Chromatographie sur Couche Mince ou CCM

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Chromatographie sur Couche Mince ou CCM

Principe

La chromatographie est une technique de séparation dans laquelle les solutés se répartissent dans deux phases, la phase stationnaire et la phase mobile, selon leur affinité (18).
La CCM en fait partie. Dans la CCM, la phase stationnaire est constituée d’un matériau approprié, et est répandue en une couche mince uniforme sur un support de verre, de métal ou de plastique. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants (18). L’analyse CCM est appréciée dans divers domaines (19):
− Chimique et médical : détection des produits illicites (contrefaçons), contrôles qualité et pureté pharmaceutique et cosmétique ;
− Alimentation humaine et animale : additifs alimentaires, contrôle qualité…
− Environnement : analyse des eaux, des sols, des extraits de plantes.
Les échantillons à analyser sont dissous dans un solvant et déposés sous des volumes de l’ordre de microlitre sur la plaque. La plaque ainsi préparée est introduite dans une cuve à couvercle étanche, au fond de laquelle se trouve le solvant de migration (ou la phase mobile). La phase mobile migre de façon ascendante le long de la phase stationnaire, et la migration est arrêtée lorsque le front du solvant est à 1 cm du bord supérieur de la plaque. Les différents constituants de l’échantillon, entrainés par la phase mobile migrent plus ou moins haut sur la plaque selon leur affinité pour les deux phases, et occupent une position appelée référence frontale (Rf) pour des conditions chromatographiques bien définies (20)(21).
La séparation repose sur les mécanismes d’adsorption, de partage ou d’échanges d’ions ou sur les combinaisons de ces mécanismes.

Comparaison de CCM classique et CCMHP

En plus des avantages de la CCM classique à savoir la simplicité, les résultats visuels et rapides, la possibilité de faire l’analyse de plusieurs échantillons en parallèle, la détection et l’identification multiple (23), la CCMHP permet une meilleure résolution dans la séparation, et une meilleure précision (autospotteur automatique). De plus, la CCMHP permet à la fois des analyses qualitative et quantitative grâce au détecteur UV-densitométrique utilisé. Par contre, elle nécessiteun appareillage couteux.
La CCMHP couplée au détecteur UV-densitométrique teslargement utilisée pour le contrôle de qualité des plantes.

Validation d’une méthode(23)(24)(25)

Le but d’une procédure analytique quantitative est de pouvoir quantifier le plus exactement possible chacune des quantités que le laboratoire aura à déterminer. L’objectif de la validation est de donner au laboratoire ainsi qu’aux autorités compétentes les garanties que chaque mesure qui sera réalisée en routine, une fois que la méthode est validée, sera suffisamment proche dela valeur inconnue de l’échantillon ou du moins comprise entre une limite acceptable, en fonction de la finalité de la procédure. Les différentes réglementations relatives aux bonnes pratiques (BPL, BPF et autres…) ainsi que les documents normatifs ou régle mentaires (ISO, FDA) suggèrent que toutes les procédures de dosage répondent à descritères d’acceptabilité pour assurer la validité de la méthode
Lors de la validation d’une méthode analytique quantitative, les critères suivants sont à étudier :
− La stabilité,
− La spécificité/ sélectivité,
− Le standard de calibration,
− Le standard de validation,
− La fidélité,
− La justesse ou biais,
− L’exactitude et le profil d’exactitude,
− La limite de détection,
− La limite de quantification,
− La fonction de réponse,
− La linéarité,
− L’intervalle de mesures,
− Le rendement d’extraction.

Stabilité

C’est une phase de prévalidation de la méthode analytique qui consiste à vérifier la stabilité des substances à analyser dans les conditions expérimentales décrites.

Spécificité/sélectivité

La spécificité d’une méthode analytique est définiecomme étant la capacité de celle-ci à établir de manière sans équivoque l’existence de lasubstance à analyser en présence d’autres composants. C’est la propriété d’une méthode de convenir exclusivement à la caractéristique de l’analyte, avec la garantie que le résultat de l’analyse ne provient que de l’analyte.

Standard de calibration

C’est le produit de référence pur utilisé pour établir cinq points de gamme de la droite d’étalonnage.

Standard de validation

C’est l’échantillon reconstitué dont la concentration en analyte est connue.
Les standards de validation sont utilisés pour vérif er l’effet matrice et pour évaluer l’exactitude et la linéarité de la méthode à étudier.
Le standard de validation représente l’échantillonque le laboratoire analyse durant la phase de validation.

Fidélité

C’est l’étroitesse de l’accord entre une série de mesures obtenues à partir de plusieurs prises d’essai provenant d’un même échantillon homogène dans des conditions expérimentales prescrites. La fidélité fournit desindications sur les mesures liées au hasard. Elle traduit uniquement la distribution des erreurs et n’a aucune relation avec la vraie valeur.
Elle peut être évaluée à 3 niveaux: la répétabilité, la fidélité intermédiaire, et la reproductibilité.
− Répétabilité
C’est la fidélité obtenue dans des conditions expérimentales identiques (même opérateur, même appareil, même échantillon,…). Lesanalyses sont faites dans un court intervalle de temps.
− Fidélité intermédiaire
Elle exprime la fidélité sous des conditions variables à l’intérieur d’un même laboratoire (opérateurs différents, même appareil, même échantillon, conditions expérimentales identiques).
− Reproductibilité
Elle exprime la fidélité sous des conditions variables dans un autre laboratoire (opérateurs différents, appareils différents, mêmeéchantillon, conditions expérimentales identiques).

Justesse

La justesse exprime l’étroitesse de l’accord entre la valeur moyenne obtenue à partir d’une série de résultats d’essais et la valeur quiest acceptée comme vraie valeur.

Exactitude

C’est l’étroitesse de l’accord entre le résultat d’essai et la valeur de référence acceptée.
L’exactitude est l’expression de la somme de la jus tesse et de la fidélité.
L’ICH recommande d’évaluer l’exactitude sur une base d’au moins 9 déterminations avec au minimum 3 concentrations différentes (exemple : 3 concentrations avec 3 répétitions pour chaque concentration). Elle est généralement menée au centre du domaine étudié.
L’exactitude est exprimée en termes de recouvrement d’une quantité (%) connue de substance ajoutée à l’échantillon ou en termes de différence entre la moyenne obtenue et la valeur conventionnellement vraie.

Linéarité

La linéarité d’une méthode d’analyse est sa capacité à l’intérieur d’un intervalle donné, de fournir des résultats directement proportionnels à la quantité de substance présente dans l’échantillon. Elle doit être démontrée dans’intervalle de mesure de la procédure analytique.
La linéarité est évaluée entre les deux niveaux deconcentrations préparés et est déterminée à partir de la courbe représentative dela relation : quantité calculée = f (quantité introduite)

Limite de détection (LD)

C’est la plus petite quantité de la substance considérée qui peut être détectée dans un échantillon mais sans forcément pouvoir être quantifiée de façon exacte dans les conditions expérimentales décrites.

Limite de quantification (LQ)

La limite de quantification d’une méthode d’analyse est la plus petite quantité de la substance considérée qui peut être quantifiée dansun échantillon avec une exactitude connue, dans les conditions expérimentales décrites.
Sur le plan pratique, la détermination de la limite de détection et de la limite de quantification est effectuée à partir du calcul du rapport signal/bruit dont la formule est comme suit, selon la Pharmacopée Européenne:
H : hauteur du pic de la substance analysée
h : amplitude du signal du bruit de fond
S : Signal
N : Bruit
La concentration qui donne S/N = 3 est la LD, tandis que la concentration qui donne S/N = 10, est la LQ (18).

Intervalle de mesures

L’intervalle de mesure d’une méthode d’analyse est l’intervalle entre les concentrations minimale et maximale de la substance considérée, à l’intérieur de laquelle il a été démontré que la fidélité, l’exactitude et la linéarité satisfont aux spécifications de la méthode.
· Fonction de réponse
C’est la relation qui existe, à l’intérieur de l’in tervalle de mesure, entre la réponse (le signal) et la concentration introduite (quantité) en substance à examiner dans l’échantillon.
La fonction de réponse qui exprime cette relation est appelée courbe d’étalonnage.
Différents modèles d’étalonnage peuvent être utilisé pour cette fonction de réponse.
· Rendement d’extraction
Le rendement d’extraction doit être évalué dans lecas d’une procédure analytique quantitative contenant une étape d’extraction préalable.
Cette étape consiste au dosage de la teneur de la ubstance obtenue à partir d’une extraction de la drogue végétale. Le calcul de rendement permet de savoir quel type d’extraction donne le rendement optimal. Ce type d’ extraction sera utilisé dans la suite de l’étude.

Table des matières

I. INTRODUCTION
II. GENERALITES
II.1. DEFINITIONS
· Pharmacopée
· Pharmacopée traditionnelle
· Monographie d’usage
· Médecine traditionnelle
· Plantes médicinales
· Drogues végétales
· Phytothérapie
II.2. CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE OU CCM
· Principe 5
· Comparaison de CCM classique et CCMHP
II.3. VALIDATION D’UNE METHODE
· Stabilité
· Spécificité/sélectivité
· Standard de calibration
· Standard de validation
· Fidélité
· Justesse
· Exactitude
· Linéarité
· Limite de détection
· Limite de quantification (LQ)
· Intervalle de mesures
· Fonction de réponse
· Rendement d’extraction
II.4. BOTANIQUE DE APHLOIA THEIFORMIS
· Position systématique
· Description botanique
· Ethnobotanique et utilisations traditionnelles
· Chimie des principaux constituants
II.5. MANGIFERINE
· Structure
· Biosynthèse de la mangiférine
· Caracteristiques physiques
· Activités biologiques connues
III. MATERIELS ET METHODES
III.1. MATERIELS
· Matériel végétal
· Matériel de laboratoire
· Solvants et produits de référence
III.2. METHODES
· Extraction
· Préparation des échantillons
· Chromatographie CCMHP
· Limite de détection et limite de quantification
· Statistique
IV. RESULTATS ET COMMENTAIRES
IV.1. STABILITE
IV.2. RENDEMENT D’EXTRACTION
IV.3. LIMITE DE DETECTION ET LIMITE DE QUANTIFICATION
IV.4. SPECIFICITE
IV.5. JUSTESSE
IV.6. FIDELITE
IV.7. EXACTITUDE
IV.8. FONCTION DE REPONSE
IV.9. LINEARITE
IV.10. INTERVALLE DE MESURES
V. DISCUSSION
V.1. RENDEMENT D’EXTRACTION
V.2. LIMITE DE DETECTION ET LIMITE DE QUANTIFICATION
V.3. SPECIFICITE ET SELECTIVITE
V.4. JUSTESSE, FIDELITE ET EXACTITUDE
V.5. LINEARITE
VI. CONCLUSION ET PERSPECTIVES
ANNEXES
BIBLIOGRAPHIE
WEBOGRAPHIE

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