Cellules CD34+ infectées par le shDOK2 ou le shSCR (contrôle)

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Cytogénétique- Génétique

L’analyse cytogénétique de la moelle osseuse de patients atteints de LMMC a permis de montrer qu’environ 20 à 30% d’entre eux présentaient une anomalie de leur caryotype dont les plus fréquentes sont la trisomie 8, la perte du chromosome Y, la monosomie 7, et les délétions ou insertions des chromosomes 20q, 12p, 7q et 13q 12. Cependant, aucune de ces anomalies n’est spécifique de la LMMC et elles sont souvent retrouvées dans les syndromes myélodysplasiques 13.
Au cours des cinq dernières années, l’analyse génétique des cellules tumorales a montré qu’il existait en moyenne quatorze gènes mutés dans le clone leucémique d’une LMMC 14–16. Elle a permis d’identifier parmi ceux-ci les gènes mutés de façon récurrente. Il s’agit de gènes impliqués:
– dans la régulation de l’épigénétique : méthylation (DNMT3A) ou déméthylation de l’ADN (TET2, IDH1 et IDH2), modification des histones (ASXL1, EZH2, UTX, SETBP1),
– dans l’épissage alternatif (SRSF2, ZRSR2, U2AF35, SF3B1, LUC7L2) 17
– dans la signalisation cellulaire (CBL, N-RAS, K-RAS, JAK2, FLT3, CSF3R),
– et dans la régulation transcriptionnelle (RUNX1, NPM1).
Comme pour les anomalies cytogénétiques, aucune de ces mutations n’est spécifiques de la LMMC, mais les trois gènes les plus souvent mutés sont TET2 (40- 60%), SRSF2 (30- 50%) et ASXL1 (près de 40%). Viennent ensuite les gènes de la voie RAS, comme NRAS ou CBL 3,18. Les premières mutations apparaissant dans la LMMC semblent souvent affecter un gène de l’épigénétique, comme TET2 ou ASXL1, puis un gène de l’épissage ou un gène de la signalisation, mais tous les ordres d’apparition sont possibles. La dominance clonale est précoce, affectant les cellules souches hématopoïétiques CD34+, CD38-, CD90+.
Les mutations s’accumulent ensuite linéairement dans les cellules les plus immatures. C’est ce que l’on appelle l’architecture clonale 14.
Les mutations affectant les voies de signalisation apparaissent souvent secondairement chez une partie des patients générant les formes prolifératives de la maladie. Les cellules les plus mutées ont un avantage lors de la différenciation hématopoïétique et sont majoritaires dans le sang circulant. Si les gènes mutés sont nombreux, seules les mutations d’ASXL1 ont un impact pronostique péjoratif en analyse multivariée.
Indépendamment de ces mutations géniques, l’altération de l’expression de certains gènes par des mécanismes épigénétiques joue probablement un rôle dans la physiopathologie de la LMMC. Une réduction très importante de l’expression du gène TIF1γ, aussi appelé TRIM33, due à une hyperméthylation de son promoteur, a été observée dans les cellules leucémiques de 35 à 40% des patients atteints de LMMC 19. Renforçant cette observation, la délétion du gène tif1γ dans les cellules myéloïdes induit chez la souris de plus de six mois un phénotype de LMMC 20.

Clinique

Sur le plan clinique, la maladie peut être asymptomatique, le diagnostic se faisant fortuitement sur un contrôle de l’hémogramme montrant une monocytose associée ou non à des cytopénies 21. Elle peut également se manifester par divers symptômes qui diffèrent d’un individu à l’autre et ne sont pas spécifiques de la LMMC. Ces symptômes sont le plus souvent en rapport avec les anomalies retrouvées sur l’hémogramme :
– Manifestations en rapport avec les cytopénies
· Anémie : asthénie, dyspnée, pâleur cutanéomuqueuse
· Thrombopénies : manifestations hémorragiques, purpura
· Neutropénie : infections, principalement bactériennes
– Syndrome tumoral, reflet de l’hyperleucocytose : altération de l’état général avec perte de poids, sueurs nocturnes, adénopathies, hépatomégalie, splénomégalie
– Manifestations auto-immunes.
La survie médiane est d’environ deux ans et demi. Le risque d’évolution vers une leucémie aigüe est de l’ordre de 25-30% et c’est une des principales causes de décès 22. Quelques rares patients peuvent présenter de manière inaugurale une LMMC acutisée en leucémie aiguë myéloblastique (LAM). Les autres causes de décès sont le plus souvent les infections en lien avec l’immunodépression, qu’elle soit due à la maladie ou aux traitements, et les hémorragies dues aux thrombopénies parfois profondes.

Pronostic

L’évolution de la maladie est très variable, avec des patients présentant une maladie stable durant plusieurs années alors que d’autres évoluent en quelques mois vers une LAM. Il est donc primordial de trouver des facteurs pronostiques permettant de classer les patients dans différents groupes pronostiques afin de leur proposer le traitement le plus adapté.
Historiquement, le premier score utilisé dans la LMMC est l’International prognostic scoring system (IPSS) et permet de classer les patients en quatre groupes de risque : faible, intermédiaire 1 et 2, et haut risque 23. Cependant ce score, de même que l’IPSS révisé 24, a été établi principalement pour les patients porteurs d’un syndrome myélodysplasique et n’est pas adapté à tous les types de LMMC, notamment les formes prolifératives.
En 2013, plusieurs scores spécifiques de la LMMC ont été proposés :
– Celui de la Mayo Clinic, avec comme facteurs de risque un taux élevé de monocytes, une hyperleucocytose, une anémie et une thrombopénie 25,
– Le CPSS (CMML-specific prognostic scoring system), avec comme facteurs de risque retenus la classification FAB et OMS, la dépendance transfusionnelle et la cytogénétique 26,
– Le score pronostique proposé à partir de l’analyse d’une cohorte de patients du Groupe Francophone des Myélodysplasies 18, la validation ayant été faite sur la cohorte allemande MLL 4. Ce score inclut pour la première fois les mutations génétiques retrouvées dans la LMMC, et retrouve ASXL1 comme facteur indépendant de survie et de transformation en LAM en analyse multivariée. L’âge, le taux d’hémoglobine, de leucocytes et de plaquettes sont retrouvés comme marqueur pronostic en analyse univariée. Ce score permet de séparer trois groupes distincts de patients atteints de LMMC en termes de survie globale et de survie sans progression. Ce score a récemment été confirmé sur une cohorte de la Mayo Clinic 27.
En 2015, une étude multicentrique regroupant 1832 patients a été réalisée afin de pallier le manque de puissance des études précédentes du fait de faibles effectifs 3. Elle retrouve la mutation d’ASXL1 comme facteur pronostique indépendant et identifie une nouvelle mutation pronostique, la mutation de CBL. Elle propose également un taux de blastes médullaires à 7.5% plutôt qu’à 10% pour différencier la LMMC-1 de la LMMC-2.

Traitement

Sur le plan thérapeutique, aucun consensus n’existe actuellement : les différentes options possibles sont envisagées en fonction de l’état général du patient, du type de LMMC, des scores pronostiques et de l’agressivité de la maladie.
L’abstention thérapeutique est la première option en cas de LMMC de type1 sans symptôme clinique, stable sur le plan biologique.
Les soins de support (transfusions d’érythrocytes ou de plaquettes, érythropoïétine, facteurs de croissance leucocytaire) sont proposés de manière systématique, afin de réduire les symptômes en rapport avec les cytopénies.
Un traitement cytoréducteur, comme l’hydroxyurée 28, est à envisager lorsque la LMMC prend une forme proliférative.
Récemment il a été proposé d’utiliser une chimiothérapie par agent déméthylant en cas de maladie évolutive 29, comme l’azacytidine et la décitabine. Ces traitements s’intègrent à l’ADN durant la phase S, et inhibent les DNA méthyltransférases 30–32. Malheureusement, moins de la moitié des patients atteints de LMMC répond à ce traitement 30,33 et il faut plusieurs mois avant d’en évaluer l’efficacité.
Aucune mutation somatique n’est prédictive de la réponse à ce type de chimiothérapie 29. Un profil moléculaire et transcriptionnel a récemment été décrit pour cibler les patients pour lesquels ce type de traitement serait efficace 30. En effet, il existe un profil épigénétique distinct entre les patients répondeurs et les patients non répondeurs. Chez les répondeurs, les gènes impliqués dans le cycle cellulaire sont activés, améliorant ainsi la mise en contact des drogues avec l’ADN, alors que la résistance aux agents déméthylants est associée à une hyperexpression de CXCL4 et CXCL7, impliqués dans l’arrêt du cycle cellulaire et la résistance à certaines chimiothérapies 34,35. En Europe, une étude randomisée de phase III vient d’être initiée pour évaluer l’efficacité de la décitabine par rapport à l’hydréa chez des patients atteints de LMMC avec deux critères de sévérité.
Lors du suivi des patients traités par agent déméthylant, la cytométrie de flux montre que les patients répondeurs retrouvent une répartition normale de leurs trois populations monocytaires. Ceci pourrait donc être un marqueur biologique de réponse aux agents déméthylants 10.
Le seul traitement curatif de la LMMC est l’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques 9,36. Ce traitement est la première option pour les patients jeunes avec facteurs de mauvais pronostic. Cependant, il n’est que rarement réalisé du fait de l’âge avancé des patients atteints de LMMC, et le taux de rechute et de mortalité liée au traitement est plus élevé que pour les autres hémopathies malignes (survie totale de 30 à 40% 37–39). Les traitements reçus précédemment à l’allogreffe ont permis d’éradiquer la plus grande partie des cellules tumorales, mais n’ont pas éliminé les cellules les plus mutées, qui sont celles en causes dans les rechutes et sont donc chimiorésistantes. Plusieurs familles de nouveaux médicaments ont été testées dans la LMMC, jusqu’alors sans grand succès : il s’agit des inhibiteurs de farnesyltransférase 40, des inhibiteurs de la voie MEK et des inhibiteurs des histones déacétylases33,41–43 . D’autres voies de développement sont envisagées comme les molécules ciblant les inhibiteurs de l’apoptose de la famille Bcl-2 et les inhibiteurs de la signalisation susceptible d’éteindre STAT5 44.
Une récente étude internationale a proposé des critères communs de réponse aux traitements chez les patients atteints de LMMC afin de standardiser les prochains essais cliniques et d’optimiser leurs résultats 45. Ces critères de réponse sont visibles en Annexe1.

Les cellules myéloïdes suppressives (MDSC)

Définition

Les cellules myéloïdes suppressives (Myeloid-Derived Suppressor Cells ou MDSC) forment une population hétérogène de cellules myéloïdes immatures. Elles ont d’abord été étudiées dans les modèles murins. Une très faible fraction peut se retrouver dans la moelle osseuse ou les organes lymphoïdes secondaires des sujets sains, mais leur accumulation est toujours pathologique et se retrouve principalement dans des modèles de cancers solides comme le carcinome ovarien 46, le cancer colo-rectal 47, ou en cas d’immunosuppression. La présence et l’accumulation de ces cellules est associée à un mauvais pronostic 48,49.
Chez l’homme, très difficiles à détecter chez les sujets sains, elles s’accumulent dans le sang de patients atteints de tumeur solide (adénocarcinome pancréatique 50,51, carcinome rénal 52,53), en cas de sepsis ou de maladie auto-immune 49, par exemple lors des maladies inflammatoires de l’intestin 54. Dans les hémopathies malignes, elles ont récemment été identifiées  dans le sang de patients atteints de leucémie myéloïde chronique ou de myélome multiple 55–57.
De manière pathologique, ces cellules s’accumulent dans le sang, dans les organes lymphoïdes secondaires et au niveau des tumeurs 58,59.
Le phénotype membranaire des MDSC n’est ni homogène, ni absolument spécifique. Les marqueurs CD33+ et CD11b+ sont constants 49. Les autres marqueurs permettent de distinguer deux sous-types principaux de MDSC:
– le sous-type monocytaire, définit par les marqueurs membranaires CD14+/CD15- /HLA-DR+,
– le sous-type granulocytaire, définit par le phénotype CD14-/CD15+/CD24+ /CD16-/HLA-DR-. D’autres sous-types, macrophagiques ou dendritiques, ont récemment été identifiés 60.

Mécanisme d’action

Les MDSC prolifèrent en réponse à des cytokines sécrétées par les cellules tumorales ou les lymphocytes T, comme le SCF, le M-CSF, le GM-CSF, et à l’interféron γ, à l’Interleukine 4 (IL-4) ou à la cyclo-oxygénase2 55,56,60,61. Ces facteurs peuvent inhiber la différenciation et accroître la survie de ces cellules en activant des voies de signalisation impliquant les kinases de la famille Janus-Activated Kinase (JAK) et le facteur de transcription STAT3 62. Ces facteurs induisent aussi la synthèse, par les MDSC d’origine monocytaire, d’ARGINASE1 ou d’oxyde nitrique (NO) via l’activation de la NO synthase inductible (iNOS) (Schéma 1). Ces deux enzymes – ARGINASE et NOS – ont comme substrat la L-arginine, acide aminé nécessaire aux lymphocytes, et jouent un rôle majeur dans l’immunosuppression des lymphocytes T par les MDSC. La diminution de la L-arginine dans les lymphocytes T CD8+ activés aboutit à un défaut de leur prolifération et à leur blocage en phase G0-G1, via la diminution de l’expression de la chaîne CD3ζ du TCR 63.
D’après N. Droin. CD : classe de différenciation ; MDSC : cellule myéloïde suppressive ; NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-oxidase ; NO : oxyde nitrique ; iNOS : NO synthase
inductible ; RLO : radicaux libres de l’oxygène.
Ces facteurs peuvent également stimuler la production de radicaux libres de l’oxygène (RLO) par les MDSC d’origine granuleuse. Ces RLO entrainent des modifications du CD8 et de la chaine ζ du CD3, entraînant un disfonctionnement du TCR et inhibant ainsi la réponse lymphocytaire T spécifique (Schéma 1).
Enfin, la présence de MDSC est habituellement associée à une élimination des lymphocytes T cytotoxiques, mais aussi à une expansion des lymphocytes T régulateurs 60.
Que ce soit dans les tumeurs solides ou les hémopathies malignes, la présence de MDSC confère généralement à la maladie un pronostic péjoratif, en termes de survie et de réponse au traitement. Ces MDSC sont donc des cibles thérapeutiques potentielles, et des molécules comme le 5-fluorouracil ou les inhibiteurs de la cyclo oxygénase 2 sont actuellement testées hez les patients atteints de cancer solide pour inhiber ces MDSC 60.

 Les MSC dans la LMMC

Sur le plan physiopathologique, on rappelle que la LMMC est définie par une monocytose sanguine, souvent associée à une polynucléose neutrophile en cas de leucocytose. Il y a quelques années, N. Droin et al. a montré que les cellules identifiées cytologiquement comme des monocytes comportaient une fraction variable de cellules granuleuses immatures et dysplasiques, absentes chez les sujets sains du même âge 64. Ces cellules sont caractérisées par les marqueurs membranaires CD14-/CD24+/ CD15+/ CD16-/HLA-DR-. Sur le plan moléculaire, ces cellules immatures expriment des taux élevés d’ARN messager codant pour des facteurs de transcription granulocytaire GFI-1, C/EBPε et CSF3R, tandis que les facteurs PU.1, EGR-1, EGR-2, c-FMS (CSF1R), marqueurs de la lignée monocytaire, sont peu exprimés.
Ces cellules CD14-/CD24+ synthétisent et sécrètent des quantités importantes d’alpha-défensine 1-3 (HNP1-3), qui inhibent la différenciation macrophagique des monocytes exposés au M-CSF via le récepteur purinergique P2Y6.
Ces cellules dysplasiques ont la propriété de tuer les cellules T autologues activées par un mécanisme impliquant la production de radicaux libres de l’oxygène via l’activation de la NADPH oxydase. Cette immunosuppression dépend d’un contact cellulaire et est inhibée par la N-acétylcystéine (NAC) (Schéma 2).
Ces cellules granuleuses immatures répondent à la définition des cellules myéloïdes suppressives (Myeloid-Derived Suppressor Cells ou MDSC) décrites ci-dessus. Les analyses génétiques indiquent qu’elles font partie intégrante du clone leucémique de la LMMC.
D’après N. Droin. CD : classe de différenciation ; HNP1-3 : alpha-défensine 1-3 ; M-CSF : macrophage colony stimulating factor ; MDSC : cellule myéloïde suppressive ; NAC : N-acétylcystéine ; NADPH : nicotinamide adénine dinucléotide phosphate-oxidase ; RLO : radicaux libres de l’oxygène.

La protéine DOK2

La famille des protéines DOK

La protéine DOK2 appartient à la famille des protéines DOK (Downstream Of Kinase) qui est composée de sept membres, DOK1 à DOK7 65. Ce sont des protéines adaptatrices qui se situent en aval de récepteurs à tyrosine kinase. Elles interagissent avec différents partenaires protéiques au sein de voies de signalisation intracellulaire. Ces protéines partagent des domaines communs sur le plan structurel (schéma 3) :
– Un domaine PH (Plekstrin Homology domain) qui permet le recrutement des protéines DOK à la membrane cellulaire par interaction avec les phospholipides membranaires. Ceci apparait indispensable pour que ces protéines adaptatrices puissent se lier à leurs partenaires.
– Un domaine PTB (PhosphoTyrosine Binding) qui permet la liaison aux tyrosines phosphorylées.
– Des régions riches en tyrosines phosphorylées, interagissant avec les protéines à domaine SH2 (Src Homology).
Les protéines DOK n’ont pas de domaine catalytique. En se liant à divers partenaires protéiques, elles s’intègrent dans les voies de signalisation intracellulaire en aval des récepteurs à tyrosine kinase de nombreux types cellulaires. Elles se comportent comme des régulateurs négatifs ou positifs de ces voies, selon leur localisation cellulaire 66,67.
L’expression de ces protéines varie en fonction des tissus :
Les protéines DOK1, DOK2 et DOK3 sont exprimées principalement dans les cellules hématopoïétiques. DOK1 est exprimée dans les cellules myéloïdes et lymphoïdes B et T.
DOK2 est exprimée dans les cellules myéloïdes et lymphoïdes T 65, DOK3 n’est pas exprimée dans les cellules lymphoïdes T 67.
Les protéines DOK4, DOK5 et DOK6 se retrouvent dans cellules neuronales 68,69. La protéine DOK7 est exprimée dans les cellules cardiaques et les cellules des jonctions neuromusculaires 65,70.
Leur rôle est différent en fonction de leur localisation cellulaire :
Les protéines DOK1, DOK2 et DOK3 agissent essentiellement comme régulateur du système immunitaire et ont été définies à de nombreuses reprises comme potentiels suppresseurs de tumeurs 71–73.
Les protéines DOK4 et DOK5 activeraient les voies de signalisation neuronales et auraient un rôle dans la différenciation des neurones 68,comme DOK6 69.DOK7 serait essentiel au niveau de la synapse neuromusculaire par son interaction avec MuSK (muscle specifik receptor kinase)70.

Rôle de DOK2

Le gène Dok2 a été initialement étudié chez le modèle murin, conjointement à Dok17273. En effet, l’inactivation d’un seul des deux gènes n’entraine pas de phénotype particulier chez la souris alors que l’inactivation simultanée des deux gènes Dok1 et Dok2 entraine des anomalies multiples au cours de l’évolution.
Sur le plan physiopathologique, les protéines DOK1 et DOK2 inhibent les voies de signalisation en aval de récepteurs à tyrosine kinase : récepteurs à l’antigène comme le BCR (B Cell Receptor), le TCR (T Cell Receptor), et récepteurs de cytokines comme le M-CSF ou le GM-CSF. Une fois le récepteur activé, leur domaine riche en tyrosines phosphorylées interagit avec le domaine SH2 de protéines partenaires, en particulier p120RasGAP.
Cet inhibiteur de RAS possède une activité GTPasique et son interaction avec les protéines DOK1 et/ou DOK2 a pour conséquence une inhibition de la voie RAS-MAPK (Mitogen-
Activated Protein Kinase) 65. Ceci est démontré par l’invalidation simultanée de Dok1 et Dok2 chez la souris qui provoque une activation excessive de la voie RAS-MAPK et de la voie PI3K/Akt (Phosphatidylinositol-3-kinase). Les protéines DOK1 et DOK2 interagissent aussi avec d’autres protéines par leur domaine PTB, comme SHIP-1, ABL.
Ainsi elles ont un rôle de régulateur du système immunitaire et inhibent la signalisation du TCR 74.
Sur le plan clinique, l’inactivation simultanée des deux gènes Dok1 et Dok2 chez la souris entraine des adénocarcinomes pulmonaires précoces 75, des sarcomes histiocytiques 76, et des syndromes myéloprolifératifs. Ces gènes peuvent donc être considérés conjointement comme des suppresseurs de tumeur.
Le gène DOK2, localisé sur le chromosome 8 (8p21.3), a été récemment étudié seul chez l’homme dans l’adénocarcinome pulmonaire 75 et le cancer gastrique 77.
Dans l’adénocarcinome pulmonaire, sa sous expression, probablement par un phénomène d’haplo insuffisance, est retrouvée chez un tiers des patients et est associée à un mauvais pronostic. Sa surexpression, à l’inverse, inhibe la prolifération tumorale 75. Sa sous expression est également un facteur de mauvais pronostic dans les cancers gastriques, où l’on observe une augmentation des récurrences et une diminution de la survie après résection curative 77.
Ainsi le gène DOK2 seul pourrait être considéré comme un gène suppresseur de tumeur chez l’homme, et ne nécessiterait pas forcément la participation conjointe de DOK1 comme cela est observé chez la souris.

Les protéines DOK et la LMMC

Il existe plusieurs modèles murins générant chez la souris vieillissante une hyperleucocytose (monocytose principalement) induisant une splénomégalie, et reproduisant en partie les caractéristiques de la LMMC humaine 20,78. Parmi ces modèles, la double invalidation des gènes Dok1 et Dok2 (Dok1-/- Dok2-/-) génère un syndrome myéloprolifératif avec monocytose 72,73. Sur le plan biologique, on observe une prolifération accrue des cellules myéloïdes associée à une diminution de l’apoptose. Au niveau physiopathologique, on constate une activation excessive des voies RAS-MAPKinases et PI3Kinase-Akt.
En analysant ce modèle, notre équipe a observé que les cellules qui s’accumulent avec l’âge sont surtout des cellules granuleuses Ly6G+ que des monocytes Ly6C+, et que ces cellules granuleuses possèdent des propriétés immunosuppressives pouvant les apparenter à des MDSC. Leur caractère immature est difficile à affirmer chez la souris, mais cette observation a conduit à évoquer l’hypothèse d’une dérégulation de l’expression des gènes DOK1 et/ou DOK2 chez certains patients atteints de LMMC ayant des MDSC.

Prérequis et problématique

Les travaux antérieurs réalisés au sein du laboratoire ont mis en évidence plusieurs faits :
1. La présence, dans le sang des patients atteints de LMMC, de MDSC appartenant au clone leucémique. Ces MDSC sont de type granulocytaire car ils expriment CD24, CD15 et n’expriment pas CD14 ni CD16, HLA-DR, VEGFR ou CD16 (Figure 1.A). Elles expriment l’arginase, la MPO et S100A9 (Figure 1.B). Elles exercent une activité immunosuppressive vis-à-vis des lymphocytes T via un contact intercellulaire. Ce mécanisme est RLO dépendant et il est réversible par la N-acétyl-cystéine (Figure 2). Les MDSC inihbent également la différenciation des monocytes en macrophages via la sécrétion d’ α-défensines et de HNP1-3 (Schéma 4)64.

Table des matières

I. Introduction 
A. La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC)
B. Les cellules myéloïdes suppressives (MDSC)
C. La protéine DOK2
D. Prérequis et problématique
II. Matériels et méthodes 
A. Culture, infection et différenciation des cellules CD34+
B. Patients atteints de LMMC
C. Statistiques
III. Résultats 
A. Cellules CD34+ infectées par le shDOK2 ou le shSCR (contrôle)
B. Patients atteints de LMMC
C. Conséquences de la sous expression de DOK2 sur les caractéristiques de la LMMC
D. Expression de DOK2, MDSC, prolifération et survie
IV. Discussion 
A. La diminution d’expression de DOK2 est un facteur pronostique dans divers cancers
B. La diminution de DOK2 dans les cellules hématopoïétiques favorise leur prolifération et affecte leur différenciation
C. Les formes prolifératives de LMMC sont de mauvais pronostic
D. La diminution de DOK2 est associée à l’accumulation de MDSC
E. La diminution de l’expression de DOK2 est d’origine épigénétique
F. L’observation d’une baisse de DOK2 ouvre des perspectives thérapeutiques
V. Conclusion

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