Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM)

Éponges

Les éponges sont des animaux pluricellulaires dotés de pores inhalants et exhalant d’où le nom Porifera dérivant du latin porus et ferre signifiant respectivement pore et porter.
Ce sont les métazoaires les plus primitifs. Elles seraient apparues il y a environ 540 millions d’années. Elles ont une durée de vie très longue pouvant atteindre plus de mille ans. Les éponges adultes sont sessiles, elles se fixent à vie sur un substrat, même si leurs larves nagent librement. Leur corps est principalement composé de spicules et de spongine.

Classification

La classification des éponges a été revue par HOOPER en 2000, Tableau 1. Il a publié le guide de collection et d’identification des éponges. Cette classification est basée sur le mode de reproduction, ovipare ou vivipare et la composition chimique du squelette de l’éponge. Les spicules peuvent être de calcite (carbonate de calcium) comme chez les Calcisponges, ou d’opale (silice) comme chez les Démosponges et les Hexactinellides.

Structure

Les éponges ne possèdent pas d’organes véritablement définis (ni appareil digestif, ni appareil génital, ni poumons…). Toutefois, elles sont dotées de cellules topitentes capables d’exercer différentes fonctions. Elles sont diploblastiques ou diblastiques : elles possèdent deux feuillets dont un feuillet externe, l’ectoderme, et un feuillet interne, l’endoderme. Ces feuillets sont traversés par des pores inhalants constitués de porocytes qui sont des cellules creuses permettant le passage de l’eau. L’ectoderme est formé de pinacocytes. L’endoderme est constitué de choanocytes, lesquels assurent la circulation d’eau, la capture de nourriture, l’apport en oxygène et l’éjection de déchets et phagocytent les particules de diamètre inférieur à 1μm. Ces deux feuillets sont séparés par une couche intermédiaire, le mésohyle, appelé aussi mésenchyme ou mésoglée, où baignent différents types de cellules telles que les amibocytes qui phagocytent les particules de diamètre compris entre 1 et 50μm, les scléroblastes qui produisent les spicules et les collencytes qui secrètent de la gelée polysaccharidique, Figure 1.
Il existe 3 types de structure d’organisation chez les spongiaires (Figure 2) :
– le type ascon qui est la forme de base et aussi le stade juvénile de la plupart des
éponges ;
– le type sycon qui est un assemblage de plusieurs ascons ;
– le type leucon qui est un modèle plus complexe du type ascon.
Les démosponges n’adoptent jamais les structures de type ascon ni sycon mais uniquement la structure leucon.

Mode d’alimentation

Les éponges sont suspensivores, elles se nourrissent d’organismes de petite taille (dont le diamètre est inférieur à 50μm) et surtout de bactéries en suspension en filtrant l’eau. La filtration se fait en permanence grâce à un courant d’eau créé dans les chambres internes par les battements des flagelles des choanocytes. Cette filtration permet non seulement de piéger les nutriments et d’éliminer les déchets mais aussi de puiser l’oxygène nécessaire à la respiration. Les éponges sont capables de filtrer jusqu’à 20 000 fois leur volume.

Mode de reproduction

Les éponges peuvent être gonochoriques ou hermaphrodites. La production de gamètes mâles et femelles dépend de la saison. Mais elles peuvent aussi se reproduire asexuellement. Ainsi, on observe deux modes de reproduction.

Reproduction sexuée

Mises à part quelques démosponges ovipares, les éponges sont le plus souvent vivipares. Les spermatozoïdes sortent et nagent librement dans l’eau, entrent avec le flux d’eau dans une autre éponge et pénètrent dans la mésoglée où se trouvent les ovules. L’oeuf se développe dans la mésoglée et devient une larve nageuse.

Reproduction asexuée

· Elle se fait par bouturage : une excroissance se développe à la périphérie de l’oscule et peut se détacher pour donner une autre éponge.
· Elle peut aussi se faire par gemmulation : des gemmules ou sorites sont libérées à la mort de l’éponge et s’ouvrent pour donner un nouvel individu quand les conditions sont favorables.

Biotope

Les éponges sont exclusivement aquatiques et la plupart sont marines. Elles peuvent évoluer aussi bien dans les mers tropicales que polaires et vivent à toutes les profondeurs, de la zone littorale jusque dans la zone abyssale (8600m) [LECOINTRE et LE GUYADER, 2001].
Leurs répartitions et leurs habitats dépendent de leur classe, Tableau 2.

Association Éponge-Microorganismes

Les éponges vivent en symbiose avec des microorganismes qui sont des êtres vivants microscopiques. Ces derniers peuvent être ectosymbiotes ou épibiotes et coloniser la surface de l’éponge [CHELOSSI et al., 2004]. Ils peuvent aussi être endosymbiotes et vivre à l’intérieur de l’organisme hôte. La présence de microorganismes dans le mésohyle d’une éponge a été mise en évidence par ALTHOFF et al. en 1998 et confirmée par FRIEDRICH et al. en 1999.

Différents types d’association [PRESCOTT et al., 2003]

Une association permanente s’établit entre l’éponge et les microorganismes [FRIEDRICH et al., 2001]. Il y a trois types d’association possibles entre les deux protagonistes :
– Le mutualisme où chaque entité tire des bénéfices de l’association. Une réciprocité en matière de profit est alors établie entre les microorganismes et l’éponge.
– Le commensalisme où une relation de non réciprocité est établie. Seuls les microorganismes tirent alors des avantages et l’éponge reste tout simplement un abri.
– Le parasitisme où l’association nuit à l’hôte. Les microorganismes tirent alors profit de l’éponge tout en causant des maladies et des symptômes.

Différents types de microorganismes associés aux éponges

Depuis les études d’ABRELLL, 1997 sur les champignons associés aux éponges peu de recherches ont mis en évidence cette association. Toutefois, des champignons ont été observés en association avec Spirastrella inconstans [GANDHIMATHI et al., 2008], l’espèce Gymnascella dankaliensis a été isolée à partir d’Halichondria japonica [AMAGATA et al., 2008].
Quant à la mise en évidence de l’association entre les bactéries et les éponges, elle a fait l’objet de nombreuses études. Différents groupes, genres et espèces de bactéries vivent en association avec les éponges : la masse bactérienne peut atteindre plus de 40% par rapport à la biomasse de l’éponge ; ceci représente entre  les Actinomycètes ou plus précisément les Streptomyces [GANDHIMATHI et al., 2008], les Micromonospora [ZHANG et al., 2006] et les cyanobactéries [BRUSCA et BRUSCA, 2002].

Chimie des microorganismes marins

Les microorganismes marins synthétisent des métabolites secondaires. Ces produits de natures diverses ont des structures variées : alcaloïdes [CHARAN et al., 2004], lactones [CHO et al., 2001 ; STRITZKE et al., 2004], amides [FELING et al., 2003], peptides cycliques ou non cycliques [SHIN et al., 2003 ; NAGAI et al., 2003], esters [SCHUMACHER et al., 2003], composés indoliques [SANCHEZ LOPEZ et al., 2003], lactames macrocycliques [MITCHELL et al., 2004], lactone-lactames [MANAN et al., 2005], pyrrolesesquiterpènes [MACHERLA et al., 2005], polycétides [PIEL et al., 2004 ; OH et al., 2008] et quinolones. Ces derniers ont été isolés à partir d’une bactérie associée à l’éponge Suberea creba [DEBITUS et al., 1998].

Propriétés biologiques des métabolites secondaires des microorganismes associés aux éponges

Les métabolites secondaires des microorganismes associés aux éponges présentent diverses activités biologiques :
– Antibactériennes, notamment contre Micrococcus luteuas, Staphylococcus epidermis, Klebsiella pneumonia, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio harveyi et Staphylococcus aureus ;
– Antifongiques, notamment contre Candida albicans, Candida tropicalis, Aspergillus fumigatis et Aspergillus flavus [CHELOSSI et al., 2004 ; THAKUR et al., 2005 ; ANAND et al., 2006 ; GANDHIMATHI et al., 2008] ;
– anticancéreuses [AMAGATA et al., 2008].

Désinfection en surface [GANDHIMATHI et al., 2008]

Toutes les manipulations ont été effectuées dans une zone aseptique, sous hotte à flux laminaire dans un rayon de 20cm autour de la flamme du bec Bunsen. L’éponge a été décongelée progressivement à température ambiante. Elle a ensuite été immergée dans l’éthanol 70° pendant 1 minute, puis rincée 4 fois à l’eau distillée stérile.

Mise en culture

Cette étape constitue l’isolement proprement dit et toutes les manipulations se sont déroulées dans un environnement stérile, sous hotte à flux laminaire et dans un rayon de 20cm autour de la flamme du bec Bunsen.
L’éponge désinfectée a été découpée en petits morceaux d’environ 0,05cm3 à l’aide d’un scalpel stérile. Ils ont été déposés sur les milieux additionnés de Chloramphénicol pour la culture de champignons et de Nystatine pour celle des bactéries, en raison de 20 morceaux par boîte de 90mm de diamètre. Les boîtes ont ensuite été incubées à 25°C. Les cultures ont été observées tous les jours et dès qu’un microorganisme a émergé de l’explant d’éponge, il a été repiqué sur un milieu stérile sans agent antimicrobien, et incubé à 25°C. Les cultures ont été arrêtées lorsqu’il n’y a plus eu de microorganismes émergeant des explants ou lorsque ces derniers ont été épuisés.
Tous les microorganismes isolés ont été repiqués successivement sur des milieux stériles adéquats jusqu’à l’obtention d’une culture pure, c’est-à-dire lorsqu’il n’apparaissait plus qu’un seul type de souche dans la boîte.

Activité biologique des acides Δ5,9 [VELOSAOTSY, 2005 ; MEYER et GUYOT, 2002]

Les activités biologiques des acides Δ5,9 couvrent une large variété. L’ester méthylique de l’acide triaconta-5,9,23-triènoïque isolé à partir de l’éponge marine Chondrilla nucula est un inhibiteur de l’élastase. Il pourrait constituer un agent thérapeutique contre l’emphysème pulmonaire et la bronchite chronique. Quant aux acides 5Z,9Z-16:2 et 14-Me-5Z,9Z-15:2, ils inhibent la topoisomérase-I humaine et possèdent des activités contre les bactéries à Gram (+) uniquement. L’acide 6-bromo-5,9,24-28:3 isolé à partir de Xestospongia sp. s’est révélé actif contre les cellules de leucémie murine L1210 et aussi contre des cellules KB de carcinome humain.

Chromatographie

Chromatographie sur couche mince (CCM) [MAHUZIER et HAMON, 1990]

La CCM est une chromatographie d’adsorption permettant la séparation des substances. La phase mobile est un solvant organique et la phase stationnaire est constituée d’un film de gel de silice ou d’alumine ou de poudre de cellulose déposé sur un support rigide (verre) ou souple (aluminium ou plastique). La révélation des substances se fait par examen sous lumière ultraviolette à des longueurs d’onde caractéristiques ou par exposition aux vapeurs d’iode ou par formation de réactions colorées en pulvérisant avec un réactif et éventuellement en chauffant. Dans des conditions opératoires déterminées, la référence frontale (Rf) pourrait permettre l’identification d’une substance.

Chromatographie en phase gazeuse (CPG) [MAHUZIER et HAMON, 1990]

C’est une chromatographie d’élution utilisant une phase mobile gazeuse et une phase stationnaire liquide ou solide. Elle permet de séparer des mélanges gazeux. Si les mélanges ne sont pas naturellement à l’état gazeux, ils sont volatilisés au moyen d’une élévation de température. Cette température doit être adéquate pour chaque composé afin d’empêcher la destruction de ce dernier. Toutefois, il faut recourir à la formation de dérivés pour les composés thermolabiles ou encore ceux dont le point d’ébullition est élevé avant ce chauffage. C’est le cas des acides gras qui sont des dérivés d’acide carboxylique. Leur méthylation constitue un moyen d’éviter la décomposition.

Spectroscopie de masse (SM) [HAMON et al., 1990 ; SILVERSTEIN et al., 2003]

Elle repose sur l’ionisation et la fragmentation de la molécule. L’ionisation provoque la coupure des liaisons interatomiques et donne naissance à des fragments caractérisés par le rapport de leur masse à leur charge m/z. Les fragments ainsi formés sont séparés en fonction  du rapport m/z.
Plusieurs méthodes sont utilisées en spectrométrie de masse telle l’ionisation chimique mais le plus courant est l’impact électronique (IE). En impact électronique, le spectromètre bombarde les molécules avec un faisceau d’électrons de 70 électrons-volts. L’impact d’un électron sur une molécule provoque l’expulsion d’un électron créant ainsi un ion positif appelé ion moléculaire. C’est un ion radical représenté par le symbole M+.. La décomposition de l’ion moléculaire donne naissance à des fragments ioniques ou radicalaires

Table des matières

INTRODUCTION GENERALE 
PARTIE I : MICROORGANISMES ASSOCIES à Stylissa sp
I. Généralités
I.1. Éponges
I.1.1. Classification
I.1.2. Structure
I.1.3. Mode d’alimentation
I.1.4. Mode de reproduction
I.1.4.a. Reproduction sexuée
I.1.4.b. Reproduction asexuée
I.1.5. Biotope
I.2. Association Éponge-Microorganismes
I.2.1. Différents types d’association
I.2.2. Différents types de microorganismes associés aux éponges
I.3. Chimie des microorganismes marins
I.4. Propriétés biologiques des métabolites secondaires des microorganismes associés aux éponges
II. Matériels et méthodes 
II.1. Matériel biologique
II.2. Isolement et identification préliminaire
II.2.1. Isolement et purification des microorganismes associés à l’éponge
II.2.1.a. Matériels utilisés
II.2.1.b. Désinfection en surface
II.2.1.c. Mise en culture
II.2.1.d. Vérification du procédé de désinfection en surface
II.2.2. Identification préliminaire
II.2.2.a. Matériels utilisés
II.2.2.b. Observation macroscopique des colonies : codage
II.2.2.c. Observation microscopique
II.2.2.d. Tests biochimiques
II.3. Conservation des souches bactériennes
II.3.1. Matériels utilisés
II.3.2. Méthode
II.4. Production et extraction des métabolites secondaires
II.4.1. Matériels utilisés
II.4.2. Préparation de l’inoculum
II.4.3. Étude de la croissance des souches bactériennes
II.4.4. Production de métabolites secondaires
II.4.5. Extraction des métabolites secondaires
II.5. Criblage biologique par la méthode de CCM Bioautographie directe
II.5.1. Matériels utilisés
II.5.2. Préparation du chromatogramme
II.5.3. Test antimicrobien
II.6. Criblage chimique des composés à activité antimicrobienne
II.6.1. Matériels utilisés
II.6.2. Méthodes
II.6.2.a. Criblage des composés azotés et des alcaloïdes
II.5.2.b. Criblage des composés terpéniques, stéroïdiques et phénoliques
II.6.2.c. Criblage des composés flavonoïdiques
II.6.2.d. Criblage des composés anthracéniques
II.6.2.e. Criblage des lipides et des phospholipides
III. Résultats et discussions
A. Caractérisation des microorganismes
B. Études des métabolites secondaires
C. Activités antimicrobiennes
D. Criblage chimique
CONCLUSION
PERSPECTIVES 
PARTIE II : ETUDE DES LIPIDES DE L’EXTRAIT HEXANIQUE de Stylissa sp
I. Généralités
I.1. Lipides
I.1.1. Caractéristiques physiques
I.1.2. Fonction des lipides
I.1.3. Classification des lipides
I.2. Acides gras
I.2.1. Nomenclature des acides gras
I.2.1.a. Acides gras saturés
I.2.1.b. Acides gras insaturés
I.2.1.c. Acides gras ramifiés
I.2.1.d. Acide gras iso et anteiso
I.2.2. Longueur de chaîne équivalente (LCE)
I.3. Acides gras des éponges
I.3.1. Acides gras monoinsaturés Δ5 et Δ9
I.3.2. Acides gras diinsaturés Δ5,9
I.3.3. Acides gras insaturés « non-methylene interrupted »
I.3.4. Acides gras ramifiés
I.3.5. Acides gras iso et anteiso
I.3.6. Acides α-hydroxylés et α-méthoxylés
I.3.7. Acides isoprénoïques
1.4. Stéroïdes
I.4.1. Acides nor-19-stanol et nor-A-stanol
1.5. Biosynthèse des terpènes
I.6. Activité biologique des acides Δ5,9
I.7. Chromatographie
I.7.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
I.7.2. Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
I.8. Spectroscopie de masse (SM)
I.9. Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM)
I.10. Solvants d’extraction des lipides
I.11. Techniques utilisés pour l’obtention et l’analyse des acides gras
II. Matériels et méthodes 
II.1. Extraction de l’éponge
II.1.1. Matériel biologique
II.1.2. Solvants
II.1.3. Méthode
II.2. Analyse en CCM des différents extraits
II.2.1. Matériels
II.2.2. Méthode
II.3. Transestérification
II.3.1. Matériels
II.3.2. Méthode
II.4. Analyse par chromatographie en phase gazeuse couplée à la masse des EMAG
III. Résultats et discussions
III.1. Extraction de l’éponge
III.2. Analyse en CCM des différents extraits
III.3. Analyse en CPG/SM
CONCLUSION 
CONCLUSION GENERALE
PERSPECTIVES 
RÉFÉRENCES PARTIE I 
RÉFÉRENCES PARTIE II
ANNEXE I 
ANNEXE II 
ANNEXE III 
ANNEXE IV 
ANNEXE V 
ANNEXE VI

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