Soutenance mémoire
Chronologie et principes généraux de l’antibiogramme par diffusion
Historique
Avant même l’ère des antibiotiques, plusieurs études ont montré qu’il existait, dans certaines conditions, une inhibition de la croissance bactérienne au sein de bouillons de culture. Ces premières observations datent de la fin du XIXème siècle et mettent en évidence pour la première fois le concept de l’antibiose. L’antibiose peut être définie comme une interaction biologique entre deux ou plusieurs organismes qui est délétère pour au moins l’un d’entre eux ou bien une association antagoniste entre un organisme et les substances métaboliques produites par un autre. En 1874, William Roberts observe qu’un milieu liquide dans lequel est présent Penicillium glaucum ne peut pas être facilement contaminé par des bactéries (1). Deux ans plus tard, John Tyndall fait une observation similaire (2). Il remarque alors que le bouillon de culture favorise la croissance de bactéries ou de moisissures mais qu’il est difficile d’obtenir une culture des deux simultanément. Bien que ces observations aient été significatives, elles n’ont pas permis d’établir des méthodologies pratiques prédictives permettant une quelconque utilisation clinique. Vingt ans plus tard, les travaux sur la pénicilline marquent le début d’une série d’événements qui a conduit au développement des tests in vitro que nous utilisons encore de nos jours. Rappelons que c’est en septembre 1928 qu’Alexander Fleming fait pour la première fois l’observation de l’effet inhibiteur de la pénicilline sur milieu solide (3). Il met alors en évidence une inhibition de la croissance des colonies de staphylocoques sur une gélose contaminée par un pénicillium. Dès le début des années 1920, Alexander Fleming utilisait déjà une méthode de caractérisation de l’efficacité de solutions antimicrobiennes, en quelque sorte une méthode précurseur de celle que nous connaissons aujourd’hui (4). Il utilise une gélose dans laquelle une tranchée avait été préalablement creusée. Dans ce fossé, il introduit une solution à tester et en déduit alors son activité antimicrobienne en fonction de la zone d’inhibition formée autour de la tranchée après son incubation. Quelques années après, cette technique a été modifiée par Reddish qui creusait directement dans la gélose des puits dans lesquels il plaçait une solution antimicrobienne à tester (5). En 1929, Fleming met au point une méthode de dilution en milieu liquide qui pose les bases de la méthode actuelle pour la détermination des concentrations minimales inhibitrices (CMI) (3.1). En 1940, plusieurs chercheurs ont proposé de nouvelles techniques pour évaluer l’activité d’antimicrobiens, en particulier Pope qui utilise pour la première fois du papier absorbant qu’il imprègne préalablement de solution antibactérienne pour évaluer la sensibilité d’une bactérie à un agent antimicrobien. L’année suivante, Abraham et al introduisent l’utilisation de cylindres placés sur la gélose et remplis de solution antimicrobienne (6). La solution antimicrobienne diffuse alors dans la gélose et des diamètres d’inhibition sont mesurés après une durée d’incubation appropriée. Ces cylindres ont été plusieurs fois renommés mais le terme « Oxford Cup » est le plus couramment retrouvé. D’autres méthodes en milieu liquide ont vu le jour les années suivantes, en particulier des méthodes utilisant le pH comme indicateur de sensibilité plutôt que la turbidité. Dans les années quarante, de nombreux progrès ont été réalisés et les disques imprégnés d’antibiotiques voient le jour d’abord avec la méthode de Mohs (7) qui sera améliorée plusieurs années après par la méthode de Stokes (8). A la fin de la Seconde Guerre mondiale, la pénicilline est utilisée pour traiter de nombreuses maladies infectieuses. La méthode de dilution en tube, les méthodes de diffusion en gélose à l’aide de disques ainsi que plusieurs techniques de dilution en gélose sont des méthodes acceptées pour prédire avec plus ou moins de précision la sensibilité à la pénicilline à la fin de cette période. De nombreuses autres molécules antibiotiques ont été mises sur le marché à cette époque ce qui a accru le besoin de prédire l’activité d’une molécule vis-à-vis d’un pathogène donné afin d’administrer le traitement le plus adapté.
En 1947, Bondi et al introduisent le disque de 6,5 millimètres imprégné d’antibiotiques que nous utilisons encore aujourd’hui (9). En 1952, Gould et Bowie mettent au point une méthode de diffusion sur gélose qui permet de tester sur une même gélose plusieurs concentrations d’un même antibiotique. En 1955, Stokes introduit la méthode qui porte son nom et qui a été utilisée pendant plusieurs années en Europe (8). Cette méthode permettait, sur une même gélose, de tester un organisme contrôle de la même espèce ou d’une espèce similaire à l’organisme à tester. Cette méthode a pour avantage que la souche contrôle et la souche à tester sont traitées dans les mêmes conditions (milieu, temps d’incubation, atmosphère, température et contenu du disque). L’organisme contrôle était inoculé sur une moitié de la boîte tandis que l’organisme à tester était ensemencé sur l’autre moitié. A l’interface des deux zones, des disques étaient posés. La sensibilité de la souche testée est déduite du diamètre de la souche contrôle. La souche est considérée comme sensible si la zone d’inhibition est de taille égale ou supérieure à celle de la souche contrôle. Dans le cas contraire, la souche est considérée comme résistante à l’antibiotique testé.
La méthode actuelle (1.4) a été proposée quelques années plus tard sur la base du travail de deux microbiologistes et leurs équipes. Elle a reçu le nom de ces deux chercheurs : la méthode de Kirby-Bauer (10). D’autres méthodes sont développées dans les années soixante que ce soit en milieu solide (modification de la charge des disques, etc.) ou en milieu liquide. En 1959, devant le nombre important de méthodes, la communauté scientifique et plusieurs organisations ont jugé nécessaire de normaliser les méthodes d’évaluation de la sensibilité aux antibiotiques. Ericsson et Steers ont commencé en 1959 et 1960 à comparer les différentes méthodes de réalisation des antibiogrammes puis en 1961 c’est au tour de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) de s’intéresser à la normalisation des techniques pour la réalisation des antibiogrammes. De nombreux progrès de normalisation sont réalisés jusqu’en 1975, année au cours de laquelle le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) a publié un document intitulé Antimicrobial Susceptibility Testing Standards permettant de standardiser les pratiques au sein des laboratoires (11). En 1975, l’apparition des méthodes automatisées marque un tournant dans l’histoire de l’antibiogramme. C’est la compagnie Pfizer Diagnostics qui développe le premier système automatisé pour la réalisation de l’antibiogramme, baptisé « Autobac Disk Elution System ». Cet automate permettait de fournir des résultats d’antibiogrammes dans la journée. Le principal écueil de cette machine est qu’elle ne comportait pas de système d’identification. L’identification du germe était obtenue le lendemain par les techniques habituelles. Ce système a été suivi par d’autres systèmes automatisés en milieu liquide commercialisés par Abbott et MacDonnell Douglas Corporation, ancêtres des technologies utilisées aujourd’hui (Vitek2®, Phoenix®, etc.).
Dans les années quatre-vingt-dix, les laboratoires de microbiologie ont à leur disposition plusieurs techniques pour la réalisation des antibiogrammes : les méthodes automatisées et les méthodes manuelles notamment les méthodes de diffusion en gélose. Ces dernières ont su conserver leur utilité malgré les nombreuses critiques (main d’œuvre, durée, etc.) car ce sont des méthodes économiques et extrêmement flexibles par rapport à tous les autres systèmes automatisés .
Automatisation en bactériologie
La complexité des étapes de l’analyse bactériologique (examen macroscopique, microscopique, ensemencement, identification, étude de la sensibilité aux antibiotiques, biologie moléculaire, etc.), la variété d’échantillons à traiter et le volume moins important de prélèvements en bactériologie par rapport aux secteurs de biochimie ou d’hématologie ont ralenti la commercialisation de systèmes intégrés en bactériologie. Mais la pression économique importante, l’augmentation du nombre d’analyses à réaliser et l’obligation de l’accréditation avec toutes les contraintes qui en découlent ont conduit de nombreux laboratoires de biologie médicale en France à se regrouper. Il s’en suit la mise en place d’importants plateaux techniques permettant le traitement de plusieurs milliers d’analyses par jour. Afin de répondre aux exigences de qualité et gagner en productivité, en particulier pour des tâches répétitives, le recours à des automates de plus en plus perfectionnés a été nécessaire. Il est certain que l’automatisation a de nombreux avantages :
• Augmentation de la productivité :
o Automatisation de tâches répétitives : réception des prélèvements, ensemencement, incubation, lecture des cultures ;
o Optimisation du temps de travail du personnel.
• Facilitation de l’accréditation :
o Diminution de la variabilité inter-opérateurs ;
o Diminution des erreurs (oubli d’ensemencement, erreur d’identité, etc.) ;
o Traçabilité complète.
• Impact clinique :
o Travail 24h/24 possible : diminution de la durée de rendu des résultats permettant une optimisation des thérapeutiques, une diminution de la durée d’hospitalisation et une diminution des coûts (12). D’après Eveillard et al, une activité 24h/24 permet de réduire de 24 à 48 heures le délai de rendu des résultats permettant ainsi la mise en place d’un traitement antibiotique précoce et adapté dans 22,7% des cas (n = 97) et une réduction du spectre d’une antibiothérapie déjà initiée dans 5,3% des cas (n = 23) .
Automatisation de l’antibiogramme par diffusion
Comme nous l’avons évoqué précédemment, l’automatisation de l’antibiogramme remonte aux années 1980. Il s’agit alors de technologies permettant la réalisation d’un antibiogramme en milieu liquide. En ce qui concerne l’antibiogramme par diffusion, l’automatisation débute à la fin du XXème siècle avec l’apparition de systèmes de lecture automatisés. L’automatisation quasi-complète de la méthode d’antibiogramme en milieu gélosé par diffusion est récente. Plusieurs automates sont maintenant disponibles sur le marché, BD offre une solution d’automatisation complète avec ses automates de la gamme Kiestra®, BioMérieux distribue en France l’automate WASP® fabriqué par COPAN et enfin I2a commercialise le PreLUD® , automate ensemenceur qui permet également la dépose des disques sur les géloses. Toutes ces solutions permettent un rendement important associé à une traçabilité complète du processus, avantage indiscutable dans l’ère de l’accréditation .
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Table des matières
Introduction
1. Chronologie et principes généraux de l’antibiogramme par diffusion
1.1. Historique
1.2. Automatisation en bactériologie
1.3. Automatisation de l’antibiogramme par diffusion
1.4. Principe de la méthode : définition d’un antibiogramme par diffusion
2. Facteurs influençant le résultat : paramètres techniques critiques
2.1. Maîtrise de l’inoculum
2.2. Choix de la gélose
2.3. Ensemencement
2.4. Disques antibiotiques
2.5. Maîtrise du temps technique
2.6. Durée d’incubation
2.7. Lecture de l’antibiogramme
Lecture manuelle et recommandations
Lecture automatisée
3. Les bases de l’interprétation de l’antibiogramme
3.1. Concentration Minimale Inhibitrice (CMI) et Concentration Minimale Bactéricide (CMB)
3.2. Concentrations critiques
Historique
Approche microbiologique : concentrations critiques « épidémiologiques » ou cut-off épidémiologiques ou ECOFF
Approche clinique : concentrations critiques cliniques ou « clinical breakpoints »
Catégorisation en l’absence de concentrations critiques cliniques
Imprécision du diamètre mesuré
Incertitude de mesure : zone d’incertitude technique
4. Maîtrise de la qualité selon la norme NF EN ISO 15189
4.1. Processus d’accréditation
4.2. Vérification/validation de méthodes
Objectifs
Matériels et méthodes
1. Présentation des méthodes à valider
2. Adaptation de la méthode de réalisation des antibiogrammes à partir de fioles d’hémoculture positives
3. Essais à réaliser dans le cadre de la validation des performances de la méthode
3.1. Fidélité
3.2. Fidélité intermédiaire (reproductibilité intra-laboratoire)
3.3. Exactitude
3.4. Robustesse
Essai de stabilité de l’inoculum
Durée de stabilité des cartouches antibiotiques
3.5. Comparaisons de méthodes
Comparaison de la méthode automatisée à la méthode manuelle à partir d’une culture pure
Antibiogrammes à partir de fioles d’hémoculture positives
Comparaison des méthodes de lecture
3.6. Analyse des risques
4. Analyse de l’activité des PreLUD® préalablement à la mise en place de la méthode automatisée
Résultats
1. Adaptation de la méthode des antibiogrammes à partir de fioles d’hémoculture positives
2. Validation des performances de la méthode
2.1. Fidélité
2.2. Fidélité intermédiaire (reproductibilité intra-laboratoire)
2.3. Robustesse
Essai de stabilité de l’inoculum
Durée de stabilité des cartouches antibiotiques
2.4. Comparaisons de méthodes
Méthode automatisée – inoculum réalisé avec le dispositif Inoclic®
Méthode automatisée à partir d’une fiole d’hémoculture positive
Lecture automatisée par SIRscan®
2.5. Analyse des risques
3. Analyse de l’activité des PreLUD® préalablement à la mise en place de la méthode automatisée
Discussion
Conclusion
Bibliographie
Annexes
