Chromatographie en Phase Gazeuse couplé à la Spectrométrie de Masse 

Candida albicans

Cette espèce a été décrite pour la première fois par Berkhout en 1923. Les colonies sur Sabouraud Dextrose Agar (PDA) à 25°C sont blanches à crèmes, molles, lisses à ridées. Les isolats se développent à 42°C sur un milieu contenant le cycloheximide (Bouchara et al.,2010).
Au microscope, après 72h d’incubation à 25°C sur le jus de maïs, il y’a développement des blastoconidies avec des pseudo-hyphes et les véritables hyphes branchés. Les blastoconidies sont formées en grappes de raisin sur toute la longueur de l’hyphe. Les chlamydoconidies terminaux peuvent se former si l’incubation est prolongée ( Gordana et al., 2008; Bouchara et al., 2010).

Caractéristiques particulières

Candida albicansest naturellement isolé des cavités de l’homme. C’est une levure opportuniste qui peut rapidement devenir pathogène en raison d’un déséquilibre soit de la flore endogène soit d’une immunodéficience. C’est de ce fait la principale levure isolée au cours des candidoses superficielles, muqueuses et systémiques (Develoux et Bretagne, 2005; Bouchara et al., 2010). Elle est responsable de 50 à 80 % des infections causées par ce genre et sa mortalité est fonction du site d’infection. Ainsi par exemple aucune mortalité n’est observéedans les candidoses cutanées sensu-strictopar contre les personnes atteintes d’une infection profonde et ou disséminée connaissent un pronostic fatal dans 41,2% des cas (Cheng et al., 2005).

Caractéristiques particulières

Cette levure est de plus en plus décrite dans les pathologies humaines telles que, les diarrhées infantiles avec occasionnellement des infections systémiques.
Chez les patients souffrant d’une granulocytopenie, cette levure peut coloniser le tractus gastro-intestinal, les voies respiratoires et urinaires. Ce constat peut aussi être fait chez des patients ayant préalablement été soumis à un traitement au Fluconazole. C’est la cinquième levure responsable des pathologies humaines après Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis et Candida parapsilopsis. Même si cette levure n’est responsable que de 1,9% des cas de candidémies, sa capacité létale est de 40%. Cet ensemble de caractéristiques fait que ce parasite peut presenter un risque dans les services des soins intensifs (Samaranayake et Samaranayake, 1994; Ellis et al., 2007; Bouchara et al.,2010).

Candida parapsilosis

Cette espèce se développe entre 35°C et 37°C. ces colonies atteignent la maturité en trois jours sur Sabouraud Dextrose Agar et sont de couleurs blanches à crèmes,aspect lisses, globuleuses et quelques fois dentelées dans leur apparence.
Sur un milieu contenant des sels de tetrazolium, cette levure donne des colonies rouges (Bouchara et al., 2010).
Au microscope, sur un milieu neuf et au cours des manipulations de routine, les levures sont de forme ovale avec 3-4 x 5-8 µm. Sur milieu Agar contenant le jus de maïs et le tween 80, cette espèce présente des pseudo-hyphes relativement.

Cryptococcuset les Cryptococcoses

Description et Habitat

Le genre Cryptococcus représente un ensemble de levures ou de blastospores, globuleuses à sub-globuleuses. Elles se reproduisent par des bourgeonnements multilatéraux. Des bourgeonnements latéraux sont rarement observés. Elles ne produisent pas de pseudo-hyphes sinon de façon très rudimentaires et donc rarement perceptibles au microscope. Elles sont pour la plus part encapsulées et la capsule contient un polysaccharide semblable à l’amidon.
Sur milieu Sabouraud Dextrose Agar, elles sont mucoïdes et fines en apparence.
Au cours de leur phase stationnaire, elles peuvent produire un pigment rouge, orange ou jaune caractérisant pour certains la synthèse de caroténoïde. Mais lorsque les cellules sont en phase exponentielle, les colonies formées sont crèmes à beiges. Ces levures ne font pas de fermentation et certaines assimilent le nitrate.

L’Inflammation

Définition

L’inflammation a été décrite pour la première fois par Celsius, il y’a environ 200 ans sous les quatre termes suivants. Rougeur, Chaleur, Tumeur et Douleur.
Cette définition purement physiologique ne prend pas en compte les phénomènes biologiques et biochimiques.
Plus généralement, l’inflammation est une réaction de défense de l’organisme ou d’un tissu, suite à une agression abiotique (variation de température, radiations ionisantes, éléments chimiques endogènes ou exogènes) ou biotique (contamination microbienne, piqûres d’insectes ou d’autres animaux) de l’organisme. Au cours de l’agression, l’organisme est alerté au moyen de médiateurs chimiques qui d’une part vont orienter la réponse de l’organisme vers le site de l’agression mais aussi, favoriser le phénomène de guérison et de réparation. Les mécanismes de réponse sont identiques. Quel que soit le type d’éléments agressants, seul pourra varier la durée de la réponse, permettant de distinguer deux types d’inflammation : l’inflammation aiguë et subaiguë ou chronique (Borel et al.,2013).

Les médiateurs de l’inflammation

La réponse de l’organisme à une invasion quelconque se fait suivant un ensemble bien coordonné de médiateurs et d’acteurs chimiques et cellulaires.

Les médiateurs Chimiques

Une grande variété de médiateurs chimiques est généralement responsable des réponses inflammatoires en fonction de la nature du stimulus. Le plus important dans l’initiation de la réponse immunitaire implique les métabolites obtenus du métabolisme de l’acide arachidonique contenu dans les phospholipides membranaires. Ces métabolites vont activer l’attraction des cellules immunitaires qui à leur tour vont produire d’autres médiateurs chimiques. Ces derniers ont une action pro- mais aussi anti-inflammatoire.

Les dérivés du métabolisme de l’acide arachidonique

L’acide arachidonique est un intermédiaire important dans la réponse inflammatoire de l’organisme. Il est obtenu par action catalytique de la Phospholipase A2 sur les phospholipides membranaires. Les dérivés obtenus sont les prostaglandines, les thromboxanes et les leucotriènes.

Les prostaglandines

Les prostaglandines sont les hormones responsables du contrôle d’un ensemble de réactions biochimiques allant de la naissance au sommeil en passant par les fièvres, les inflammations, les menstruations la vasoconstriction et la coagulation (Coulthard et al.,2012).Les prostaglandines sont les produits finaux du catabolisme de l’acide arachidonique par deux isotypes de cyclooxygénase (prostaglandine H synthase). L’une, la cyclooxygénase 1, est produite en continue dans l’organisme. Le premier intermédiaire produit par cette enzyme est la prostaglandine G2 qui par maturation va donner la prostaglandine H. Cettedernière est un métabolite clef dans cette voie métabolique. En effet, par maturation, elle va donner tous les autres types de prostaglandines : les prostaglandines I2, D 2, F2α et E 2 . La prostaglandine E2 pouvant se convertir en Prostaglandine F2α . Les prostaglandines produites via la cyclooxygénase 1 permettent d’assurer la bonne régulation de l’homéostasie interne à travers la régulation de la perfusion rénale et la protection gastro-intestinale contre les sécrétions acides stomacales. Le deuxième iso-type de cyclooxygénase, la cyclooxygénase 2 est inductible par les médiateurs de l’inflammation tel que les lipo-polysaccharides (retrouver entre autre sur les parois et membranes de certains microorganismes pathogènes), certaines cytokines (TNF-α et IL-β1) et dans les cas d’hypoxie et ou ischémie.

Les Médiateurs cellulaires

Les plaquettes sanguines

Les plaquettes sont les cellules anucléées du sang. En plus de leur rôle dans les thromboses, elles participent dans la réponse inflammatoire car elles assurent la production en continue des cytokines sur le site de l’invasion. Ceci a pour conséquence d’entretenir l’alerte tout au long de la réponse inflammatoire.

Les Mastocytes et les Polynucléaires

Ce sont des cellules particulières qui ne sont produites dans le site de l’agression que sous l’influence des médiateurs chimiques. En effet, elles existent dans le système vascularisé sous forme de cellules souches et ne vont acquérir leur maturité que sous l’activation des cytokines et des cheimiokines. Une fois activés, ces mastocytes vont produire d’autres médiateurs protéiques tels que l’histamine, les tryptases et aussi, les espèces réactives de l’oxygène (Eming et al., 2007; Frenzel et Hermine 2013). Ces cellules sont aussi les premières à identifier l’agent infectieux et à produire certaines cytokines inflammatoires comme les TNF-α et l’interleukine -6. Ceci conduit au maintien de l’inflammation. De plus elles vont assurer le control de la perméabilité membranaire, de l’influx des poly-morpho-nucléaires et assurer le remodelage cellulaire au cours du mécanisme de cicatrisation (Eming et al.,2007).

Botanique

Etymologiquement, okimon (mot grec) signifie « plante à parfum » et basilikonse traduit par « royal ». Ocimum basilicum(du grec basileusqui signifie Roi), plante originaire des indes Orientales et d’Afrique, jouit du prestige de « plante sacrée ». Elle a été répandue en Inde, en Perse, en Grèce, en Europe de l’Ouest sur l’initiative de médecins arabes, puis en Afrique (Boullard, 2001).
C’est une plante herbacée ligneuse, très ramifiée, parfumée atteignant 1 m de hauteur et ayant une tige quadrangulaire. Les feuilles sont opposées, denticulées, les pétioles ovales ou obovales, cunées à la base, acuminées au sommet. Les inflorescences sont en racème spiciforme terminales lâches, formées de petits groupes de fleurs verticillées. Les fleurs sont blanchâtres et ont deux lèvres. La lèvre supérieure est plus développée et porte 4 dents au sommet. La lèvre inférieure est courte et arrondie (Adjanohoun et al.,1989 ; Eklu-Natey et Balet, 2012).

Ethnobotanique et Pharmacologie

Cette plante, déjà utilisée à titre d’antispasmodique chez les hébreux, fut recommandée par Pline l’Ancien contre l’épilepsie. D’après Dioscoride, médecin grec, elle calmerait la douleur des piqûres de scorpions. Les arabes le préconisaient contre la blennorragie, et Bernard de Gordon, au XIII èmesiècle comme Hoffmann cinq siècles plus tard, contre la manie et la mélancolie. C’est une plante sacrée pour les Hindous, qui l’utilisaient comme antidote. (Debuigne et Couplan, 2001). Au Benin, Le suc des feuilles est utilisé par voie nasale contre les céphalées. La pulpe de feuilles est utilisée per osdans l’hypotrophie fœtale et délayée dans de l’eau pour la toilette intime, dans les distosies. Les parties aériennes de la plante sont utilisées sous forme de décocté aqueux, en association avec d’autres plantes contre plusieurs pathologies (Adjanohoun et al.,1989). Au Burkina-Faso, les feuilles sont utilisées contre les troubles du sommeil, les piqûres des insectes venimeux. Au Sénégal, elle est utilisée comme stimulant, insectifuge, contre la sinusite, l’otite et les céphalées (Eklu-Natey et Balet, 2012).

Les huiles essentielles de Ocimum basilicum Lin

Les huiles essentielles de Ocimum basilicum sont le plus souvent extraites utilisant l’hydrodistillation. Les quantités d’huiles essentielles obtenues varient en fonction du lieu de récolte et du traitement post-récolte. Ainsi, l’échantillon de l’Est de la Chine a produit de l’huile essentielle avec un rendement de 0,43% sur la partie aérienne séchée puis écrasée (Zhang et al. ,2009). Dans les mêmes conditions, l’échantillon Turque, a produit une huile essentielle avec un rendement de 1,25% (Özcan et Chalchat, 2002). Les rendements variant entre 1,4% à 2,2% ont été obtenus des échantillons togolais traités dans les mêmes conditions (Koba et al.,2009). L’huile essentielle de l’échantillon nigérian sur matériel séché pendant 5 jours a été obtenue avec un rendement de 0,17% par Adeola et al. (2012). Par contre, Ismail, (2006)a obtenu un rendement de 1,7% sur le matériel végétal frais récolté au Caire en Egypte. L’échantillon algérien a produit une huile essentielle avec un rendement de 1,98% partant des feuilles sèches (Khalifa et al., 2012).

Les plans d’expériences

Les plans d’expériences sont les procédés de planification des études dans le but d’atteindre avec précision des objectifs fixés. Une bonne planification est extrêmement importante. Elle permet de déterminer d’une part le type de donné à rechercher au cours de l’expérimentation mais aussi la taille de l’échantillonnage à faire pour répondre clairement et le plus efficacement possible à la question de recherche posée en amont de l’expérimentation. Ces expérimentations quant à elles permettent de décrire la variation de la réponse en fonction du traitement et de ce fait de donner les réponses optimales, maximales et minimales. Les traitements factoriels peuvent être appliqués dans ce cas mais lorsque les facteurs varient continuellement au cours de l’expérimentation, les surfaces réponses sont plus indiquées (Oehlert, 2003).

Matériel fongique

Le matériel fongique était constitué de 77 isolats de levures prélevées de la Bouche (18 isolats), des selles (21 isolats), des urines (14isolats), des prélèvements vaginaux (18 isolats) et du liquide céphalorachidien (6 isolats) des patients HIV-positifs à l’hôpital du Central de Yaoundé et caractérisés par des méthodes mascroscopiques, microscopiques et biochimiques. Dès lors, aucun consentement éclairé des patients n’était nécessaire dans le cadre du présent travail. Ils étaient constitués de Candida albicans, de Candida Krusei, de Candida glabrata, de Candida parapsilopsis et Candida tropicalis. Ces levures ont été sélectionnées de façon aléatoire de la mycothèque de l’Unité des agents antimicrobiens du Laboratoire de Phytobiochimie et d’Etude des Plantes Médicinales de l’Université de Yaoundé 1.

METHODES

Extraction des huiles essentielles

Les huiles essentielles ont été extraitespar hydrodistillation à l’aide d’un dispositif de type Clevenger (annexe 1).

Principe

Lorsqu’une plante odoriférante immergée dans de l’eau est portée à ébullition les composés odoriférants volatils vont être entrainés par la vapeur d’eau. Lorsque cette vapeur ensemble est condensée et recueillie, les huiles essentielles de par leur densité généralement faible couplé à leur caractère hydrophobe forment une phase surnageante pouvant être séparées de la phase aqueuse par décantation.

Méthodologie

Le matériel végétal pesé (1000g) a été immergé dans 4 L d’eau dans un réacteur et un appareil Clevenger y a été adapté. L’ensemble a été porté à ébulition pendant environ 4 heures sur une calotte chaufante. A la fin, l’huile essentielle a été recueillie par décantation et séchée sur une colonne de sulfate de sodium anhydre (Na 2SO4 ), pesée et conservée dans un flacon ambré à environ4°C à l’abri de la lumière.

Table des matières
DEDICACE
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES FIGURES
LISTE DES PHOTOGRAPHIES
LISTE DES ANNEXES
INTRODUCTION
I. GENERALITES SUR LES CHAMPIGNONS
I.1. Définition et Morphologie
I.2.Champignons et Mycoses
I.2.1. Candida sppet les Candidoses
I.2.1.1. Description et Habitat
I.2.1.2.Pathogénie
I.2.1.3. Candida albicans
I.2.1.4. Candida glabrata
I.2.1.5.Candida krusei
I.2.1.6. Candida parapsilosis
I.2.1.7. Candida tropicalis
I.2.2.Cryptococcuset les Cryptococcoses
I.2.2.1. Description et Habitat
I.2.2.2. Pathogénie
I.2.2.3. Cryptococcus néoformans
I.3. Les antifongiques et leur mode d’action
I.3.1.Définition
I.4. Quelques antibiotiques utilisés dans le traitement des mycoses
I.2. OXYDATION ET INFLAMMATION
I.2.1. Généralités sur les oxydants et les antioxydants
I.2.1.1. Définition
I.2.1.2. Les molécules responsables des oxydations
I.2.1.3.Rôle physiologique des radicaux libres
I.2.1.4. Les antioxydants
I.2.1.5.2.Classification des antioxydants
I.2.2. L’Inflammation
I.2.2.1.Définition
I.2.2.2.Les médiateurs de l’inflammation
I.2.2.3. Les Anti-inflammatoires
I.3. GENERALITE SUR LES PLANTES ETUDIEES: LE GENRE OCIMUM
I.3.1. Description
I.3.3. Les Huiles essentielles du genre Ocimum
I.3.3. Ocimum basilicum Linnaeus
I.3.3.1. Noms usuels
I.3.3.2. Quelques appellations traditionnelles
I.3.3.3. Synonymes
I.3.3.4. Botanique
I.3.3.5. Ethnobotanique et Pharmacologie
I.3.3.5. Les huiles essentielles de Ocimum basilicum Lin
I.3.4. Ocimum canum Linnaeus
I.3.4.1. Noms usuels
I.3.4.2. Appellations traditionnelles
I.3.4.3. Synonymes
I.3.4.4. Botanique
I.3.4.5. Ethnobotanique et Pharmacologie
I.3.4.6. Les huiles essentielles de Ocimum canum Lin
I.3.5. Ocimum gratissimum Linnaeus
I.3.5.1. Noms usuels
I.3.5.2. Appellations traditionnelles
I.3.5.3. Synonymes
I.3.5.4. Botanique
I.3.5.5. Ethnobotanique et Pharmacologie
I.3.5.6. Les huiles essentielles de Ocimum gratissimum Lin
I.3.6. Ocimum urticaefolium Linnaeus
I.4 REVUE SUR L’ETUDE DES COMBINAISONS
I.4.1.Définition du concept
I.4.2.Isobole par la main
I.4.3. Produit Fractionnel de Weeb
I.4.4. Calcul des Indexes d’interaction
I.4.5. Méthode de l’effet médian de Chou et Talalay (1984)
I.4.6. Méthode de Berembaum
I.4.7. La méthode de Prichard et Chipman (Prichard et Shipman, 1990)
I.4.8. Les plans d’expériences
I.4.8.1.Les plans factoriels complets
I.4.8.2.Les plans en composite central
I.4.8.3.Le plan de Box-Behnken
I.4.8.4.Le plan de Doehlert
I.4.9. Les optimisations des réponses multiples
II.1.CADRE D’ETUDE
II.2. MATERIEL ET METHODES
II.2.1. MATERIEL BIOLOGIQUE
II.2.1.1. Matériel végétal
II.2.2.2. Huile des graines de Linum usitatissimum
II.2.2.3. Matériel fongique
II.2.3. METHODES
II.2.3.1. Extraction des huiles essentielles
II.2.3.1.1. Principe
II.2.3.1.2.Méthodologie
II.2.3.2. Analyse de la composition chimique des huiles essentielles
II.2.3.2.1. Chromatographie en phase gazeuse et tandem Chromatographie en Phase Gazeuse couplé à la Spectrométrie de Masse
II.2.3.2.2. La Spectroscopie Infrarouge Moyen
II.3.3. Evaluation de l’activité antifongique
II.3.3.2. Evaluation de la Fongicidie par la méthode au Bleue de méthylène
II.3.3.3. Combinaison des huiles essentielles
II.3.3.4. Les plans d’expérience
II.3.3.5. Combinaison des réponses multiples
II.3.3.5. Détermination de la cinétique de mortalité des levures
II.3.4. Activité anti radicalaire
II.3.4.1. Activité sur le radical DPPH
II.3.4.2. Activité sur le radical hydroperoxide (H2O2)
II.3.4.3. Activité sur les radicaux Oxyde nitrique (NO) et dioxyde nitrique (NO2)
II.3.5. Effet protecteur sur l’huile des graines de Lin
II.3.5.1.Principe
II.3.4.2. Méthode
II.3.5.3.L’analyse spectroscopique
II.3.5.4. La spectrophotométrie
II.3.5.5. La titrimétrie
II.3.6. Activité sur la cyclooxygénase 1 et 2
II.3.6.1. Principe
II.3.6.2. Méthode
II.4. ANALYSES STATISTIQUES
III. RESULTATS ET DISCUSION
III.1. RESULTATS
III.1.1. Rendement d’extraction
III.1.2. COMPOSITION CHIMIQUE DES HUILES ESSENTIELLES
III.1.2.1. Etude de la composition chimique par CPG et CPG/SM
III.1.2.2. L’analyse Infrarouge des huiles essentielles d’Ocimum
III.1.3.1. Screening de l’activité sur les isolats de levure
III.1.3.3. Détermination des concentrations minimales inhibitrices par coloration au bleu de méthylène
III.1.3.4. Combinaison des huiles essentielles par la méthode de l’échiquier
III.1.3.5. Combinaisons des huiles essentielles utilisant les plans d’expériences
III.1.4. ACTIVITE ANTIOXYDANTE DES HUILES ESSENTIELLES
III.1.4.1. Activités anti-radicalaires
III.1.4.2. Activités protectrice de l’huile de lin
III.1.5. ACTIVITE ANTI-INFLAMMATOIRE DES HUILES ESSENTIELLES
III.1.5.1. Activité inhibitrice des huiles essentielles sur la cyclo-oxygénase 1
III.1.5.2. Activité inhibitrice des huiles essentielles sur la cyclooxygénase 2
III.1.2.3. Pharmacologie des combinaisons optimisées des Huiles essentielles
III.2. DISCUSSION
CONCLUSION
PERSPECTIVES
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 
ANNEXES

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