Ciblage des tumeurs humaines positives à l’antigène Tn avec la MGL

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Altération des glycosylations

De même qu’il y a des mutations du patrimoine génétique qui apparaissent dans nos cellules et qui sont transmissibles à la descendance, des variations du glycome peuvent également apparaître dans certaines pathologies génétiques. Par exemple, le CDG (Congenital Disorder of Glycosylation) est un syndrome qui affecte la fabrication des glycosylations sur les protéines, ou la dystroglycanopathie qui est une altération d’une glycoprotéine, l’alpha-dystroglycane, qui contribue à la résistance mécanique des muscles (AFM-téléthon.fr). Néanmoins, les pathologies les plus fréquentes, aboutissant à des anomalies des glycosylations, sont les cancers. L’altération des glycosylations est une modification quasi-universelle dans les cancers (Hakomori 1989). Un résumé des glycosylations impliquées dans la progression des cancer, appelées TACA (Tumor Associated Carbohydrate Antigen), est présenté Figure 20 (Hakomori 1989).
Les modifications des glycosylations dans les cellules cancéreuses sont dues à diverses raisons : la perte d’expression ou l’expression excessive de certaines glycosylations, l’augmentation de l’expression de glycanes incomplets ou tronqués et, plus rarement, l’apparition de nouveaux glycanes. Toutefois, il ne s’agit pas simplement de la conséquence aléatoire d’une biosynthèse désordonnée dans les cellules tumorales. Généralement un sous- ensemble très limité de changements est fréquemment corrélé à la transformation maligne et à la progression de la tumeur. Étant donné que le processus de développement des cancers est « micro-évolutif », où seules les cellules les plus aptes survivent, il est probable que ces modifications spécifiques des glycanes soient sélectionnées pendant la progression de la tumeur (Varki et al. 2017).
Figure 20 : Importantes glycosylations associées aux cancers. Glycanes ayant des structures et des niveaux d’expressions différents des cellules saines. Les altérations les plus courantes sont l’augmentations globale de la sialylation, les modifications de ramification (branching) dans les N-glycosylations, modification d’élongation et glycosylations tronquées (Pinho and Reis 2015).
Les altérations couramment observées sur les cellules cancéreuses sont l’augmentation d’antigène de Lewis sialylé et des glycosylations sialylé et polysialylé, des fucosylations en quantité anormale, des altérations des ramifications des N-glycosylations et des O-glycosylations tronquées laissant exposés les antigènes Tn et T (Figure 20) (Reily et al. 2019; Satomaa et al. 2009).
Il y a plusieurs hypothèses qui expliquent les modifications de ces glycosylations dans les cellules cancéreuses. Premièrement, une sous- ou une suractivation des glycosyltransférases, qui peut être causée par une mauvaise régulation au niveau transcriptionnel (Buckhaults et al. 1997; Hatano et al. 2011; Kannagi et al. 2008; Pinho et al. 2012), au niveau des fonctions chaperonnes (Aryal, Ju, and Cummings 2010; Schietinger et al.
2006), au niveau de l’activité des glycosidases (Kakugawa et al. 2002), ou encore au niveau des trois à fois. Deuxièmement, un changement de la conformation tertiaire des protéines et de celle de la chaîne de glycane naissante (Pinho and Reis 2015). Et troisièmement, elles peuvent être dues à la variabilité des différents substrats et accepteurs ainsi qu’à la disponibilité et à l’abondance des donneurs de nucléotides de sucres et des cofacteurs (Kumamoto et al. 2001). Ces modifications ont plusieurs conséquences sur le fonctionnement des cellules cancéreuses et leurs interactions avec l’environnement.

Conséquences des altérations des glycosylations dans les cancers

Interactions cellule-cellule

Le développement des tumeurs malignes est en partie caractérisé par la capacité d’une cellule tumorale à modifier les contacts intercellulaires afin d’envahir les tissus environnants (Pinho and Reis 2015). La cadhérine épithéliale (E-cadhérine) est une glycoprotéine transmembranaire et une molécule majeure d’adhésion entre les cellules. Les glycosylations peuvent avoir un effet important sur l’adhésion cellule-cellule des tumeurs, en interférant directement avec la fonction de la E-cadhérine (Pinho et al. 2011).
En effet, l’ajout par la N-acetylglucosaminyltransférase 5 (GnT-V) de N-glycanes ramifiés à la E-cadhérine provoque un mauvais assemblage des jonctions adhérentes. Ceci les rend non fonctionnelles, ce qui compromet l’adhésion entre les cellules ainsi que les voies de signalisation en aval. Ces modifications contribuent au développement des tumeurs et à l’invasion de l’organisme par les cellules métastatiques (Guo et al. 2003; Ihara et al. 2002; Pinho et al. 2009, 2013). La fonction de la E-cadhérine peut être rétablie dans des lignées cellulaires en corrigeant la glycosylation aberrante sur un site asparagine spécifique de la E-cadhérine (l’Asn-554). Le rétablissement de la E-cadhérine entraine la suppression des tumeurs dans le cancer de l’estomac (Carvalho et al. 2016).
Les patients atteints d’un carcinome gastrique associé à une perte de la fonction de la E-cadhérine (non expliquée au niveau génétique ou structurel) présentent effectivement une augmentation des N-glycosylation-β1,6-GlcNAc sur la E-cadhérine (Pinho et al. 2013).

Interaction cellule-matrice extracellulaire

La matrice extracellulaire (MEC) est une structure dynamique, composée de glycoprotéines, de collagènes, de GAGs et de protéoglycanes. Elle fournit un soutien mécanique, structurel et génère un microenvironnement en trois dimensions qui participe grandement à la signalisation cellulaire. Elle est directement impliquée dans le développement des tumeurs, le maintien des niches de cellules souches et la progression du cancer (Pinho and Reis 2015).
Les héparanes sulfates présents dans la MEC et à la surface des cellules, peuvent moduler la croissance et la différenciation cellulaire, contrôler l’angiogenèse et l’homéostasie. Ils sont également capables de fixer les cytokines, les chimiokines et les facteurs de croissance et ainsi les protéger de la protéolyse (Sarrazin, Lamanna, and Esko 2011). Dans les cancers sévères, ils vont moduler l’activation de certains récepteurs protéiques comme les récepteurs « Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 » (HER2) ou « Epidermal Growth Factor Receptor » (EGFR), ce qui va induire une augmentation de la croissance cellulaire (Wade et al. 2013). En parallèle, l’héparane sulfate peut aussi libérer certaines isoformes de « Vascular Endothelial Growth Factor A » (VEGFA), qui régulent l’angiogenèse en stimulant la mobilité des cellules endothéliales et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins quand ils interagissent avec leur récepteur VEGFR. Ceci permet la vascularisation des tumeurs (Cecchi et al. 2012).
Dans la MEC, l’acide hyaluronique, une forme soluble de GAGs, interagit notamment avec le récepteur protéique CD44 qui est glycosylé. Ce récepteur est impliqué dans la prolifération, la différenciation, la migration et la signalisation des cellules cancéreuses (Günthert et al. 1991). Le rôle de CD44 glycosylé est loin d’être entièrement élucidé, mais il est impliqué dans l’augmentation de la mobilité et de la tumorigénicité des cancers, notamment en déclenchant la libération de hyaluronidases dégradant la MEC (Bharadwaj et al. 2009; Goupille et al. 1997; Günthert et al. 1991).
Les intégrines possèdent aussi un rôle essentiel dans l’interaction entre les cellules et la MEC. Cette interaction est très importante dans la migration et le comportement invasif des cellules tumorales (Liotta 1986). Les intégrines portent des N-glycosylations et sont d’importants récepteurs connectés à beaucoup de fonctions biologiques, comme la prolifération des cellules, la protection contre l’apoptose et la transformation maligne (Paszek et al. 2014). Lorsque les N-glycosylations de l’intégrine α5ß1 sont modifiées, dans le cas des métastases par exemple, elles vont bloquer leur faculté à former des hétérodimères et à interagir avec la MEC (Zhao et al. 2008). Ces modifications sont causées par la surexpression de la GnT-V qui augmente les N-glycosylation ramifiées ß1,6 sur les intégrines, ce qui altère l’adhésion à la matrice et provoque ainsi la migration des cellules (Guo et al. 2002). En opposition à ce phénomène, la surexpression de la GnT-III, va inhiber la migration cellulaire et augmenter l’adhésion des cellules à la MEC (Gu and Taniguchi 2004).

Métabolisme et signalisation

La forte abondance de glucose dans le cytoplasme des cellules cancéreuses ne contribue pas uniquement à l’augmentation de la glycolyse. Elle va également stimuler la voie de biosynthèse des hexosamines (mécanisme de régulation de l’activité des protéines en fonction de l’état nutritionnel, Figure 21) et ainsi augmenter le nombre d’uridines diphosphate N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) (Pinho and Reis 2015). Cette augmentation entraine la surexpression des protéines-O-GlcNacylées. Les O-GlcNAc participent à la régulation de la phosphorylation, la modification de la fonction et la localisation des protéines et régulent leur transcription (Zachara and Hart 2006). S’ils sont présents en quantité anormale, ils peuvent provoquer des dérèglements. Par exemple, dans le cancer du sein il y a une surexpression de O-GlcNAc transférase (OGT) ce qui provoque une hyper O-GlcNAcylation des protéines. Si le gène de l’OGT est sous-exprimé dans un modèle in vitro, cela provoque l’inhibition de la prolifération cellulaire, l’invasion par les cellules cancéreuses et des métastases (Caldwell et al. 2010; Ferrer et al. 2014; Ma and Vosseller 2014).
Les O-GlcNAc agissent également sur des oncogènes et des gènes suppresseurs de tumeur comme MYC et p53 ce qui contribue à l’oncogenèse. Comme les O-GlcNAc, les ramifications sur les N-glycosylations sont influencées par les nutriments (importante concentration de glucose dans le cytoplasme) avec des conséquences fonctionnelles, car le nombre de ramifications sur les N-glycosylations module l’activité et la rétention en surface d’un grand nombre de récepteurs protéiques de surface, incluant des récepteurs de facteurs de croissance (Boscher, Dennis, and Nabi 2011). En effet, les récepteurs fortement N-glycosylés vont interagir avec les Galectines 3 (Gal-3) qui limitent l’endocytose et augmentent la signalisation intracellulaire (Ju et al. 2008; Stanley 2007; Taniguchi 2007). Ces observations ont été faites sur des récepteurs impliqués dans la croissance tumorale comme l’EGFR ou le récepteur « Insulin-Like Growth Factor » IGFR (Lau et al. 2007).

Interactions avec le système immunitaire

Les glycosylations régulent divers aspects de la réponse immunitaire interférant dans la formation de tumeurs (Pinho and Reis 2015). La surveillance immunitaire inhibe la formation des tumeurs et maintient l’homéostasie cellulaire. Cette régulation est assurée par diverses lectines, comme les galectines, des lectines de type C et des siglecs, qui reconnaissent les glycanes et régulent la réponse immunitaire (MacAuley, Crocker, and Paulson 2014; Rabinovich and Toscano 2009). De plus, des anticorps peuvent se fixer à certaine aberration de glycosylation (GM2 ou lewis y) et induire une cytotoxicité dépendante du complément (Ragupathi et al. 2005).
En revanche, certaines glycosylations aberrantes peuvent aussi aider les cellules cancéreuses à échapper au système immunitaire. Elles interagissent également avec des récepteurs lectines des cellules dendritiques comme DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific Intercellular adhesion molecule-3-Grabbing Non-integrin), MGL (Macrophage galactose-type lectin) mais aussi des lectines solubles comme les Galectines. Ces interactions pourraient moduler les réponses immunitaires et inflammatoires provoquant l’échappement des cellules cancéreuses de la surveillance immunitaire (cet aspect sera développé dans la partie 3.Les Les lectines de l’introduction) (Läubli et al. 2014; Liu and Rabinovich 2005; Rabinovich and Toscano 2009; Saeland et al. 2007; Thijssen et al. 2015).

Les altérations sur les glycoprotéines

Altérations des N-glycosylations

Plusieurs groupes de glycosyltransférases agissent dans la synthèse les N-glycosylations, dont l’une des plus importantes est la GnT, qui est composée de six enzymes différentes (GnT I à VI) (Guo and Abbott 2015). Un dérèglement d’une de ces GnT, la GnT V serait impliqué dans la croissance et la progression des cancers du sein et de l’ovaire (Pierce et al. 1997).
La GnT V est activée dans des voies oncogéniques telles que Src ou HER-2/neu. Elle est impliquée dans la régulation de la tumorigenèse et l’invasion de nombreuses tumeurs humaines via divers récepteurs de surface cellulaire et de leurs voies de signalisation intracellulaire (Guo et al. 2010; Pierce et al. 1997). Les N-glycosylations ainsi modifiées, peuvent provoquer une suppression de l’apoptose, favoriser l’agressivité des tumeurs et la migration endothéliale (Komatsu et al. 2001; Pili et al. 1995; (Takenaka, Fukumori, and Raz 2002).
L’expression accrue de la GnT-V provoque une augmentation de la ramification β1-6 des N-glycosylations (Figure 22). Les cellules ayant une expression accrue de GnT-V sont plus métastatiques chez les souris, alors que les cellules cancéreuses dépourvues de GnT-V perdent ce phénotype métastatique. De même, l’inhibition métabolique de la synthèse des N-glycanes par l’alcaloïde végétal swainsonine (qui bloque la α-mannosidase II, empêchant ainsi le traitement complet des N-glycosylations et l’ajout de la branche β1-6 GlcNAc, Figure 16) inhibe la formation de tumeurs. L’expression accrue de GnT-IV pour former un N-glycane β1-4 ramifié tétra-antennaire active également la progression de la tumeur. Les ramifications et les extensions des N-glycosylations augmentent la progression des tumeurs par les liaisons avec les galectines via les poly-acétyl-lactosamines aux extrémités. Cette interaction conduit à une signalisation prolongée des facteurs de croissance, et la génération de sialyl Lewis x (SLex). Les glycosylations fortement fucosylées et sialylées sont reconnues par les sélectines et favorisent l’invasion tumorale (Varki et al. 2017).
En revanche, l’expression accrue de la N-acétylglucosaminyltransférase III (GnT-III), observée dans les hépatomes de rats et les tumeurs mammaires de souris, supprime la progression de la tumeur et les métastases. Les souris dépourvues de GnT-III présentent une augmentation du nombre de tumeurs mammaires et des métastases pulmonaires, alors qu’une expression élevée de GnT-III est corrélée à une meilleure survie sans rechute dans le cancer du sein humain (Varki et al. 2017).

La sialylation et la fucosylation

La sialylation des glycosylations est impliquée dans l’adhésion, la reconnaissance et la signalisation cellulaire. Son augmentation est généralement associée au cancer.
Des motifs polysialylées sont observés dans des formes sévères de gliomes et de neuroblastomes mais aussi dans des cancers du poumon (.A. Falconer et al. 2012).
Des antigènes sialylés associés au cancer sont les structures de Lewisa (SLea) et de Lewisx (SLex) qui sont retrouvées à des taux élevés chez les patients cancéreux ayant de faibles chances de survie (Figure 23). Les structures SLex sont reconnues par des sélectines, des molécules d’adhésion des cellules vasculaires. Cette interaction peut entrainer des formes d’embolies de cellules cancéreuses et de plaquettes et ainsi les stabiliser sur les cellules endothéliales favorisant la formation de métastases (Pinho and Reis 2015). La détection des structures SLea est utilisée en clinique pour le diagnostic des cancers pancréatiques, colorectaux, gastriques et biliaires (Locker et al. 2006; Reis et al. 2010).
La fucosylation utilise le GDP-fucose comme intermédiaire, qui est synthétisé par deux voies, la voie de novo et la voie de récupération (Becker and Lowe 2003). La voie de novo, par la catalyse de la GDP-mannose-4,6-dehydratase, transforme un GDP-mannose en GDP-fucose et la voie de récupération, par la GDP-fucose synthase, utilise un fucose libre. Le GDP-fucose est ensuite utilisé pour fucosyler des glycoprotéines. Le noyau fucosylé (liaison d’un fucose en α1,6 sur le premier résidu GlcNAc des N-glycosylations) catalysé par la fucosyltransférase 8 (Fut8), joue un rôle important dans les cellules au niveau de la croissance et de la différenciation. Il est notamment requis pour la fixation du facteur de croissance EGF sur son récepteur (Lin et al. 2011).
Une augmentation des taux de noyaux fucosylés est associée à certains cancers notamment dans le mélanome métastatique ou le cancer ovarien (Agrawal et al. 2017; Lv et al. 2019). Chez les patients atteints d’un cancer de la prostate ou du foie, des protéines plasmatiques sont également fucosylées ce qui peut être utilisé comme biomarqueur pour un diagnostic précoce (Lin et al. 2011; Okuyama et al. 2016; Saldova et al. 2011). A l’inverse, le cancer de l’estomac est associé à une diminution du noyaux fucosylé (Zhao et al. 2014).

Altérations des O-glycosylations

L’ajout du GalNAc sur les protéines est catalysé par la acetylgalactosamyltransférase (Brockhausen 2006). Dans des conditions normales, les O-glycosylations sont prolongées par différents sucres pour former quatre noyaux de glycosylation très conservés (Figure 19) qui décoreront les protéines membranaires une fois allongées.
Les mucines qui traversent la membrane plasmique sont connues pour être impliquées dans la transduction de signaux, pour faciliter l’adhésion des cellules ou pour avoir une fonction antiadhésive (Brockhausen 2006). Comme pour les N-glycosylations, les O-glycosylations peuvent être altérées, elles sont liées à la progression du cancer et à la formation de métastases (Van Den Steen et al. 1998). À la différence des N-glycosylations altérées, qui sont très ramifiées, les O-glycosylations vont présenter des épitopes tronqués. Ils sont la conséquence de 2 phénomènes connus. Le premier est la surexpression de l’enzyme ST6GalNAc-I qui va sialyler le GalNAc et inhiber l’action des enzymes C3GnT et C2GnTn, ce qui conduit à la formation de l’antigène S-Tn (Chandrasekaran et al. 2006; Dalziel et al. 2001; Gupta et al. 2020). Le deuxième phénomène est une mutation sur le chromosome X qui porte le gène COSMC, codant pour une protéine chaperonne pour l’enzyme C1GalT1. Cette protéine permet d’empêcher l’agrégation et de prévenir la dégradation dans le RE. Cette mutation entraîne la perte de l’activité de C1GalT1 et la formation de l’antigène Tn (Gupta et al. 2020).

L’antigène Sialyl Thomsen-nouveau

L’antigène Sialyl Thomsen-nouveau (s-Tn) est lié à l’augmentation de la croissance tumorale et au nombre de métastases dans les cancers du sein et de l’estomac (Julien et al. 2006; Ozaki et al. 2012). Il peut inhiber la formation de masses tumorales stables dans le cancer de la prostate, ce qui favorise la dissémination cellulaire (Munkley et al. 2015). La présence de l’antigène s-Tn sur les mucines inhibe la cytotoxicité des lymphocytes Natural Killer (NK), protégeant les métastases de l’apoptose quand elles empruntent la circulation sanguine (Itzkowitz and Itzkowitz 1992). Ces glycosylations jouent un rôle important dans l’interaction cellule-cellule et cellule-matrice, telle que la reconnaissance par les lectines (Selectine, Siglec et Galectine) des cellules du microenvironnement tumoral. Ces glycosylations sont impliquées dans la progression du cancer (Häuselmann and Borsig 2014).

L’antigène Thomsen-nouveau

En 1969, l’antigène Thomsen-nouveau (Tn) a été décrit pour la première fois, par sa mise en évidence via la lectine d’escargot Helix Pomatia Agglutinin (HPA), qui reconnaît spécifiquement le α-GalNAc terminal (Prokop and Uhlenbruck 1969). Les résultats présentés par Springer et al, en 1974, ont ensuite montré que l’antigène Tn est fortement exprimé dans 90% des carcinomes mammaires, indiquant un lien entre l’antigène Tn et ce cancer (Springer, Desai, and Banatwala 1974). Cet antigène est présent sur plus de 80% des carcinomes humains. On le retrouve exprimé dans des cancers de la vessie, du col de l’utérus, de l’ovaire, du colon, de l’estomac et de la prostate (Desai 2000; Springer 1984, 1997). Pour certains de ces cancers, un fort taux d’expression de cet antigène est corrélé avec un pronostic vital faible et un potentiel de formation de métastases (Kakeji et al. 1991; Laack et al. 2002). Il est généralement coexprimé avec l’antigène s-Tn et n’est pas exprimé dans les cellules saines (Fu et al. 2016). Le rôle de l’antigène Tn n’est pas entièrement connu, mais des études montrent qu’il est reconnu par la lectine MGL (Higashi et al. 2002; van Kooyk, Ilarregui, and van Vliet 2015) exprimée par les cellules dendritiques et les macrophages, pouvant ainsi entraîner des effets immunosuppresseurs et permettre à la tumeur d’échapper à la vigilance du système immunitaire (Corfield and Berry 2015; Napoletano et al. 2007; Saeland et al. 2007).
L’omniprésence de l’antigène Tn dans de nombreux cancers et son absence dans les cellules saines, en fait une cible de choix pour la thérapie ciblée ou pour l’élaboration de vaccins synthétiques antitumoraux. Certaines études montrent, en effet, qu’une réponse immunitaire produisant un auto-anticorps contre les antigènes Tn et s-Tn liés à la mucine 1 (muc1) peut être obtenue avec des molécules les associant à des protéines ou peptides immunostimulants (Blixt et al. 2011; Gaidzik, Westerlind, and Kunz 2013; Pedersen et al. 2011; Wittrock, Becker, and Kunz 2007). Néanmoins, il a été montré de manière significative que cet anticorps réagit uniquement avec le carbohydrate lorsque celui-ci est porté par Muc1, mettant l’accent sur le rôle du squelette peptidique dans la reconnaissance par les cellules sentinelles du système immunitaire (Loureiro et al. 2015). De plus, des études précliniques montrent que ces anticorps spécifiques de ces antigènes glycosylés ralentissent la croissance tumorale mais ne la bloquent pas (Ibrahim et al. 2013; Julien et al. 2009; Miles et al. 2011).
Des études ont été conduites dans le but de développer de nouveaux anticorps plus spécifiques contre l’antigène Tn (CU-1, MLS128, BRIC 111 …) (Numata et al. 1990; Parsons, Wu, and Jones 1991; Takahashi, Metoki, and Hakomori 1988). Ces anticorps semblent ralentir la prolifération de cellules cancéreuses, mais leur spécificité est encore discutable (Zamri et al. 2012). En effet, de récentes études montrent une spécificité des anticorps pour les glycanes eux-mêmes, provoquant une affinité pour les mucines saines ou les hématies du groupe A (Loureiro et al. 2015; Parsons et al. 1991). Il n’existe pas à l’heure actuelle d’anticorps ciblant l’antigène Tn qui ait été soumis à des essais cliniques (Loureiro et al. 2015). Ceci peut être expliqué par la difficulté à développer un anticorps spécifique de cet antigène. C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés à une autre stratégie de ciblage, basée sur l’élaboration d’une molécule capable de reconnaître l’antigène Tn. Pour cela, nous proposons d’utiliser la lectine MGL.

Les lectines

Les lectines sont une famille de protéines ubiquitaires capables de se lier spécifiquement et de façon réversible à certains glucides sans les modifier. Elles ne comprennent pas les anticorps parfois capables aussi de reconnaître des sucres, ni les enzymes (Lis and Sharon 1998). Les lectines présentent une grande diversité de repliements et de structures quaternaires et l’ensemble de leurs structures tridimensionnelles a été archivée dans la nouvelle base de données Unilectin (Bonnardel et al. 2019; www.unilectin.eu). Cette base de données classe les lectines connues en familles en utilisant leur origine, leur structure tridimensionnelle et leur spécificité.
La découverte des lectines date de 1888 avec l’utilisation d’extraits de graines de ricin pour agglutiner les globules rouges. Par la suite, ces « agglutinines » ont été découvertes dans les graines de nombreuses autres plantes et ont alors été rebaptisées « lectines », du latin select car elles permettaient la distinction des groupes sanguins ABO (Goldstein et al. 1980). C’est chez les plantes que les lectines, qui ont une pléthore de rôles via leurs interactions avec des protéines de stockage et des enzymes (Rüdiger and Gabius 2002) ont été étudiées en premier. Les premières études de 1976 ont en effet mis en avant leur rôle insecticide dans la protection des légumes contre des insectes ravageurs (Janzen, Juster, and Liener 1976). D’autres rôles ont été découverts comme l’inhibition de la sporulation et de la croissance de certains champignons, confirmant un rôle protecteur des lectines chez les plantes (Barkai-Golan, Mirelman, and Sharon 1978). Par ailleurs, des lectines existent également sur les virus et les bactéries, leur permettant d’interagir avec leur environnement et de faciliter l’infection de leurs hôtes (Rostand and Esko 1997; Stencel-Baerenwald et al. 2014). Dans ce projet, nous nous sommes essentiellement intéressés aux lectines présentes chez les mammifères et plus précisément chez l’Homme.
Les lectines chez l’Homme /mammifères.
La première lectine de mammifère, le recepteur Asialoglycoprotéine (ASGPR), fut découverte en 1960 par Anatol Morell et Gilbert Ashwell (Ashwell and Morell 1974). Les premières lectines animales identifiées étaient spécifiques des glycanes endogènes. Mais de nouvelles lectines ayant la propriété de cibler les glycanes exogènes, comprenant des protéines circulantes dans le sang ou des micro-organismes, ont été découvertes par la suite. Les lectines reconnaissent les sucres grâce à un domaine structural appelé domaine de reconnaissance des glucides (Carbohydrate Recognition Domain, CRD) (Varki et al. 2017). Chez les mammifères, les 3 familles de lectines extracellulaires sont les lectines de type S, de type I et de type C (Figure 24), mais il existe d’autre familles de lectines, telles que les calnexines, les lectines de type M ou les chitinase lectine like, présentes à l’intérieur de la cellule (Braakman 2001; Chang et al. 2001; Parodi 2000).
Les fonctions des lectines sont très variées chez les animaux. Les principaux rôles sont le transport de glycoconjugués dans les cellules, des fonctions chaperonnes, la médiation de l’endocytose, la croissance cellulaire, les interactions cellulaires et l’implication dans le fonctionnement du système immunitaire, notamment dans la reconnaissance du non-soi et dans les mécanismes de défense (Kilpatrick 2002).
Implication des lectines animales dans le cancer
Certaines de ces lectines jouent un rôle dans les cancers en interagissant avec les glycosylations altérées décrites ci-dessus. Ces interactions peuvent aider les cellules cancéreuses à mieux se développer.
C’est le cas par exemple de certaines galectines, qui sont des lectines sécrétées dans la matrice extracellulaire et qui ont plusieurs rôles biologiques. Elles sont, entre autres, impliquées dans le développement et la régulation de l’activité des cellules immunitaires. En se liant aux glycosylations endogènes, elles contribuent à l’interaction entre les cellules et la matrice 37 extracellulaire. L’interaction des galectines à la surface des cellules peut moduler les fonctions cellulaires. La galectine 3 est décrite comme formant des réseaux avec les glycoprotéines de la surface cellulaire, par exemple, avec le récepteur des cellules T (TCR) via les N-glycanes. L’expression de ces même N-glycanes est en partie régulée par les ramifications des N-glycanes par l’intermédiaire de la GnT-5 (Granovsky et al. 2000). Ce sont ces mêmes ramifications qui sont surexprimées sur des récepteurs de facteur de croissance dans certains cancers, qui interagissent avec les galectines empêchant leur endocytose, intensifiant ainsi leur effet (Pinho and Reis 2015).
Les Siglecs (Siglec-15), lectines de type I présentes sur les cellules myéloïdes, sont de plus, spécifiques de glycanes présentant des acides sialiques terminaux. Elles peuvent donc interagir avec s-Tn. Cette interaction sur les cellules tumorales entraîne une augmentation de la sécrétion de TGF-β dans le microenvironnement de la tumeur ce qui est associé à la progression du cancer (Takamiya et al. 2013).
Les lectines de type C
En 1988, l’équipe de K. Drickamer utilise pour la première fois le terme de lectine de type C pour identifier une classe de lectines dépendantes du Calcium (Ca2+) (Drickamer 1988), contrastant avec les Galectines et Siglecs décrites ci-dessus. Ces lectines, qui peuvent être soit solubles soit membranaires, se lient aux sucres par l’intermédiaire d’un domaine globulaire CRD très conservé. Les lectines membranaires sont composées d’un domaine cytoplasmique, d’une partie transmembranaire et d’une partie extracellulaire (ECD) comprenant une partie étendue « neck » et un domaine de reconnaissance CRD (Figure 25).
Le domaine de reconnaissance des sucres (CRD) des lectines de type C est typique et assez conservé dans l’ensemble de cette famille. Il est composé d’une chaîne de 110 à 130 acides aminés repliée en 2 hélices a et 6 ou 7 brins b pouvant former 2 feuillets b antiparallèles, et une longue boucle se trouvant sur « la face supérieure » caractéristique des lectines de type C. Cette boucle est cruciale pour la fixation du calcium et la reconnaissance des sucres (rectangle en pointillés bleu, Figure 26) (Nagae and Yamaguchi 2019; Zelensky and Gready 2005). La structure du CRD est stabilisée par quatre à huit cystéines conservées qui forment des ponts disulfures (Zelensky and Gready 2005). Le CRD de ces lectines contient 1 à 4 sites de fixation du calcium, dont l’un d’entre eux strictement conservé, présent dans le site de liaison, permet l’interaction entre le CRD de la lectine et les sucres ; les autres ayant un rôle important dans la stabilisation et le repliement de la protéine (Weis, Taylor, and Drickamer 1998; Zelensky and Gready 2005).
Le site de liaison des sucres dépendant du Ca2+, conservé dans le CRD, est caractérisé par des motifs spécifiques qui contrôlent la spécificité envers les glycanes. Le motif EPN (Glu-Pro-Asn) permet l’interaction avec les ligands de type mannose (Man, GlcNAc, Glc), contenant des groupements hydroxyles équatoriaux sur les carbones en position 3 et 4 (Figure 27B). Son remplacement par un motif QPD (Gln-Pro-Asp) permet la reconnaissance de glycanes de type galactose (Gal et GalNAc), où le groupement hydroxyle du carbone 4 est axial (Figure 27A) (Drickamer and Taylor 2015). Dans les deux cas, des carbonyles sont impliqués dans la formation de liaisons hydrogènes avec le monosaccharide spécifique et coordonnent également des liaisons avec le Ca2+.
Les lectines de types C font partie des PRRs (Pattern Recognition Receptors). Elles participent à la reconnaissance des agents étrangers et pathogènes. Elles permettent de reconnaître le non-soi par des motifs moléculaires conservés chez divers microorganismes appelés PAMPs (Pathogen Associated Molecular Patterns). Ces motifs sont généralement des molécules de surface (Lipopolysaccharides, flagelline, zymosan, ADN non méthylé) (Hemmi et al. 2000).
Ces lectines participent également à la reconnaissance de marqueurs du soi anormaux et endommagés, induits après une inflammation ou une transformation des cellules provoquées par un stress (Figure 28). Ces marqueurs sont appelés DAMPs (Damage-Associated-Molecular-Patterns) et leur reconnaissance par des lectines entraîne la mort cellulaire (Kawai and Akira 2010). Beaucoup de lectines de type-C sont exprimées à la surface des cellules présentatrices d’antigènes. Ce sont des cellules essentielles du système immunitaire qui permettent, via la présentation d’antigènes, la génération d’une réaction immunitaire, par l’activation de lymphocytes T, ou à l’inverse de leur inhibition par des mécanismes de tolérance. Les cellules dendritiques sont les principales CPAs, mais d’autres cellules ont cette fonction comme les macrophages et les lymphocytes B.

Table des matières

Introduction
1. LES THERAPIES CIBLEES
1.1. Les inhibiteurs
1.1.1. Les petites molécules inhibitrices des tyrosines kinases
1.1.2. Les protéines de fusion
1.1.3. Les anticorps
1.2. La libération ciblée de médicament
1.2.1. Les systèmes nano-porteurs
1.2.2. Les anticorps conjugués à des médicaments
1.3. Thérapie ciblée dans le cancer
1.3.1. Les peptides RGD et intégrines v3
1.3.2. Les récepteurs de folates
1.3.3. Les anticorps monoclonaux
2. LES GLYCOSYLATIONS
2.1. Caractéristiques des glycosylations
2.1.1. Les N-glycosylations
2.1.2. O-glycosylation
2.2. Altération des glycosylations
2.2.1. Conséquences des altérations des glycosylations dans les cancers
2.2.1.1. Interactions cellule-cellule
2.2.1.2. Interaction cellule-matrice extracellulaire
2.2.1.3. Métabolisme et signalisation
2.2.1.4. Interactions avec le système immunitaire
2.2.2. Les altérations sur les glycoprotéines
2.2.2.1. Altérations des N-glycosylations
2.2.2.2. La sialylation et la fucosylation
2.2.2.3. Altérations des O-glycosylations
2.2.2.3.1 L’antigène Sialyl Thomsen-nouveau
2.2.2.3.2 L’antigène Thomsen-nouveau
3. LECTINES
3.1. Les lectines chez l’Homme /mammifères.
3.2. Implication des lectines animales dans le cancer
3.3. Les lectines de type C
3.3.1. La MGL
3.3.2. Utilisation des lectines comme outils de reconnaissance et de ciblage des sucres
4. PROBLEMATIQUES
5. OBJECTIFS
Chapitre 1 : Ciblage des tumeurs humaines positives à l’antigène Tn avec la MGL
Chapitre 2 : Conception d’un nouvel outil de ciblage basé sur la MGL.
1. INTRODUCTION
1.1. Présentation des stratégies
2. MATERIELS ET METHODES
2.1. Partie ingénierie des protéines
2.1.1. Transformations des bactéries compétentes
2.1.2. Production de la MGL S-3G-CRDshort.
2.1.2.1. Surexpression périplasmique de la MGL S-3G-CRDshort
2.1.2.2. Production et purifications
2.1.2.3. Clivage de l’étiquette StrepTag II
2.1.3. Production de la MGL S-5G-CRDshort
2.1.3.1. Clonage (ajout de 2 glycines)
2.1.3.2. Production et purification de la MGL S-5G-CRDshort
2.1.4. Production de la MGL His-5G-CRDshort et MGL His-Ser-CRDshort
2.1.4.1. Clonage (changement de plasmide).
2.1.4.2. Clonage (changement de l’étiquette)
2.1.4.3. Surexpression de la MGL His-5G-CRDshort et de la MGL His-Ser-CRDshort
2.1.4.4. Production et purification de la MGL His-5G-CRDshort et de la MGL His-Ser-CRDsh
2.1.5. Production de la sortase A G1S
2.1.5.1. Clonage (Substitution de la glycine 1 par une sérine)
2.1.5.2. Surexpression de la sortase A G1S
2.1.5.3. Production et purification de la sortase A G1S
2.1.6. Caractérisations biochimiques des protéines
2.1.6.1. Gels SDS-PAGE
2.1.6.2. Détermination des concentrations protéiques
2.1.7. Caractérisation des interactions par SPR
2.2. Synthèse chimique des différents composés
2.2.1. Procédures générales
2.2.1.1. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
2.2.1.2. Procédure générale pour la synthèse peptidique sur phase solide
2.2.1.3. Procédure générale de clivage du peptide
2.2.1.4. Procédure générale de cyclisation peptidique
2.2.1.5. Procédure générale de coupure oxydative
2.2.1.6. Procédure générale de ligation oxime (LO)
2.2.1.7. Procédure générale de cycloaddition alkyne-azide catalysée par le Cuivre (CuAAC)
2.2.1.8. Procédure générale de greffage des fluorochromes
2.2.2. Synthèses des composés
2.2.2.1. Synthèse du Fmoc-Thr(OtBu)-depsiGly-OH 14
2.2.2.2. Synthèse du depsipeptide pour la réaction sortase 2
2.2.2.3. Synthèse d’un peptide fluorescent 1
2.2.2.4. Synthèse du RAFT-4(N3) 1 et 18
2.2.2.5. Synthèse du RAFT-(Depsipeptides)4-FITC 19
2.3. Réaction de couplage enzymatique par la sortase A
3. RESULTATS ET DISCUSSIONS
3.1. Optimisation de la production du CRD de la MGL
3.1.1. Expression périplasmique du CRD
3.1.2. Expression du CRD sous forme de corps d’inclusion
3.1.2.1. Traitement des corps d’inclusion
3.2. Etude de la fonctionnalité des outils d’assemblage
3.2.1. Validation du depsipeptide
3.2.2. Production de la sortase G1S
3.2.1. Validation du CRD et de la sortase A G1S
3.3. Construction du cluster de lectine par la première stratégie
3.4. Construction du cluster de lectine par la deuxième stratégie
3.4.1. Synthèse et purification de la MGL alcyne-CRD 6
3.4.2. Tests préliminaires d’assemblage du cluster
3.5. Construction du cluster de lectine par la troisième stratégie
3.5.1. Optimisation des conditions de coupure oxydative de la sérine N-terminale de la MGL CRDshort
3.5.2. Construction du cluster par liaison éther d’oxime
3.6. Production de cluster à plus grande échelle
3.6.1. Purification du cluster
3.6.2. Etude des affinités par SPR
4. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Chapitre 3 : Projets Annexes 1
1. RECONNAISSANCE DU NOYAU EXTERNE LOS DE LPS D’ESCHERICHIA COLI PAR MACROPHAGE GALACTOSE LECTINE HUMAINE.
2. STRATEGIE DE CIBLAGE HEPATIQUE AVEC DES NANO-PORTEUR DE LIPIDES : RECONNAISSANCE DE RECEPTEUR LECTINE ET ENDOCYTOSE HEPATOCYTAIRE.
Conclusion générale :
Bibliographies 1

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