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Nature et relation entre les principaux radicaux libres
L’ anion superoxyde [O 2°-]
C’est la forme réduite de l’oxygène moléculaire par la réception d’un électron. In vivo la première étape de contournement des règles de la mécanique quantique est la réduction mono électronique d’O2 pour le transformer en mono radical, ou anion superoxyde. Cette étape est réalisée par des enzymes spécialisées, les oxydases comme la NADPH-oxydase, qui apporte un électron donné par le NADPH sous forme H° et transforme l’O2 en O2°-(Serteyn, 2002).
C’est le premier radical formé lors du transport des électrons au niveau de la chaine respiratoire (Harman ; 2000). C’est aussi le plus abondamment formé dans la cellule mais il a la réactivité la plus faible vis-à-vis des substrats bioorganiques (Dellatre et al, 2007). Il peut diffuser dans les milieux hydrophobes tels que les membranes cellulaires ou il agit en désestérifiant les phospholipides (Deby et Goutier, 1991). Il a également d’autres cibles privilégiés telles que le cytochrome, l’ascorbate et la superoxyde dismutase (SOD) qui est une enzyme antioxydante, avec lesquelles il réagit très rapidement (Halliwell et Gutteridge, 1999).En milieu aqueux sa durée de vie est limitée à quelques millisecondes et il est le point de départ d’une cascade de réactions. En effet à partir d’O 2 ° – on aboutit d’une part, spontanément ou par voie enzymatique au peroxyde d’hydrogène d’autre part au peroxynitrite par réaction avec le NO°, et à l’oxygène singulet O2 (Stief ,2003).
Laprincipale source est l’explosion oxydative des cellules phagocytaires entrées en contact avec des antigènes ou des immun-complexes. Les cellules phagocytaires connues pour produire le radical superoxyde sont les polynucléaires neutrophiles, les polynucléaires éosinophiles, les monocytes et les macrophages (Favier, 2003)
Origine des espèces radicalaires de l’oxygène
En milieu biologique les radicaux libres sont formés le plus souvent par gain d’électron à partir de l’O2. En effet la molécule d’oxygéne présente la particularité d’avoir la structure d’un biradical libre, en raison de ces deux electrons célibataires de spin parallèle situés sur ces deux orbitales de grande énergie à l’état fondamental. Cette structure biradicalaire confére à la molécule d’oxygéne la capacité d’accepter facilement des électrons célibataires pour donner naissance à des especes partiellement réduites .
C’est ainsi qu’en acceptant un électron suplementaire la molécule O2 devient la forme reduite qui est le radical superoxyde O 2 °-(reaction1). Ce dernier est protoné à pH inferieur à 4.8, il s’appelle alors le radical perhydroxyl HO° 2 (reaction 2)(Dellatre et al, 2007).
Aspects physicochimiques des EROs
L’oxygène réagit avec la matiére vivante soit en accéptant des électrons, soit en se fixant sur la matiére organique : dans le premier cas on parle d’oxydation, dans le second d’oxygénation. La captation par l’oxygène de deux atomes d’hydrogéne pour former une molecules d’eau constitue le cas d’oxydation le plus connu, et la fixation de l’oxygéne sur un carbone pour former le CO 2 est un exemple d’oxygénation.
Pour realiser l’oxygènation et l’oxydation, l’oxygène doit franchir une barriere énergétique importante puisqu’il est normalement inerte face à la matiere vivante , inertie expliquée par sa structure totalement inhabituelle.
Contrairement à la plupart des molécules dans lesquelles les électrons sont groupés par paires, l’oxygène fondamental diatomique (O 2 ) est biradicalaire puisque deux de ses électrons ne sont pas appariés. L’oxygène est dit à l’etattriplet tandis que les molécules avec tous les électrons appariés sont dites à l’etatsingulet, et que les molécules à un seul électron sont dites à l’etat doublet.
Mais l’oxygene fondamental peut devenir singulet si l’on force les deux électrons à s’apparier en fournissant beaucoup d’energie : on obtient alors l’oxygène singulet qui ne posséde plus d’électron celibataire mais qui sera instable par suite de son état énergetique élevé.
D’aprés la mécanique quantique, les possibilités réactionnelles entre ces différents états sont les suivantes :
– réaction d’une molécule à l’état triplet avec une molécule à l’état singulet est interdite.
– Les réactions d’une molécule à l’état doublet avec une molécule à l’état singulet ou avec une molécule à l’état triplet sont autorisées
– les réactions entre molécules dans le méme état sont autorisées (Serteyn et al, 2002)
Ainsi, par interdiction quantique , l’oxygène fondamental triplet ne peut donc pas réagir avec la majorité des molécules organiques qui sont des singulet, et des intermédiaires radicalaires doivent intervenir .
Pour cela il faut donc soit amener l’oxygène de l’etat triplet à l’état doublet (monoradicalaire) ou à l’état singulet (non radicalaire), soit amener les molécules organiques à l’etat doublet. Ceci permet de comprendre la raison pour laquelle l’oxygène est tranformé en radicaux libres dans les réactions en chaine (Deby-Dupont,2002).
In vivo cela est rendu possible par l’intervention des catalyseurs biologiques que sont les oxydases , NADPH oxydase par exemple, et les oxygènases telles que les cyclooxygènases.
Le role de ces enzymes est de transformer les deux partenaires, O2 et molécule organique de manière à ce que l’un des deux deviennent doublet (radical libre).
Ainsi les oxydases font passer l’oxygène triplet au stade doublet (anion superoxyde), et les oxygènases transforment les molécules organiques en radical libre. Grace à ces catalyseurs enzymatiques les réactions de l’oxygène avec la matiére vivante sont possibles par voies douces non destructives, procédant par paliers avec dissipation progressive de l’energie réactionnelle généralement reconvertie sous forme d’ATP.
Les électrons libres des radicaux libres cherchent toujours à se stabiliser par formation de couples ou paires d’electron. Cette stabilité est associé à la vitesse de disparition ou de formation du radical et elle dépend de l’environnement de ce radical. Deux types de facteurs entrent en jeu dans la stabilité : les facteurs thermodynamiques et les facteurs cinétiques.
Facteurs thermodynamiques
Pour pouvoir prévoir la spontanéité thermodynamique des réactions faisant intervenir les radicaux libres il faut une connaissance des valeurs des potentiels standards d’oxydoréduction de ces espèces radicalaires.
En effet chaque espèce chimique possède une tendance à accepter (composé oxydant) ou à donner (composé réducteur) des électrons caractérisés par la valeur de son potentiel électrochimique normal de E 0 par rapport à un composé deréférence, l’hydrogène dont E 0=0V. Les composés les plus oxydants ont les valeurs de E 0 positives les plus élevées. Sur cette échelle la valeur E 0 de l’oxygène = +1,229V. Les espèces réactives de l’oxygène sont caractérisées par une valeur de E 0 qui permet de comparer leur pouvoir oxydant. Beaucoup d’entre elle possèdent une valeur de E 0 positive inferieure à celle de l’O 2 ; fontexception le peroxynitrite avec une valeur positive supérieure à celle de l’O 2 avec E 0= +1,4V, l’anion superoxyde avec une valeur de E 0 négative (E 0 = -0,33V) cequi lui confère des propriétés réductrices plutôt qu’oxydantes (Sawyer, 1991).
L’oxydoréduction met toujours en jeu un couple oxydant-réducteur dans lequel l’oxydant sera l’espèce qui possède la valeur de E 0 la plus élevée.
Cependant, une réaction thermodynamiquement possible peut ne pas se produire simplement parce que sa vitesse est trop faible. Ainsi, la connaissance des propriétés cinétiques des EROs est indispensable pour compléter la caractérisation physicochimique de ces espèces.
Facteurs cinétiques
Certains radicaux sont beaucoup plus stables que ne le laisse prévoir l’énergie de la réaction. On parle alors de stabilité cinétique par opposition à la stabilité thermodynamique. Le facteur principalement responsable de cette stabilité est l’encombrement stérique du centre radicalaire.
L’encombrement autour du centre radicalaire quand il devient important diminue fortement sa réactivité vis-vis d’un substrat.
Le concept de stabilité appliqué à l’ensemble des radicaux libres conduit à les classer en deux catégories en fonction de leur durée de vie. Ainsi on aura :
– les radicaux libres qui sont réactifs ou fugaces dont la durée de vie est inférieure à 10 -3 s : ils ont la capacité de réagir avec eux même ce qui limitentconsidérablement leur durée de vie. Ces radicaux sont impliqués dans la plupartdes processus radicalaires en particulier les réactions en chaine. C’est le cas du radical hydroxyle °OH, qui est un oxydant puissant non seulement parce que son potentiel standard d’oxydoréduction est très élevé (°OH/H 2 O =+2,34V à pH 7) mais également parce que ces constantes de vitesse sont très importantes. Cela signifie que lorsqu’un radical hydroxyle rencontre un substrat il réagit dés la première collision sans qu’un apport énergétique soit nécessaire. Il résulte de cette réactivité que le radical hydroxyle est une espèce qui diffuse très peu et par conséquent qui réagit quasiment sur le lieu de sa production ou à quelques dizaines de nanomètres de distance. Ce sont donc des radicaux peu sélectifs quin’ont pas de cibles moléculaires privilégiées. Une autre conséquence importante de cet aspect cinétique, est le fait que leur dosage va être difficile.
– les radicaux libres persistants et stables avec une durée de vie supérieure à 10 -3 s.
Une telle durée de vie peut être due à deux effets : un effet thermodynamique du à une grande délocalisation du radical, on parle alors de radicaux stables ou un effet cinétique du au fort niveau d’encombrement du radical, on parle alors de radicaux persistants.
Sources des espèces réactives de l’oxygène
En situation normale, les EROs sont produites en permanence par notre organisme (rôle physiologique) mais un système efficace de défenses antioxydantes telles que les vitamines, les enzymes, les oligoéléments permet de réguler cette production afin de prévenir tout dégât cellulaire excessif. Mais dans certaines conditions, divers mécanismes biochimiques peuvent submerger rapidement ces défenses antioxydantes et entrainer une surproduction d’EROs ce qui aboutit à un stress oxydatif. Celui-ci étant de plus en plus impliqué pour expliquer les dégâts cellulaires observés dans les états inflammatoires aigus, le vieillissement, le cancer, les troubles consécutifs à l’ischémie – reperfusion (transplantation d’organes), le diabète ou les maladies cardiovasculaires. (Pincemail, 1999).
En dehors de cette production par l’organisme, il y’a également des phénomènes exogènes qui peuvent influencer cette production.
Sources endogènes
In vivo en conditions normales de nombreuses enzymes sont responsables de la production des EROs dans le cytosol, les membranes et les mitochondries de types cellulaires variés.
NADPH oxydase
C’est une oxydase transmembranaire capable de transférer des électrons au travers des membranes biologiques. Sur le plan topologique, les NADPH oxydases semblent posséder des domaines structuraux en commun, les parties N et C-terminales étant orientées vers le cytosol. Elle catalyse la réduction mono électronique de l’oxygène en utilisant le NADPH ou le NAD comme donneur d’électrons selon la réaction suivante.
Mécanisme d’action des EROs
D’une manière générale, les EROs, selon leur endroit de production et leur nature, agissent sur des molécules intervenant à différents niveaux dans la transduction du signal, avec des effets variables selon la cellule, tantôt activateurs, tantôt inhibiteurs expliquant les apparentes contradictions et la variabilité des effets produits par les molécules utilisées comme antioxydants.
Les données de la littérature indiquent que les EROs agiraient en altérant l’état redox intracellulaire par consommation des éléments réducteurs entrainant l’activation de la cascade de la transduction du signal, ou par modification directe des protéines et autres molécules intervenant dans les cascades de la signalisation (Serteyn et al, 2002), mais il est encore impossible de le préciser.
Cependant il a été montré que le passage d’une protéine de l’état réduit à l’état oxydé peut s’accompagner d’une modification de conformation qui lui permet de fixer sur une région spécifique de l’ADN, d’interagir avec des récepteurs ou de modifier l’activité d’enzymes (Serteyn et al, 2002). Les fonctions thiols présentes sur les protéines joueraient un rôle majeur dans ces interactions avec les EROs.
Altération de l’état redox intracellulaire
Les milieux biologiques paraissent normalement réducteurs grâce à la présence de composés de faible masse moléculaire porteurs des thiols comme le glutathion, de NADH et NADPH , de molécules de masse moléculaire élevée riches en –SH, de molécules redox actives telles que ascorbate, urate, glucose, de protéines et peptides réducteurs comme les thiorédoxines ainsi que des enzymes de réduction comme la GSH reductase et les thoredoxines réductases qui jouent un rôle intracellulaire capital dans l’inhibition d’activation des facteurs nucléaires induite par les EROs. Il serait possible que les EROs agissent en provoquant la consommation de ces éléments réducteurs, et font basculer le potentiel oxydo-réducteur du milieu entrainant l’activation de la cascade de la transduction du signal (Serteyn et al, 2002).
Activation du facteur de transcription AP-1
Le facteur de transcription AP-1 est composé de deux protéines, c-Fos et c-Jun, et est très impliqué dans les processus de différenciation cellulaire mais également dans la modulation de l’expression de cytokines et autres médiateurs d’intérêt immunologique. De nombreuse études s’accordent à établir l’importance des EROs et de conditions prooxydants (radiations UV, radiation gamma…) pour l’activation cellulaire de AP-1. De faibles concentrations de peroxyde d’hydrogène ou d’anions superoxyde sont suffisantes pour déclencher la transcription des gènes de c-Fos et c-Jun, et l’expression de ces protéines.
Cependant ces conditions pro oxydantes ont des conséquences différentes selon les types cellulaires étudiées : l’expression de c-Fos et c-Jun induit l’expression de l’IL-2 par les cellules T de la lignée ESB (los et al, 1995), mais n’apparait pas suffisante pour induire la production de la même cytokine par les lymphocytes T Jurkat (Beiqing et al, 1996).
Régulation de l’apoptose par la mitochondrie
Les EROs interviendraient dans l’activation de l’apoptose par production brutale et importante d’EROs en provoquant des perturbations de l’équilibre redox entrainant la mort de la cellule à la suite d’altérations aigues des fonctions cellulaires, avec perte rapide du contenu en ATP. Les EROs sont ainsi présentés comme des médiateurs endogènes normaux de l’apoptose et certains observations confirment ce point de vue avec la chute des pools de GSH dans l’apoptose liée à la production de EROs, la capacité de la catalase à bloquer l’apoptose, l’attribution d’une activité antioxydante aux facteurs antiapoptotiques comme Bcl-2 et p35,( Kangan et al 2000).
Parmi les voies de régulation de l’apoptose, la voie mitochondriale prend une importance croissante via la libération du cytochrome c et le statut oxydo réducteur de la mitochondrie et de la cellule (Hancock et al 2001). En réponse à l’hypoxie elle augmenterait la production d’EROs intervenant comme seconds messagers et déclenchant une réponse adaptative (Serteyn et al, 2002). Lorsque les espèces réactives de l’oxygène sont produites dans la mitochondrie, elles peuvent réagir avec des groupes prosthétiques et des résidus aminés et initier la libération des facteurs apoptogénes. Le NO° est une de ces espèces qui peut protéger ou induire l’apoptose selon sa concentration et sa cible, et en fonction de la présence d’autres espèces activés comme l’anion superoxyde et d’une formation éventuelle du peroxynitrite. Les faibles doses de NO° protègent les lymphocytes B contre l’apoptose induite par une infection virale ou l’activation des récepteurs, tandis que les doses élevées de NO° induisent l’apoptose dans les macrophages, les hépatocytes les cellules gliales et les neurones. Les concentration en NO° joue un rôle essentiel non seulement dans les cellules bien équipées en NO-synthétase consécutives comme les neurones et les cellules endothéliales, mais surtout dans les cellules comme les hépatocytes, les astrocytes et les macrophages qui répondent aux cytokines pro inflammatoires et à d’autres agressions cellulaires ( anoxie, hypoxie, produits bactériens…) par l’induction d’une NO-synthétase produisant des concentrations importantes de NO°. Ces concentrations peuvent devenir cytotoxiques surtout si, simultanément l’anion superoxyde est formé par le système NADPH-oxydase (Bosca et Hortelanos, 1999). Il en résulte une synthèse accrue de ONOO ° . Le NO° réagit directement avec des protéines héminique, des protéines à fer et soufre, et les thiols réduits, composés impliqués dans la transduction du signal. Ces réactions sont réversibles. Par contre la réaction avec le peroxynitrite est irréversible. En outre, sur la membrane des mitochondries les EROs agiraient en provoquant l’oxydation de composés lipidiques comme les cardiolipines, une rupture du potentiel membranaire et une libération du cytochrome c. Si la capacité réductrice du milieu environnant, ou le GSH qui parait jouer un rôle majeur est altérée, le cytochrome passerait à l’état oxydé et déclencherait les mécanismes de l’apoptose (Hancock et al, 2001).
Cependant, certains de ces résultats sont contestés par d’autres travaux et plusieurs observations indiquent même que certaines espèces radicalaires pourraient atténués l’apoptose (Serteyn et al, 2002) ou que les EROs seraient une conséquence du déclenchement de l’apoptose et non sa cause (Hockenbery et al 1993). En plus, il a été montré la présence dans celle-ci de protéines antiapoptotiques comme Bcl-2 qui peut bloquer la libération du cytochrome c apoptotique.
Le rôle et les modes d’action des EROs dans l’apoptose restent donc largement controversés, controverses que seules les nouvelles recherches pourront résoudre.
– Espèces réactives de l’oxygène et transmission du signal dans les leucocytes
Dans les leucocytes (lymphocytes, monocytes/macrophages, neutrophiles, éosinophiles), les EROs agissent sur la régulation des récepteurs, les activités enzymatiques, la liaison des facteurs de transcription et l’expression des gènes (Formann et Torres 2001). Dans les macrophages ou les polynucléaires normalement destinés à assurer la phagocytose des bactéries et parasites, il y’a production d’espèces réactives de l’oxygène si brutale et intense qu’elle est connue, depuis les travaux de Baldridge sur le polynucléaire en 1933, sous le nom de « burst oxydatif », c’est-à-dire explosion respiratoire. Au sein du phagosome, l’activation de la NADPH oxydase et l’action des superoxydes dismutases (SOD) et NOS aboutissent à un mélange très corrosif de O 2°, H 2O2 , HO°, ONOOH, avec en plus dans le polynucléaire HOCl et 1 O2 . C’est ce mélange réactionnel, que l’Homme a imité en utilisant comme désinfectant l’eau de javel ou l’eau oxygénée, qui détruitpar oxydation l’ensemble des composants bactériens (Favier, 2003).
A coté de cette production d’EROs destinée à la phagocytose, il existerait dans les leucocytes une production d’EROs assurant la transmission du signal nécessaire aux différentes fonctions métaboliques des leucocytes.
Modification oxydative des protéines
Les modifications oxydantes des éléments de la cascade de la transduction du signal varient avec la nature de l’espèce oxydante. L’anion superoxyde pourrait agir en milieu lipidique par des fonctions de désestérification favorisant la formation de métabolites actifs. L’oxygène singulet serait un agent effecteur de l’expression d’enzymes comme la hème oxygénase, de protéines comme les heat shock protéines (HSP), de molécules d’adhésion, de cytokines de métalloproteases et sur l’activation des facteurs de transcription nucléaires (Ryter et Tyrell, 1998). Le NO° agirait sur les centres à fer et par formation de dérivés nitrosés ou du peroxynitrite qui agit par nitration des résidus tyrosyles interférant ainsi avec la phosphorylation (Serteyn et al, 2002).
D’une manière générale les EROs sont actifs sur des cibles sensibles comme les lipides insaturés, les acides aminés aromatique, les cystéines les complexes métalliques des métalloenzymes.
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Table des matières
INTRODUCTION
Chapitre I : RADICAUX LIBRES ET STRESS OXYDANT
I Radicaux libres de l’oxygène (RLO)
I-1-Nature et relation entre les RLO
I-2- Origine des RLO
II Aspects physicochimiques des espèces radicalaires de l’oxygène
II-1- Facteurs thermodynamiques
II-2- Facteurs cinétiques
III Sources des espèces réactives de l’oxygène
III-1 Sources endogènes
III-2 Sources exogène
IV Rôles physiologiques
V-1- Mécanismes d’action des EROs
V-2- Altération de l’état redox intracellulaire
V-3- Modification oxydative des protéines
Chapitre II : CIBLES DES RADICAUX LIBRES ET PATHOLOGIES ASSOCIEES
I-Les cibles
I-1 Les lipides
I-2 Les protéines
I-3 Les glucides
I-4 L’ADN
II-Les pathologies
II-1 Pathologies cardiovasculaires
II-2 Pathologies rhumatismales
II-3 Pathologies digestives
II-4 Pathologies broncho pulmonaires
II-5 Pathologies oculaires
II-6 Pathologies endocriniennes : diabète et complications
II-7 Stress oxydant et infertilité masculine
II-8 Pathologies neurodégénératives
II-9 Cancers
Chapitre III : MECANISMES DE DEFENCES DE L’ORGANISME
I-Antioxydants : définition et classification
II- Systèmes de défense enzymatique
II-1- Superoxyde dismutase
II-2- Catalase
II-3- Glutathion peroxydase et reductase
II-4-Peroxyrédoxines (Thioredoxines peroxydase)
II-5- Autres peroxydases
II-6- Hème oxygénase
II-7- Enzymes de réparation des dommages oxydatifs
III – Systèmes de défense non enzymatique
III-1 Les protéines transporteuses de minéraux
III-2 Les métallothionéines
III-3 L’albumine
III-4 Le glutathion
III-5 La bilirubine
III-6 Le coenzyme Q ou ubiquinone
III-7 La mélanine
III-8 Les antioxydants apportés par l’alimentation
VI- Les médicaments antioxydants
VI-1 La N-Acétyl-Cystéine
VI-2 Les anti-inflammatoires non-stéroïdiens
VI-3 Les inhibiteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine
Chapitre IV : METHODES D’EVALUATION DU STRESS OXYDANT
IV-1- Méthodes directs
IV-2- Méthodes indirectes
Chapitre V : ANTIOXYDANTS CONTREVERES ET PERSPECTIVES
CONCLUSION
Références bibliographiques
