Chromatographie d’échange d’ion

Chromatographie d’échange d’ion

La séparation des protéines digérées peut être réalisée à l’aide de la chromatographie d’échange d’ions. La colonne est réalisée de la même manière pour l’enrichissement des phosphopeptides. Une pièce de membrane Anion SR est ajoutée à la colonne. Cette dernière est ensuite remplie avec 18-22 g d’une suspension de Polysulfoethyl A dans du méthanol. Une fois la colonne placée dans un eppendorf de 2 mL, le tout est centrifugé durant 1 minutes à 13’000 g afin d’éliminer le méthanol. La colonne est ensuite équilibrée avec, dans l’ordre, 100 µL de 50 % ACN- 0,5 % FA, 100 µL de tampon SCX B (NaCl 1M dans du tampon SCX A) et 2 portions de 100 µL de tampon SCX A (10 % ACN – 0,2 % FA). Entre chaque étape, la colonne est centrifugée durant 3 minutes à 5’000 g. L’échantillon de peptide peut être chargé sur la colonne et centrifugé durant 15 minutes à 5’000 g. Le flow through est récupéré (FT). L’étape de lavage se fait à l’aide de 50 µL de tampon SCX A, le liquide qui a passé à travers la colonne est récupéré et combiné au FT. Lors de cette étape, centrifuger à 6’000 g durant 5 minutes. Les peptides sont ensuite élués avec 100 µL de chaque différente solution de chlorure de sodium (30-50-80-120 et 500 mM).

Chromatographie liquide

Préparation d’échantillon
En général, 1 µg de peptides préalablement séchés sont dissous dans du 4 % FA et injectés.

Colonne
Les colonnes capillaires utilisées pour la chromatographie liquide sont préparées au laboratoire sous azote. La colonne contient une phase stationnaire Jupiter® 3 µm C18 300 Å.

Système de séparation LC
Les peptides sont élués avec un gradient de 5 à 70 % d’acétonitrile. Le deuxième éluent est composé d’eau avec 0,2 % d’acide formique. Le volume d’injection est de 18 µL. Le débit de l’HPLC est 0,6 µL/min.

Résultats et Discussion

Système de contrôle

Au total, quelques 75 échantillons ont été analysés avec une méthode de 170 minutes ce qui donne environ 9 jours d’analyses au LC-MS/MS. Il est primordial de déterminer si l’appareil est resté stable durant toute la durée des analyses afin de pouvoir comparer les échantillons passés au jour 1 avec ceux du jour 9 de manière correcte. Pour ce faire, une solution Promix a été passée au début, entre chaque série de 15 échantillons et à la fin de l’analyse. Le but étant de comparer l’aspect, le temps de rétention et l’intensité des pics de chaque Promix pour confirmer que l’analyse ait été constante durant 9 jours. Les pics les plus intenses présents dans le chromatogramme du Promix 1 sont retrouvés facilement et avec des temps de rétention similaires dans les autres chromatogrammes. Une différence est observable concernant l’intensité. Cette différence est surtout marquée entre le chromatogramme du Promix 2 et les autres. Comme il est difficile d’émettre une hypothèse sur l’aspect visuel des chromatogrammes, l’intensité a été comparée et discutée plus bas.

La largeur des pics de chaque Promix a été comparée. Comme observé, la médiane, qui donne un renseignement sur le milieu de la série, est constante entre chaque analyse de Promix et se trouve à environ 0,5 minutes. La médiane est la ligne noire présente dans les différentes boîtes à moustaches. Ceci montre que la largeur des pics reste constante tout au long de l’analyse.

Un autre aspect intéressant est de comparer la précision en masse. Elle est exprimée en ppm (partie par million) et est importante pour déterminer et identifier les molécules. La bonne résolution est un critère important pour avoir une bonne précision. les boîtes à moustaches des différents Promix par rapport à leur erreur sur la masse. Comme observé, la médiane est constante entre chaque boîte à moustaches. Ceci prouve que l’appareil est resté stable durant la totalité du temps d’analyse.

Pour finir, l’intensité des différents pics sur chaque chromatogramme a été étudiée. Pour ce faire, chaque Promix a été comparé avec le Promix 1 (ratio intensité Promix/intensité Promix 1). Un histogramme a ensuite été créé afin de comparer les différents Promix entre eux. L’intensité destrois premiers chromatogrammes (Promix 2, 3 et 4) est relativement similaire. En effet, la pointe de l’histogramme ce rapproche de 0. En ce qui concerne l’intensité des deux derniers Promix (Promix 5 et 6), elle est plus élevée. Comme observé sur le graphique ci-dessous, la pointe des courbes grises et jaunes sont décalées vers la droite. Une autre observation est que l’intensité globale à diminué pratiquement d’un facteur deux entre le Promix 1 et 6. Ceci peut être dû à la solution de Promix qui est restée la même durant toute l’analyse.

L’intensité est le paramètre comparé qui varie le plus mais n’est pas primordiale à l’analyse des résultats. En effet, si un peptide est identifié dans plusieurs échantillons différents, c’est surtout grâce à son temps de rétention et sa masse qui sont similaires. Après avoir comparé les différents chromatogrammes des Promix, il est donc possible de dire que l’analyse était stable du début à la fin.

Statistiques

Lors de l’analyse, 441’270 spectres MS/MS ont été générés. Sur ces spectres, 163’270 ont pu être identifiés. A l’aide de MaxQuant, un logiciel qui traduit les spectres à l’aide d’une base de donnée, il a était possible d’identifier 13’616 peptides qui viennent de quelques 2’656 protéines. Ces données ont été générées avec un FDR < 1% (False discovery rate). Le FDR signifie la proportion attendue d’erreur de type I (rejeter l’hypothèse nulle alors qu’elle est vraie) parmi les hypothèses rejetées. une fois phosphorylé (1p), deux fois phosphorylés (2p) et plus de deux fois phosphorylés (> 2p) présents sur la quantité totale de peptides uniques obtenus.

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Table des matières

1. Introduction
1.1 Phosphorylation
1.1.1 Protéine phosphatase 2A
1.1.2 C2-Ceramide et SH-BC-893
1.2 Stratégie
1.2.1 SILAC
1.2.2 Enrichissement en phosphopeptides
1.2.3 Séparation par échange d’ions
1.3 Spectrométrie de masse
1.3.1 Nano LC-MS
2. Matériels et Méthodes
2.1 Matériels
2.1.1 Equipement
2.1.2 Produits chimiques
2.1.3 Colonnes
2.1.4 Molécules biologiques
2.1.5 Culture cellulaire
2.2 Méthodes
2.2.1 Culture cellulaire
2.2.1.1 Culture cellulaire
2.2.1.2 Passage des cellules
2.2.1.3 Traitement des cellules
2.2.1.4 Collecte de cellules
2.2.2 Extraction et purification des protéines
2.2.2.1 Lyse des cellules et extraction des protéines
2.2.2.2 Digestion enzymatique
2.2.2.3 Purification et concentration
2.2.2.4 BCA Assay
2.2.2.5 Enrichissement des phosphopeptides
2.3 Méthodes analytiques
2.3.1 Chromatographie d’échange d’ion
2.3.2 Chromatographie liquide
2.3.2.1 Préparation d’échantillon
2.3.2.2 Colonne
2.3.2.3 Système de séparation LC
2.3.3 Spectrométrie de masse
2.3.3.1 Solution test: Promix
2.3.4 Software
3. Résultats et Discussion
3.1 Système de contrôle
3.2 Statistiques
3.3 Cinétique
3.4 Sites de phosphorylation dynamiques
3.5 SH-BC-893 vs C2-ceramide
4. Perspectives
5. Conclusion
6. Bibliographies
7. Annexes