– Ajouter 2 ml de Facs flow
– Passer au vortex 2mn
– Centrifuger 5 min à 1500 tr/mn
– Vider le surnageant par retournement
– Ajouter 500 μl de Facs flow
– Les tubes sont prêts pour la lecture sur le Cytomètre
Marquage intra cytoplasmique : Lyse avec lavage
– Préparer les tubes
– Distribuer 3 μl d’anticorps de surface
– Distribuer 100 μl de prélèvement
– Incuber 15 min température ambiante obscurité
– Ajouter 2 ml de Lyse (dilué au dixième en eau distillée)
– Passer le tube au vortex pendant 2mn
– Incuber 10 min température ambiante obscurité
– Centrifuger 5 min à 1500 tr/min
– Vider le surnageant par retournement
– Ajouter 500 μl de FACS permeabilising (dilué en eau distillée)
– Passer au vortex pendant 2mn
– Incuber 10 min température ambiante obscurité
– Ajouter 2 ml de Facs flow
– Passer au vortex
– Centrifuger 5 min à 1500 tr/min
– Vider le surnageant par retournement (reste environ 100 μl de volume)
– Distribuer 3μl d’anticorps intra cytoplasmiques
– Incuber 30 min température ambiante obscurité
– Ajouter 2 ml de Facs flow
– Passer au vortex pendant 2mn
– Centrifuger 5 min à 1500 tr/min
– Vider le surnageant par retournement
– Ajouter 500μl de Facs flow et lecture sur le Cymomètre
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Table des matières
INTRODUCTION
PREMIERE PARTIE : Généralités sur les leucémies aigues
1. DEFINITIONS
1.1. Leucémies aigues lymphoblastiques (LAL).
1.2. Leucémies aigues myéloblastiques (LAM)
2. EPIDEMIOLOGIE
3. PHYSIOPATHOLOGIE
4. LES CIRCONSTANCES DE DECOUVERTE
4.1. Syndrome d’insuffisance médullaire
4.2. Syndrome tumoral
5. DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE
5.1. Hémogramme
5.2. Myélogramme
5.3. Immunophénotypage
5.4. Etude cytogénétique et biologie moléculaire
6. CLASSIFICATION DE L’ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE (OMS) DE 2008
DEUXIEME PARTIE : TRAVAIL EXPERIMENTAL
1. PATIENTS ET METHODES
1.1. Type et cadre d’étude
1.2. Critères d’inclusion
1.3. Critères de non inclusion
1.4. Population d’étude
1.5. Paramètres étudiées
1.6. Recueil des données
1.7. Considérations éthique
1.8. Méthodes d’Analyses.
1.8.1. La Numération
1.8.2. Le myélogramme
1.8.3. Cytométrie en flux
1.9. Marquage extracellulaire : Lyse avec lavage
1.10. Marquage intra cytoplasmique : Lyse avec lavage
1.11. Analyse des données
2. Résultats
2.1. Epidémiologie
2.2. Données cliniques
2.3. Données biologiques
2.3.1. Hémogramme
2.3.2. Medullogramme
2.4. Immunophénotypage
3. DISCUSSION
CONCLUSIONS
REFERENCES
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