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La chromatographie
La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d’affinités des substances à analyser à l’égard de deux phases, l’une stationnaire ou fixe, l’autre mobile. Les constituants de l’échantillon à analyser sont entraînés à travers la phase stationnaire par le flux d’une phase mobile gazeuse ou liquide, et les séparations résultent de la différence entre les vitesses de propagation des diverses substances. En chromatographie :
– la phase stationnaire est une phase qui reste en place soit dans une colonne soit sur une surface plane. Elle peut être solide silice,( alumine…) ou liquide.
– La phase mobile est une phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire en entrainant l’analyte avec elle.
On peut classer les méthodes chromatographiques selon :
La nature des deux phases
– Phase mobile: gaz ou liquide
– Phase stationnaire : solide pulvérisé ou liquide immobilisé sur un support solide
Le procédé d’immobilisation de la phase chromatographique
– Sur colonne
– Sur papier
– Sur couche mince
Les modalités de migration de la phase mobile
– Par développement
– Par élution
La polarité relative des deux phases
– Chromatographie en phase mobile
– Chromatographie en phase inversée
Le phénomène chromatographique
– Chromatographie d’adsorption
– Chromatographie de partage
– Chromatographie par échange d’ions
– Chromatographie d’exclusion
Chromatographie sur Couche Mince (CCM)
Le terme chromatographie vient du mot grec Khroma, atos signifiant « couleur ». Elle repose principalement sur des phénomènes d’adsorption. La C.C.M. est un procédé de microanalyse utilisant une phase stationnaire poreuse le long de laquelle une phase mobile entraîne à vitesse inégale suivant une direction déterminée, les substances à séparer. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants qui progresse par capillarité le long d’une phase stationnaire déposée en un film très adhérent sur une plaque de verre ou sur une feuille d’aluminium ou de plastique semi-rigide. Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à leur propre vitesse, derrière le front du solvant.
La vitesse de migration est fonction de l’affinitédes constituants vis à vis de la phase liquide mobile et/ou de la phase fixe adhérant au support chromatographique.
La CCM s’effectue de manière descendante, radiale ou ascendante. Cette dernière est la plus utilisée.
Selon leurs affinités pour les deux phases, chaquesubstance occupe de façon distinguée une position appelée référence frontale qui est lerapport entre les distances parcourues, depuis les points d’applications, par la substance et le solvant.
Validation d’une méthode d’identification par CCM (13)
Valider c’est apporter des preuves que la méthode est adaptée à ses objectifs. La validation d’une méthode d’identification fait partie de l’assurance qualité d’un produit que ce soit un produit fini ou un extrait brut. Elle est utilisée dans plusieurs domaines : pharmaceutique, environnemental, agro-alimentaire, médical, industriel et dans le cadre de la toxicologie.
Le but de la validation d’une méthode d’identification est de démontrer qu’une procédure d’analyse correspond à l’usage pour lequel elle est prévue.
La validation d’une méthode commence par la préparation de l’échantillon et se termine par les résultats. Le développement de méthode et sa validation sont inséparables car une méthode mise au point ne peutêtre utilisée comme méthode de référence dans les procédures de contrôle de qualité.
Lors de la validation d’une méthode d’identification, les critères suivants sont à étudier (9) :
Stabilité
Spécificité /sélectivité Fidélité
Robustesse
Stabilité
La stabilité du composé à analyser doit être préalablement démontrée pour les conditions expérimentales étudiées. C’est une étudepréliminaire qui démontre la capacité des analytes de l’échantillon à analyser de garder leurs propriétés caractéristiques.
Spécificité
La spécificité d’une méthode d’analyse est sa capacité à permettre l’évaluation sans équivoque de l’analyte parmi les autres constituants de l’échantillon.
Elle permet d’établir que le signal mesuré dans lesconditions opératoires étudiées provient uniquement de l’analyte.
Fidélité
C’est l’étroitesse de l’accord entre une série de mesures obtenues à partir de plusieurs prises d’essai provenant d’un même échantillon homogène, dans des conditions prescrites.
Elle peut être considérée à 3 niveaux:
– Répétabilité
La répétabilité est la fidélité obtenue dans des nditionsco identiques (même analyste, même équipement, mêmes réactifs…) et se assep dans un court intervalle de temps.
– Fidélité intermédiaire
Elle exprime la fidélité sous des conditions variables à l’intérieur d’un même laboratoire (analystes différents, mêmes équipements, mêmes réactifs, conditions expérimentales identiques).
– Reproductibilité
Elle exprime la fidélité sous des conditions variables (analystes différents, équipements différents, mêmes échantillons, conditions expérimentales identiques). Elle est réalisée avec des essais inter-laboratoires.
Robustesse
La robustesse d’une méthode se définit par la capacité de la méthode à ne pas être affectée par de faibles variations de ses paramètres comme cela peut se produire dans un laboratoire durant l’utilisation prolongée en contrôle de routine (température, humidité relative, cuve utilisée, distance parcourue par le solvant,..)
Identification par caractérisation des stomates
Un stomate est constitué par deux cellules réniformes : les cellules stomatiques et les cellules annexes dont la disposition est caractéristique d’une espèce. Son rôle est d’assurer les échanges gazeux entre la plante et son milieu extérieur. Selon la pharmacopée européenne, cette caractéristique est nuoutil complémentaire aux autres techniques d’identification (chimique) d’une plante .
Selon la Pharmacopée Européenne, on distingue 4 types de stomates :
1- Type anomocytique (cellules irrégulières): les stomates se trouvent entourés d’un nombre variable de cellules qui ne diffèrent en aucune façon des cellules de l’épiderme en général.
2- Type anisocytique (cellules inégales) : les stomates sont normalement entourés par 3 cellules annexes dont l’une est nettement plus petite que les autres.
3- Type diacytique (cellules transversales) : les stomates sont accompagnés par 2 cellules annexes dont les parois communes font un angle droit avec les cellules de garde des stomates.
4- Type paracytique (cellules parallèles) : les stomates possèdent de chaque côté une ou plusieurs cellules annexes parallèles à l’axe lo ngitudinal de l’ostiole et des cellules de garde des stomates.
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Table des matières
I- INTRODUCTION
II- GENERALITES
II.1. Définitions
II.2. La chromatographie (11) (12)
II.3.Validation d’une méthode d’identification par CCM (13)
Stabilité
Robustesse
II.4. Identification par caractérisation des stomates (14)
II.5.Présentation des plantes
II- 5.1. Aphloia theiformis (15-24)
Position systématique
Description botanique
Répartition géographique
Utilisations traditionnelles
Constituants chimiques (21, 22 , 23 ,24)
II.5.2. Mangifera indica (2, 25-28)
Constituants chimiques (28)
II.6. Mangiferine ou aphloiol (26-30)
III. MATERIELS ET METHODES
III.1. Matériels
· Matériels végétaux
Verreries et appareillages
Produits et réactifs chimiques
III.2. Méthodes
· Séchage du matériel végétal
· Extraction
· Préparation du produit de référence standard
· Préparation des réactifs (43)
· Préparation de l’éluant
· Chromatographie sur couche mince (CCM) (44, 45)
· Évaluation
IV. RESULTATS
IV.1. Chromatographie de mangiferine, de A. theiformis MBR et de M. indica
IV.2. Stabilité
IV.2.1.Stabilité de l’analyte dans la solution et sur la plaque
IV.2.2.Stabilité de l’analyte durant la chromatographie
IV.2.3. Stabilité du chromatogramme après dérivatisation par l’anisaldéhyde sulfurique
IV.3. Spécificité
IV.3.2. Détection d’adultérant
IV.4. Fidélité
IV.4.1. Répétabilité
IV.4.2. Précision intermédiaire
IV.5.1. Évaluation de la robustesse selon le type de la cuve
V. DISCUSSION
VI. CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
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