Chromatographie liquide haute performance

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Gélification

La formation du gel n’est pas un phénomène instantané : elle est précédée d’une période de latence qui correspond à la formation du noyau de cristallisation des molécules désoxygénées d’hémoglobine S qui s’agrègent selon une cinétique dépendant de leur concentration. Les conditions physico-chimiques favorables à la gélification sont :
– La concentration en hémoglobine S, c’est le paramètre le plus important, il existe ainsi une « concentration minimale de gélification » (CMG) à partir de laquelle peut s’effectuer la réaction de polymérisation. Pour la désoxyhémoglobine S pure, elle est de 24 g/dL à 20 °C.
– Le niveau de désaturation en oxygène est également un facteur déterminant puisque la forme oxygénée de l’hémoglobine S reste parfaitement soluble ;
– L’acidité du milieu intérieur ;
– Une concentration élevée de 2,3-diphosphoglycétate (2,3-DPG) ;
– L’élévation de la température entre 10 °C et 25 °C ;
– Une concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine élevée (MAIER et al, 2004).

Falciformation et protéine d’adhérence

Les polymères d’HbS se lient à la face interne de la membrane érythrocytaire, créant ainsi un enchevêtrement responsable de déformation du GR qui prend un aspect en faucille : c’est le phénomène de la falciformation (SOUDRE, 2008).
La mise en évidence, ces dernières années d’une adhésivité anormale du GR drépanocytaire à l’endothélium vasculaire a constitué une avancée importante dans la compréhension du mécanisme de la vaso-occlusion. Cette forte adhésivité à l’endothélium activé réduirait le temps de passage des globules rouges drépanocytaires dans les micro-vaisseaux avec pour résultante le ralentissement du flux sanguin favorisant la falciformation des globules rouges dans un environnement hypoxique et précipitant ainsi la vaso-occlusion. Cette adhésivité anormale concerne essentiellement les globules rouges immatures en occurrence des réticulocytes de stress libérés dans la circulation en réponse à l’anémie, plus que les globines rouges matures précocement « vieillis » déshydratés et rigides qui sont piégés dans un second temps. Ces réticulocytes de stress expriment encore à leur surface des protéines d’adhérences, comme verylate antigen-4 (VLA 4) et CD36 (glycoprotéine) qui normalement les accrochent au stroma médullaire. VLA-4 reconnait la proteine vascularcell adhesion molecule1(VCAM 1) comme partenaire dans la surface des cellules endothéliales activées ; CD36 érytrocytaire se lie à une molécule de CD36 endothéliale par l’intermédiaire de la thrombospondine (TSP). Plus récemment d’autres protéines dont l’expression n’est pas restreinte au réticulocyte ont été impliquées ; en particulier lutheranblood group/basal cell adhesion molecule (lu/BACAM) sur le GR partenaire de la laminine alpha 5 sous endothéliale et intercellular cell adhesion molecule 4(ICAM 4) capable de se lier à plusieurs intégrines particulièrement alphaV beta3. Mentionnons encore l’implication probable d’autres constituants membranaires du GR (CD47 et protéine bande3 phosphatidylsérine glycolipide sulfaté) ou plasmatique (TSP facteur de vonwillebranb, fibrinogéne fibronectine) (ODIENE et al 2009).

Manifestations cliniques et biologiques

Signes cliniques

La drépanocytose résulte d’une anomalie du globule rouge, elle est essentiellement un trouble multi systémique, ce qui affecte presque tous les systèmes d’organes du corps. Les conséquences cliniques peuvent être divisées en quatre groupes : l’hémolyse les complications hématologiques, les crises vaso-occlusives, une infection et un dysfonctionnement des organes (MAKANI, 2013).

Chez l’homozygote SS

Phase critique ou de crise

Elle est caractérisée par la survenue de crises vaso-occlusives. C’est la manifestation la plus fréquente et essentiellement représentée par la douleur. Le début d’apparition de la douleur remonte autour de 6 mois à l’enfance. La douleur traitée ou non, dure une heure à 6 jours avec une moyenne de 3 à 4 jours. La période d’accalmie relative sera interrompue au bout d’un temps variable par une nouvelle crise. La douleur est caractéristique de la drépanocytose.
Le siège de la douleur est variable selon l’âge :
• Chez le nourrisson ; la douleur réalise le “syndrome pied main” (hand foot syndrome). C’est une nécrose ischémique des petits os des mains et des pieds qui s’accompagnent d’une tuméfaction douloureuse des parties molles du dos des mains, des pieds dans un contexte fébrile.
• Chez les enfants et les adolescents ; la douleur est abdominale ou ostéoarticulaire. Les douleurs sont provoquées par des infarctus viscéraux (mésentère, rate, foie) et sont souvent accompagnées de fièvre.
• Chez l’adulte, la douleur est ostéoarticulaire et siège au niveau des os longs, du thorax et du bassin (SERJEANT, 2001).

Phase inter critique

Elle est caractérisée par la triade de Chauffard qui associe une anémie, un ictère, une splénomégalie. L’expression de l’anémie hémolytique chronique est une manifestation constante et précoce de la drépanocytose.
L’ictère cutanéo muqueux de type hémolytique est caractérisé par des urines foncées non mousseuses et des selles de couleur normale.
La splénomégalie est fréquente chez le nourrisson et le jeune enfant. Son volume va diminuer progressivement au cours des années pour disparaître dans la plupart du temps au-delà de l’âge de 5 ans.
L’aspect général de l’enfant mal suivi est dysmorphique, le corps est longiligne, les extrémités effilées, la tête est volumineuse. Il s’y associe souvent un retard staturo-pondéral et un retard pubertaire (NGOM, 2016).

Chez l’hétérozygote AS

Chez l’hétérozygote, la maladie est pratiquement asymptomatique sauf dans certaines zones où le climat est propice à déclencher des crises. On observe que de rares thromboses lors d’hypo-oxygénation profonde (anesthésie ; voyage en avion pressurisé ; augmentation de la température…). Elles peuvent se révéler par une hématurie. Lorsqu’il existe une anémie, même si elle est hémolytique, il faut rechercher systématiquement une autre cause. Chez l’enfant le trait drépanocytaire ne s’exprime pas ou très peu. Les manifestations vaso-occlusives sont rares chez le nourrisson mais possibles chez l’enfant, l’adolescent, et l’adulte sous l’influence des facteurs importants d’anoxie : infections, séjours en altitude, froid (BERNARD, 1998).

Signes biologiques

Chez l’homozygote

La drépanocytose homozygote est caractérisée par un taux d’hémoglobine situé entre 7 et 9 g/dL, une réticulocytose entre 200 et 600 000/mm³, un volume globulaire moyen normal, la présence constante sur le frottis sanguin de drépanocytes, une hyperleucocytose à polynucléaires neutrophiles pouvant atteindre 30 000/mm³ sans infection et une tendance à la thrombocytose. L’électrophorèse de l’hémoglobine met en évidence la présence d’hémoglobines S, F et A2; il n’y a pas d’hémoglobine A (LEYE, 2017).

Chez l’hétérozygote

Les caractéristiques hématimétriques du sang périphérique des patients drépanocytaires hétérozygotes sont identiques à celle du sang normal. Tant en ce qui concerne la lignée érythrocytaire que les lignées leucocytaire et plaquettaire. La morphologie des hématies est normale et il n’y a pas de drépanocytes en circulation. Cependant, lorsque les hématies sont incubées dans un milieu privé d’oxygène (test d’Emmel), le phénomène de falciformation se manifeste et fait apparaître des drépanocytes.
Une microcytose constatée chez un drépanocytaire hétérozygote doit faire penser à une carence martiale ; une macrocytose doit suggérer une carence vitaminique, notamment en acide folique ou en vitamine B12.
L’électrophorèse de l’hémoglobine montre une fraction majeure d’hémoglobine A de 55 à 60%, une fraction importante d’hémoglobine S de 40 à 45% et enfin un constituant mineur d’hémoglobine A2 de 2 à 3%. Cet état doit être différencié du sujet drépanocytaire homozygote transfusé ; dans cette situation, l’hémoglobine A du donneur disparaît du tracé électro phorétique dans les semaines qui suivent la transfusion (LEYE, 2017).

Complications de la drépanocytose

Complications aigue

Complications vaso-occlusives graves

Ces crises sont dues à la mauvaise irrigation en sang de certains organes, se manifestent par des douleurs vives et brutales dans certaines parties du corps et peuvent à la longue entrainer la destruction de certains organes ou parties d’organe (c’est ce qu’on appelle la nécrose). Ces douleurs sont les manifestations les plus fréquentes de la maladie : elles peuvent être soudaines (ou aigues) et transitoires (dure quelques heures ou quelques jours) ou chroniques (dure plusieurs semaines). Il arrive que les deux types de crises cohabitent chez un même individu (douleur chronique à la laquelle s’ajoute des crises brutales). Elles sont favorisées par la déshydratation, c’est pourquoi il est recommandé de boire beaucoup d’eau mais elles aussi favorisées par le froid, l’altitude, le stress, les efforts excessifs, les infections… (Orphanet, 2011).

Complications infectieuses

La fragilité aux infections est une caractéristique de la maladie drépanocytaire. Elle est due à une baisse de la dynamique immunologique liée à l’asplénie fonctionnelle. Les infections sont très fréquentes chez les nouveaux nés et les enfants, et constituent la 1ère cause de mortalité de ces derniers. Chez les adultes les infections sont la 2ème cause de mortalité après les crises vaso-occlusives.
Ces infections sont principalement dues : aux pneumocoques, aux salmonelles, à Haemophilus influenzae et elles ont tendance à se généraliser et à entraîner des septicémies.
Via la fièvre, l’hypoxie et la déshydratation qu’elles entrainent, les infections sont également responsables du déclenchement des crises vaso-occlusives (CARBONI, 2009).

Complication anémique

La valeur de la concentration en hémoglobine en phase stationnaire est stable et différente d’un patient à l’autre. Elle représente un paramètre important. Elle est généralement comprise entre 7 g/dL et 9 g/dL, avec une réticulocytose élevée. Cependant, l’anémie peut s’aggraver dans certaines circonstances, notamment infectieuses.
Les crises de séquestration splénique sont bien particulières aux petits enfants de moins de 4 ans, et intéresse surtout les patients ayant à l’état basal une concentration élevée en hémoglobine (SYLLA, 2013).

Complications chroniques

Ulcère de jambe

Les patients drépanocytaires homozygotes SS porteurs d’ulcères de jambe ont une morbidité élevée. L’insuffisance veineuse, bien que de physiopathologie mal connue chez les drépanocytaires SS, est plus fréquente dans cette population, néanmoins, le rôle de l’insuffisance veineuse dans les ulcères chroniques des patients drépanocytaires SS porteurs d’ulcères n’est, à ce jour, pas évalué.

Complication rénale

L’atteinte rénale évolue vers une anomalie globulaire (protéinurie et syndrome néphrotique).

Complication ostéoarticulaire

La complication la plus fréquente chez l’adulte reste la nécrose épiphysaire. Cette complication intéresse surtout des têtes fémorales (hanche) ou humérales (épaule).
Les nécroses de l’épaule sont généralement soumises à un traitement par kinésithérapie. Quant à la nécrose de la hanche, au début elle est insidieuse, progressive et le plus souvent peu douloureuse (DIAGNE, et al 1999).

Diagnostic biologique de la drépanocytose

Test d’orientation

Test d’Emmel ou de falciformation

Le principe de ce test in vitro, est l’apparition de la déformation en faucille des hématies contenant l’hémoglobine S lorsqu’elles sont privées d’oxygène.
Il consiste à placer une goutte de sang entre lame et lamelle, plus une goutte de méta bisulfite de sodium et recouvrir les bords de paraffine ou de vaseline entre lame et lamelle pour empêcher l’entrée d’air, puis lire au microscope après 10 à 15 minutes.
L’atmosphère désoxygénée provoque la falciformation des hématies.
Ce test permet la mise en évidence au laboratoire de la présence d’hémoglobine S dans les hématies (DIALLO, 2015).

Test d’Itano ou test de solubilité

Il repose sur la mise en évidence in vitro de la polymérisation de l’hémoglobine S. Il s’agit donc de la recherche de l’insolubilité de l’hémoglobine dans un milieu phosphate réducteur. En effet, le test de solubilité consiste à désoxygéner une solution diluée de l’hémoglobine dont l’activité est fortement accrue par une solution tampon phosphate de force ionique élevée.
En présence de l’hémoglobine S et à température ambiante un trouble apparaît, ce dernier correspondant à un précipité d’hémoglobine.
Ce test est plus rapide (lecture en 5 min), plus précis et plus spécifique que le test de falciformation (DIALLO, 2015).

Test d’identification

Electrophorèse de l’hémoglobine

L’électrophorèse de l’hémoglobine permet de poser le diagnostic en mettant en évidence la présence d’une fraction de l’hémoglobine de migration. Cette hémoglobine de migration est différente de l’hémoglobine normale. Elle permet également de distinguer les formes homozygotes des formes hétérozygotes, et de découvrir la présence éventuelle d’une autre anomalie de l’hémoglobine associée (autre mutation ou thalassémie).
En effet, l’électrophorèse de l’hémoglobine permet d’obtenir une séparation des différentes hémoglobines selon leur charge électrique et leur poids moléculaire. Cette séparation peut être pratiquée
• sur acétate de cellulose en milieu alcalin, pH 8,6 c’est la technique la plus utilisée.
• sur gel d’agarose en milieu acide, pH 6,2 et permet de confirmer certaines hémoglobines anormales, en particulier lorsqu’on sépare les HbS, HbD, HbC et HbE.
Le diagnostic de la drépanocytose est confirmé par la présence majoritaire d’hémoglobine S. Chez le sujet hétérozygote le taux de S est inférieur à 30 %. L’hémoglobine normale adulte est composée d’hémoglobine A en grande majorité avec un taux d’hémoglobine A2 inférieur à 3,5 %.
Le sujet drépanocytaire ne possède pas d’hémoglobine A. Mais il existe un taux variable d’hémoglobine F. En revanche, chez le sujet normal, l’hémoglobine F ou hémoglobine fœtale, est présente en grande quantité à la naissance et le taux diminue progressivement pour disparaître vers l’âge d’un an.
Chez certains malades, lorsque deux mutations sont associées il s’agit d’un double hétérozygote (exemple SC où l’électrophorèse de l’hémoglobine montre deux bandes d’intensité égale migrant au niveau des hémoglobines S et C) (SOUBEIGA, 2013).

Chromatographie liquide haute performance

C’est une étape indispensable pour préciser le diagnostic des syndromes drépanocytaires. Très sensible et très spécifique, cette technique permet la séparation d’un très grand nombre d’hémoglobines, par échange sur des résines cationique. De plus les différentes fractions HbA, HbA2, HbF, et HbS, présentent même à de faibles taux, peuvent être quantifies (DIOUF, 2016).

Traitement de la drépanocytose

Le traitement de la maladie est symptomatique et non étiologique en général. Cependant Il y’a la greffe de la moelle osseuse, très délicate, qui est envisageable lorsque le patient est exposé à des risques de complications graves malgré les soins intensifs.

Mesures préventives

Réhydratation

C’est une consigne simple d’hygiène de vie qui doit être expliquée dans les premiers mois de la vie et qui est applicable à tout âge.
Les patients étant souvent déshydratés, une hydratation efficace par voie veineuse est nécessaire jusqu’à la fin de la crise.
Sérum physiologique 1 L, puis Glucosé 5% avec NaCl et KCl en fonction du ionogramme sanguin sans dépasser 2 L/jour par voie IV.
Une hydratation abondante doit encore être majorée en cas d’effort sportif, de réchauffement du climat, d’infection concomitante. Afin d’éviter le déclenchement des crises vaso-oclusives (TALL, 2011).

Supplémention en acide folique

La posologie de 5 mg/J permet de prévenir la carence en folate entrainant une activité intense médullaire liée à l’hyperhémolyse (LOBE et al 2013).

Vaccination

Ce sont des vaccins anti infectieux et non anti parasitaires en plus des vaccins usuels (vaccins du Programme Elargi de Vaccination), d’autres vaccins doivent être administrés. Il s’agit des vaccins anti-pneumococcique, anti-Haemophilus influenzae, anti-salmonelle et anti- meningococcique (LOBE et al 2013).

Prise en charge des complications aigues

Traitement des crises vaso-occlusives aigues

Une hydratation abondante est recommandée dès la survenue d’une crise douloureuse. Une prise d’antalgiques en ambulatoire est indiquée, selon l’intensité des douleurs. L’OMS a défini trois paliers dans la prescription des antalgiques pour le traitement des douleurs.
• Palier 1 Les antalgiques qui font partie de ce palier sont le paracétamol (15 à 30 mg/kg à renouveler) et les anti inflammatoires non stéroïdiens (AINS) dont on pourra citer l’ibuprofène, le kétoprofène et le diclofénac
• Palier 2 Dans ce palier, nous avons une association de paracétamol et de codéine (Association de 500 mg de paracétamol minimum et de 30 mg de codéine 1-2 cp /4-6 h). En dehors de cette association nous avons le tramadol (50 mg ; 1-2 cp/ 4-6 h).
• Palier 3 Dans ce palier on retrouve la morphine. Pour les douleurs abdominales, le phloroglucinol en lyophilisat oral et/ou le tiémonium sont recommandés (HAS 2010).
• Il existe d’autres médicaments en développement decitabine, NO, trichostatin, butyrate utilisé pour prévenir les crises vaso-oclusives (KENNETH, 2009).

Priapisme

Il est défini par une érection prolongée et douloureuse, survenant en plein sommeil ou au réveil est une complication fréquente. Son mécanisme est l’obstruction des corps caverneux par les globules rouges falciformes, l’ischémie expliquant l’érection douloureuse on distingue le priapisme intermittent qui dure quelques minutes à l’heure spontanément résolutif et le priapisme aigue il peut durer plus de 3 h avec risque d’impuissance définitive (BACHIR, 2015). En cas d’hydratation, on utilise un antalgique (paracétamol).
Le priapisme est une urgence fonctionnelle s’il dure moins de 3 heures. On effectue une injection intra-caverneuse d’un alpha-agoniste de type étiléfrine (Effortil®).
S’il dure depuis plus de 3 heures on effectue un drainage sans lavage sous anesthésie locale jusqu’à obtention de sang rouge plus injection intra-caverneuse d’étiléfrine (BACHIR, 2015)

Anémie aigue

La transfusion sanguine est nécessaire si :
• le taux d’hémoglobine est inférieur à cinq gramme par décilitre (5 g/dL)
• en cas d’hyper hémolyse aiguë la séquestration splénique aiguë urgence absolue, met en jeu le pronostic vital, transfusions en urgence ; après la deuxième épisode, programme transfusionnel et splénectomie à discuter après l’âge de 2 ans (risque de thrombose porte).
• érythroblastopénie aiguë liée au parvovirus B19, épisode transitoire de 7 à 10 jours : transfusions à répéter si nécessaire (AUBRY, 2016)

Complications infectieuses

Un traitement d’antibiotique probable des infections microbiennes, en attente des résultats des cultures si elles sont pratiquées, traitement bactéricide actif en particulier sur les pneumocoques de sensibilité diminuée à la pénicilline, sur Haemophilus influenza et sur les salmonelles.

Syndrome thoracique aigue

Il faut maintenir une saturation artérielle en oxygène supérieur à 95%; et un traitement d’antalgique.
L’antibiothérapie à large spectre active sur les germes intracellulaires et le pneumocoque (macrolides et cefotaxime ou ceftriaxone) (AUBRY, 2016).

Prise en charge des complications chroniques

Ulcères de jambe

Les ulcères de jambe drépanocytaires représentent une complication très invalidante, dont l’évolution est souvent prolongée.
Le traitement de ces ulcères n’est pas encore clairement codifié. Il fait appel aux principes généraux applicables pour les ulcères de toute origine : vaccination antitétanique, surélévation des jambes en position assise et couchée, chaussures adaptées, repos, arrêt de travail, antibiothérapie, lorsque la cicatrisation ne se fait pas correctement. En cas d’anémie importante, le recours à une transfusion peut être favorable (HAS, 2010).

Table des matières

INTRODUCTION
CHAPITRE I. SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE
I. DREPANOCYTOSE
I.1. Définition
I.2. Historique
I.3. Epidémiologie
I.4. Physiopathologie
I.4.1. Rappels sur l’hémoglobine
I.4.2. Gélification
I.4.3. Falciformation et protéine d’adhérence
I.5. Manifestations cliniques et biologiques
I.5.1. Signes cliniques
I.5.1.1. Chez l’homozygote SS
I.5.1.1.1. Phase critique ou de crise
I.5.1.1.2. Phase inter critique
I.5.1.2. Chez l’hétérozygote AS
I.5.2. Signes biologiques
I.5.2.1. Chez l’homozygote
I.5.2.2. Chez l’hétérozygote
I.6. Complications de la drépanocytose
I.6.1. Complications aigue
I.6.1.1. Complications vaso-occlusives graves
I.6.1.2. Complications infectieuses
I.6.1.3. Complication anémique
I.6.2. Complications chroniques
I.6.2.1. Ulcère de jambe
I.6.2.2.Complication rénale
I.6.2.3. Complication ostéoarticulaire
I.7. Diagnostic biologique de la drépanocytose
I.7.1. Test d’orientation
I.7.1.1. Test d’Emmel ou de falciformation
I.7.1.2.Test d’Itano ou test de solubilité
I.7.2. Test d’identification
I.7.2.1. Electrophorèse de l’hémoglobine
I.7.2.2. Chromatographie liquide haute performance
I.8. Traitement de la drépanocytose
I.8.1. Mesures préventives
I.8.1.1. Réhydratation
I.8.1.2. Supplémention en acide folique
I.8.1.3.Vaccination
I.8.2. Prise en charge des complications aigues
I.8.2.1. Traitement des crises vaso-occlusives aigues
I.8.2.2. Priapisme
I.8.2.3. Anémie aigue
I.8.2.4. Complications infectieuses
I.8.2.5. Syndrome thoracique aigue
I.8.3. Prise en charge des complications chroniques
I.8.3.1. Ulcères de jambe
I.8.3.2. Atteintes rénales
I.8.3.3. Complications ophtalmologiques
I.8.4. Traitement de fond
I.8.4.1. Programme transfusionnel
I.8.4.2. Hydroxycarbamide ou hydroxy urée
I.8.4.3. Greffe de moelle osseuse
I.8.5. Place de la médecine traditionnelle dans la prise en charge de la drépanocytose
II. Généralités sur Combretum glutinosum
II.1. Description botanique
II.2. Taxonomie
II.3. Différentes appellations
II.4. Composition chimique
II.5. Propriétés pharmacologiques
II.6. Propriétés thérapeutiques
III. Généralités sur Maytenus senegalensis
III.1. Description botanique
III.2. Taxonomie
III.3. Différentes appellations
III.4. Composition chimique
III.5. Pharmacologie
III.6. Propriétés thérapeutiques
IV. Généralités sur Leptadenia hastata
IV.1. Description botanique
IV.2. Taxonomie
IV.3. Différentes appellations
IV.4. Composition chimique
IV.5. Propriétés pharmacologiques
IV.6. Propriétés thérapeutiques
CHAPITRE II. ETUDES EXPERIMENTALES
I. MATERIEL ET METHODES
I.1. Matériel
I.1.1. Matériel végétal
I.1.2. Matériel de laboratoire
I.1.3. Matériel chimique
I.2. Méthodes
I.2.1. Extraction
I.3. Tests biologiques
I.3.1. Evaluation de l’activité antifalcémiante
I.3.2. Principe du test d’hémolyse
I.3.3. Préparation des solutions
I.3.3.1. Préparation de la solution tampon phosphate pH 7,4
I.3.3.2. Préparation des extraits
I.3.4. Protocole du test d’Emmel
II. RESULTATS ET DISCUSSION
II.1. Résultats
II.1.1. Rendement des extractions
II.1. Tests biologiques
II.2. Discussion
CONCLUSION
REFERENCES

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