Soutenance mémoire
La leucaphérèse
Plusieurs acteurs vont être déterminants à la réussite de la leucaphérèse. Cela passe d’abord par une bonne coordination entre le centre de fabrication et le centre de traitement du patient.
De plus le patient doit être informé qu’à tout moment la procédure de leucaphérèse peut être réalisée une seconde fois si la production initiale avait échoué. En effet des difficultés peuvent survenir à plusieurs stades de ce protocole de par sa complexité, les délais qu’il nécessite et la coordination des différents acteurs, entraînant parfois des échecs de fabrication malgré une bonne maitrise de cette technologie [7].
La leucaphérèse est un prélèvement qui s’effectue sur plusieurs heures (2 à 3h) à l’aide d’un appareil qui va séparer par centrifugation continue les leucocytes des autres cellules (globules rouges, monocytes, plaquettes résiduelles) qui seront réinjectées au patient.
Les leucocytes sont ensuite congelés puis envoyés au site de production agrée aux bonnes pratiques de fabrication. La congélation peut être faite par un site intermédiaire mais elle est faite en systématique.
Des mesures de précautions sont prises chez les enfants durant la procédure de leucaphérèse.
En effet chez ces derniers le volume de sang prélevé est faible et ils sont plus susceptibles de faire une hypothermie ou une hypocalcémie. Par conséquent le débit de prélèvement est plus lent par rapport aux adultes [17].
Toute chimiothérapie ou traitement immunosupresseur est arrêté dès que possible avant la leucaphérèse pour permettre un prélèvement maximum de cellules T.
Activation et transduction cellulaire
Les lymphocytes T sont triés à partir de la leucaphérèse après décongélation sur le site de production.
Une fois les cellules T récoltées, elles sont activées par l’utilisation simultanée de billes portant des anticorps anti CD3 et anti CD28. Ces billes peuvent ensuite être facilement retirées de la culture cellulaire par séparation magnétique [7].
Pendant la phase d’activation cellulaire, les lymphocytes T vont être incubés avec le vecteur viral contenant du matériel génétique sous forme d’ARN codant les CARs. Contrairement aux cellules CAR-T qui doivent être fabriqués pour un patient donné, le vecteur peut être fabriqué en grandes quantités et être stocké ensuite pour une utilisation ultérieure.
Deux jours après l’incubation du vecteur viral en question, il est récolté dans le surnageant par ultracentrifugation avant d’être utilisé pour transfecter les lymphocytes du patient. La transfection aboutit à une intégration du génome du CAR dans le lymphocyte T. S’effectue ensuite une transcriptase inverse de l’ARN en ADN puis celui-ci sera intégré de manière permanente dans le génome cellulaire du patient. Le CAR est ensuite traduit puis exprimé à la surface de la cellule. Quelques jours après, le vecteur viral est éliminé de la culture cellulaire par dilution [7].
Les vecteurs viraux les plus utilisés pour la fabrication des cellules CAR-T sont les gammaretrovirus et les lentivirus. Le lentivirus, par exemple, est le vecteur viral utilisé pour la production du Kymriah® et du Yesacarta®.
Expansion cellulaire
L’expression des CAR est maintenue au fur et à mesure que les cellules se divisent et se multiplient en grand nombre dans le bioréacteur en présence de cytokines (IL-7, IL-15). Un volume d’environ 5 L(volume qui dépend du procédé de fabrication) est atteint à la fin de l’expansion cellulaire, volume qui sera ensuite adapté en fonction de la réelle quantité nécessaire à perfuser au patient. Ce temps de production ex-vivo varie entre 10 et 28 jours suivant la méthode [7].
La dose de cellules CAR-T efficace à perfuser au patient est en général poidsdépendant. Il n’y a pas à ce jour de dose optimale connue.
Les cellules lavées, concentrées, sont ensuite cryoconservées puis seront libérées après la réalisation de plusieurs tests de contrôles qualités qui seront détaillés par la suite.
La cryoconservation est un stockage des cellules CAR-T à de très basses température (-120°C < T < -150°C) afin de garder leur viabilité. A ces températures extrêmement basses, toute activité biologique est suspendue, y compris les réactions biologiques qui provoqueraient la mort cellulaire.
Tests de contrôle qualité
Des tests de contrôles qualité sont réalisés d’une part sur le produit fini et d’autre part sur le vecteur utilisé pour transduire les lymphocytes T.
En effet l’optimisation du vecteur qui sera utilisé avant le début de la fabrication à grande échelle est une étape cruciale pouvant impacter l’efficacité du produit fini. Sa fabrication doit se dérouler dans un lieu de production conforme aux bonnes pratiques de fabrication (BPF).
Il est donc important de s’assurer par des tests divers, de la stérilité, la pureté, l’activité et l’identité de chaque lot de vecteurs. Ils doivent répondre aux normes définies par le centre de fabrication avant d’être utilisés pour transduire les lymphocytes T [18].
En ce qui concerne les tests de stérilités, ils constituent une étape cruciale car les cellules CAR-T une fois produites ne peuvent pas subir de stérilisation par filtration. Ainsi la production des vecteurs se fait en conditions aseptiques, et se termine par une filtrationstérilisante et une purification, avant d’être cryoconservés.
Par ailleurs, la conception des vecteurs viraux doit inclure des caractéristiques permettant de prévenir toute réactivation virale, en particulier la ré-acquisition de compétences de réplication.
L’utilisation de vecteurs viraux implique des obligations de suivi à long terme des patients traités par des autorités de santé. La FDA (Food Drug Administration) exige par exemple un suivi de plus de 15 ans de ces patients.
Quant au produit fini, des tests sont également effectués et permettront de s’assurer que le produit est conforme aux spécifications de l’AMM. Le pourcentage de lymphocyte T CD3+ dans le produit, la mesure de l’activité, la réalisation de tests phénotypiques ou encore de tests de viabilité, de stérilité et de fonctionnalité des cellules en sont des exemples. Cependant certains de ces tests peuvent s’effectuer sur plusieurs jours, retardant ainsi la libération et donc l’administration des cellules CAR-T au patient.
Enfin, après la libération, les cellules congelées sont transportées puis décongelés au centre ou le patient sera traité [17].
Coordination avec l’usine de fabrication
La maladie du patient, doit être prise en charge pendant la fabrication des cellules CAR-T.
Pour cela il peut être amené à recevoir une chimiothérapie d’attente et une fois que le produit fini est prêt, le patient doit être préparé pour le recevoir. Une communication étroite est donc nécessaire entre le centre où le patient est traité et le site de production pour s’assurer que la fabrication des cellules est terminée au moment approprié.
En effet le patient va bénéficier d’une chimiothérapie lymphodéplétive (c’est-à-dire la diminution des lymphocytes en circulation) composé principalement de cyclophosphamide et/ou fludarabine [19] [20]. Et celle-ci va avoir pour rôle de réduire au maximum la toxicité pour les organes lorsque les cellules CAR-T seront injectées et d’améliorer l’efficacité et la persistance des cellules injectées [5].
Le patient est placé en milieu stérile lors de l’aplasie qui en résulte.
Le temps qui s’écoule entre la chimiothérapie lymphodéplétive et la perfusion des cellules CAR-T à proprement parler doit être minutieusement planifié. Cette chimiothérapie lymphodéplétive est réalisée environ 2 à 7 jours avant l’injection des cellules CAR-T [21].
Donc la coordination du centre de traitement du patient avec l’usine de fabrication est une étape critique permettant de s’assurer de l’acheminement de cellules fabriquées pour le patient dans les meilleures conditions possibles.
Gestion de l’élimination des déchets
De par les modifications génétiques apportées aux cellules pour obtenir un médicament de thérapie génique, les cellules CAR-T appartiennent à la catégorie des OGMou Organisme Génétiquement Modifié. L’introduction artificielle de gènes va conduire à la production de protéines qui attribuent de nouveaux caractères à l’organisme génétiquement modifié. Etant un OGM, les conditions de manipulation et le circuit d’élimination des déchets doivent être conformes à la classification retenue.
Cette classification est le résultat de l’évaluation conjointe de deux instances, le Ministère de la Recherche et de l’Enseignement Supérieur et de l’Innovation(MESRI) ainsi que le Haut Conseil des Biotechnologies (HCB) et est mentionnée dans un avis valide 5 ans [18].
Le HCB est une organisation scientifique qui émet des avis sur toutes questions relatives aux biotechnologies, dont les OGM. Il évalue le risque lié à l’utilisation de l’OGM et se prononce sur l’impact sur l’environnement et la santé publique. Cet avis de classement et de confinement de l’OGM est sollicité par le laboratoire pharmaceutique et cette classification se fait selon 4 niveaux de risque (de I à IV) en fonction du risque pour la santé publique, l’environnement et leur pathogénicité. Ces quatre niveaux correspondent au niveau de confinement de l’OGM. Plus le niveau de confinement est élevé plus les locaux devront être adaptés et spécialisés.
Le MESRI quant à lui se charge de délivrer l’agrément d’utilisation de l’OGM pour la mise en œuvre d’une utilisation confinée d’un OGM, aux sites hospitaliers concernés. Cet agrément est sollicité par les centres hospitaliers et porte sur les procédures expérimentales, les locaux, les équipements.
Ces derniers vont ensemble évaluer les spécificités de l’OGM, les risques pour l’environnement et la santé publique[12].
Le laboratoire doit donc fournir au MESRI un dossier technique sur l’OGM et sur la recherche afin d’obtenir l’avis de classement desa thérapie génique. Le HCB quant à lui est en charge d’évaluer le risque de dissémination et le niveau de dangerosité de l’OGM en établissant des mesures de confinement qui sont des conditions particulières pour la manipulation de l’OGM et de la surveillance du patient dans un milieu spécifique.Aucune mesure de confinement des patients traités par les cellules CAR-T n’est exigée. Ces derniers appartiennent à la catégorie de confinement numéro 1.Celle-ci est définie comme « constituée d’opérations mettant en œuvre des organismes génétiquement modifiés du groupe 1 et dont le risque pour la santé humaine et pour l’environnement est nul ou négligeable».
Les virus utilisés pour la transduction des lymphocytes in vitro sont défectifs et ne peuvent se répliquer in vivo après administration des cellules CAR-T.
Cet OGM ne présente donc pas de risque dissémination dans l’environnement, mais toutefois il y a certaines règles à respecter conformément à la classification retenue pour cet OGM [22].
L’élimination des déchets issus de la préparation du médicament CAR-T doit se faire en utilisant la filière DASRI (Déchets d’Activité de Soins à Risque Infectieux). En effet ces déchets seront placés dans des containers adaptés avec un étiquetage mentionnant qu’il s’agit d’un OGM en cas d’impossibilité d’inactivation sur place par un traitement chimique ou physique validé.
Ces modalités d’élimination des déchets s’appliquent à tous les acteurs intervenant dans la réception, le stockage transitoire, la délivrance et l’administration du médicament[5].
L’administration et le maintien du patient doivent être effectués en chambre de confinement TL1 ce qui correspond à des chambres conventionnelles et aux procédures habituelles en milieu hospitalier.
Les établissements hospitaliers traitant les patients par ces thérapies géniques appartenant à la catégorie des OGM, ne sont plus dans l’obligation depuis Mars 2020 de fournir un dossier faisant l’état des lieux de chaque service par lequel doit transiter l’OGM, pour pouvoir recevoir un agrément d’utilisation de cet OGM, dèslors que cette utilisation s’inscrit dans le cadre thérapeutique de l’AMM[23].
Deux médicaments de thérapie génique appartenant à la catégorie d’OGM, du fait de la modification rétrovirale des lymphocytes T, sont actuellement utilisés en milieu hospitalier. Il s’agit du Kymriah® et du Yescarta® que nousallons décrire plus précisément ci-dessous.
Kymriah® et Yescarta ® : deux thérapies cellulaires et géniques de type CAR-T
Présentation de Kymriah® et Yescarta®
Tisagenlecleucel, Kymriah® (Laboratoire Novartis) et axicabtagene ciloleucel, Yescarta® (Laboratoire Gilead) sont deux médicaments de thérapie génique qui ont reçu une autorisation de mise sur le marché de la Food and Drug Administration (FDA) aux Etats-Unis, le 30 Août 2017 pour Kymriah® et le 18 Octobre 2017 pour Yescarta®, sur la base de résultats d’études de phase II représentant un nombre relativement réduit de patients.
L’EMA (European Medicines Agency) a accordé une Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) européenne centralisée un an plus tard, à la fin du mois d’août 2018 pour ces deux thérapies.
En France, deux autorisations temporaires d’utilisation (ATU) de cohortes ont initialement été délivrées par l’Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM) en Juillet 2018. Aujourd’hui ces deux médicaments sont commercialisés et ne sont plus accessible via l’ATU. Les prix suivants ont été fixés et apparaissent sur le journal officiel: 327 000 euros pour le Yescarta® et 297 666 euros pour le Kymriah® [13]. Kymriah® et Yescarta® sont des cellules CAR-T de 2 nde génération constituées de lymphocytes T autologues, génétiquement modifiées ex vivopar transduction rétrovirale pour exprimer le récepteur chimérique à l’antigène (CAR) ciblant la protéine CD19, une cible de choix.
Efficacité dans le Lymphome diffus à grandes cellules B
Deux essais cliniques de phase II, multicentrique, non comparatif, JULIET et ZUMA-1 ont été menés respectivement par le laboratoire Novartis (chez 147 patients) et le laboratoire Gilead (chez 111 patients).
L’objectif principal était d’évaluer l’efficacité et la sécurité d’emploi des cellules CAR-T essentiellement chez des patients adultes présentant un lymphome diffus à grandes cellules B récidivant ou réfractaire.
Essai clinique JULIET
Dans l’étude JULIET, sur les 147 patients, 99 (67%) ont été traités par Kymriah® dont 92 à partir d’un médicament provenant du site de fabrication américain et 7 du site européen.
La quasi-totalité des patients (92%) ont reçu un traitement dans l’attente de l’administration de Kymriah® (en raison des délais depuis la détermination de l’éligibilité du patient à un traitement par CAR-T jusqu’à l’acheminement du traitement au patient pour perfusion)[55].
Tous les patients étaient atteints de LDGCB à un stade majoritairement avancé avec un pronostic défavorable. La moitié des patients étaient en rechute et l’autre moitié était réfractaire. Les patients avaient reçu dans la majorité des cas au moins 2 lignes de traitements anticancéreux et près de la moitié avait reçu au moins une autogreffe de cellules souches hématopoïétiques.
L’analyse a porté sur la cohorte principale, à savoir 81 patients parmi les 99 patients ayant reçu le traitement et disposant d’un suivi d’au moins 3 mois[56]. Avec un suivi médian de 5,6 mois, le pourcentage de réponse tumorale a été de 53% dont 39,5% de réponse complète.
Après 8 mois d’observation, il a été démontré que la réponse persistait et que le profil de sécurité était toujours maintenu sans apparitions de nouveaux signes de rechute. Ainsi 40% des patients ont obtenu une réponse complète et 12% ont eu une réponse partielle 15 mois après le traitement.
Quant à la probabilité de survie globale, elle a été estimée à 12 mois à 40%.
Essai clinique ZUMA-1
Sur les 111 patients inclus dans l’étude, 101 (91%) ont reçu l’administration de Yescarta®.
Les patients avaient un LDGCB (76%) ou un lymphome médiastinal primitif à grandes cellules B (8%) ou un lymphome folliculaire transformé (16%) majoritairement à un stade avancé avec un pronostic défavorable.
Les 101 patients traités par Yescarta® étaient tous considérés comme « réfractaires », principalement réfractaires à une seconde ligne de traitement ou plus (77%), et 21% dans le cadre d’une rechute dans les 12 mois suivant l’autogreffe.
Avec un suivi médian de 8,7 mois, le pourcentage de réponse objective a été de 71% avec 51% de réponse complète.
Les pourcentages de survie globale ont été estimés à 59% à 12 mois et à 49% à 18 mois [57].
Ces résultats démontrent donc la forte efficacité et la réponse durable obtenue plus d’un an après la perfusion des patients [58].
Au total à moyen terme, le taux de réponse prolongée est d’environ 30% à 40% (jusqu’à plus d’un an après le traitement)
Tolérance clinique
Les toxicités sont surtout représentées par le syndrome de relargage des cytokines (SRC) et des troubles neurologiques parfois sévères tandis que d’autres patients développent des cytopénies ou une hypogammaglobulinémie.
Tolérance dans la leucémie aigue lymphoblastique
Dans l’étude ELIANA, sur l’ensemble des patients traités, le pourcentage de patients ayant rapporté au moins un événement indésirable lié au traitement a été de 95,2%, 77,9% pour au moins un EI grave lié au traitement, et 66,4% pour au moins un EI de grade 4. Les EI les plus fréquents (>30% des patients) ont été les suivants : SRC (77,9%) dont la physiopathologie sera détaillée plus bas, de grade 3-4 reporté chez 46% des patients, des hypogammaglobulinémie (38%), fièvres (41,8%), des effets neurologiques de grade 3 chez 13% des patients, une diminution de l’appétit, des neutropénies fébriles (34,2%), céphalées, anémie, vomissement, diminution des plaquettes et une diminution des leucocytes [33] [53].
Tolérance dans le lymphome diffus à grandes cellules B
Dans l’étude JULIETdes événements indésirables de grade ≥ 3 ont été rapportés chez 90% des patients traités par Kymriah®. Le pourcentage d’événements indésirables graves a été de 69%. Au cours des 8 premières semaines suivant l’administration de Kymriah®, le profil de tolérance a été marqué par : le SRC de grade ≥ 3 (57,4%), avec 26,6% des patients qui ont nécessité l’utilisation d’un traitement anti-cytokine tel que le tocilizumab et/ou des corticoïdes, des effets neurologiques de grade ≥ 3 dans 20% des cas, des neutropénies fébriles observées chez 14,8% des patients, des infections de grade ≥3 chez 19% des patients et une hypogammaglobulinémie chez 14% des patients [55] [56].
Dans l’étude ZUMA-1, des événements indésirables de grade ≥ 3 ont été rapportés chez 95% des patients traités par Yescarta®. Le pourcentage d’événements indésirables graves a été de 51%. Au cours de l’étude, trois événements indésirables ont conduit à un décès. Le profil de tolérance est marqué par : le syndrome de relargage cytokinique avec 43% des patients qui ont nécessité l’utilisation d’un traitement anti-cytokine tel que le tocilizumab et/ou des corticostéroides, des effets indésirables neurologiques de grade ≥ 3 avec près d’un tiers des cas, des cytopénies chez 89% des patients, des neutropénies fébriles observées chez un tiers des patients, des infections de grade ≥ 3 chez près d’un quart des patients, une hypogammaglobulinémie chez 19% des patients et une supplémentation en immunoglobulines pour 6 patients [57] [58].
Le SRC ainsi que les neurotoxicités apparaissent comme les effets indésirables les plus graves et les plus fréquents pouvant survenir après l’administration de cellules CAR-T.
Description des effets indésirables principaux
Syndrome de relargage des cytokines (SRC)
Le SRC ou CRS (pour Cytokine Release Syndrome) est attribué à la libération de cytokines (molécules impliqués dans le développement et la régulation des réponses immunitaires) par les lymphocytes ou les monocytes activés.
Le SRC a été associé de façon classique aux perfusions thérapeutiques de MAb (Monoclonal Antibodies), plus particulièrement les perfusions d’anti-CD3 (OKT3), d’anti-CD52 (alemtuzumab), d’anti-CD20 (rituximab). Dans ces conditions, l’apparition des symptômes survient habituellement dans les minutes ou les heures qui suivent le début de la perfusion.
Il correspond plus précisément à un syndrome inflammatoire systémique lié à la prolifération de cellules T activées et des macrophages de l’hôte associé à un relargage de cytokines pro inflammatoires tels que l’interleukine-6 (IL-6).
Il n’existe pas de critères objectifs permettant une définition diagnostique consensuelle du SRC. Le diagnostic est basé sur les signes et symptômes cliniques, en particulier de la forte fièvre, frissons, des myalgies, des arthralgies, des nausées, des vomissements, une hypotension artérielle, des encéphalopathies et une dyspnée. Les SRC ont également été associés à une défaillance d’organe (par exemple hépatique, rénale, cardiaque et pulmonaire).
Il apparait dans les 24h à 10 jours avec un délai d’apparition médian de 3 jours après la perfusion.
Le tableau ci-dessous détaille les différents grades possibles pour le SRC, du grade 1 le moins
sévère jusqu’au grade 5 le plus sévère.
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Table des matières
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
LISTE DES ABBREVIATIONS
Introduction
I- Cellules CAR-T : une thérapie cellulaire et génique innovante
1. Présentation des cellules CAR-T
1.1 Définition et classification
1.1.1 Cellules CAR-T autologues
1.1.2 Cellules CAR-T allogéniques
1.2 Structure et mécanisme d’action des cellules CAR-T
1.2.1 Mécanisme d’action
1.2.2 Structure d’un CAR
1.3 Modalités de production des cellules CAR-T
1.3.1 La leucaphérèse
1.3.2 Activation et transduction cellulaire
1.3.3 Expansion cellulaire
1.3.4 Tests de contrôle qualité
1.3.5 Coordination avec l’usine de fabrication
1.4 Gestion de l’élimination des déchets
2. Kymriah® et Yescarta ® : deux thérapies cellulaires et géniques de type CAR-T
2.1 Présentation de Kymriah® et Yescarta®
2.2 Indications thérapeutiques
2.2.1 Leucémie aigue lymphoblastique (LAL)
2.2.1.1 Epidémiologie
2.2.1.2 Diagnostic
2.2.1.3 Traitements actuels
2.2.2 Lymphome diffus à grandes cellules B (LDGCB)
2.2.2.1 Epidémiologie
2.2.2.2 Diagnostic
2.2.2.3 Traitements actuels
2.3 Efficacité thérapeutique
2.3.1 Efficacité dans la leucémie aigue lymphoblastique à cellules B
2.3.2 Efficacité dans le Lymphome diffus à grandes cellules B
2.3.2.1 Essai clinique JULIET
2.3.2.2 Essai clinique ZUMA-1
2.4 Tolérance clinique
2.4.1 Tolérance dans la leucémie aigue lymphoblastique
2.4.2 Tolérance dans le lymphome diffus à grandes cellules B
3. Description des effets indésirables principaux
3.1 Syndrome de relargage des cytokines (SRC)
3.2 Neurotoxicité
3.3 Cytopénies hématologiques
3.4 Neutropénie fébrile et infections
3.5 Hypogammaglobulinémie
3.6 Syndrome de lyse tumorale
4. Perspectives d’amélioration
II- Cellules CAR-T : conséquences sur l’organisation des centres hospitaliers –mise en application au centre Henri Becquerel
1. Organisation générale du circuit des cellules CAR-T
2. Contexte réglementaire
2.1 Arrêté du 8 août 2019
3. Plan de Gestion des Risques
4. Processus de qualification des centres hospitaliers
5. Organisation générale du circuit au Centre Henri Becquerel de Rouen
5.1 Organisation du prélèvement des cellules servant à la fabrication des cellules CAR-T
5.2 Aphérèse et conservation des cellules
5.3 Rôle du pharmacien dans le circuit
5.3.1 Analyse de la prescription informatique et commandes des cellules CAR-T
5.3.2 Réception des cellules CAR-T
5.3.3 Stockage des cellules CAR-T
5.3.4 Dispensation des cellules CAR-T
5.3.5 Transport dans le service de soins
5.3.6 Elimination des déchets
5.3.7 Déclaration des effets indésirables
5.4 Le tocilizumab dans la prise en charge du SRC
5.4.1 Qu’est-ce que le tocilizumab ?
5.4.2 Efficacité du tocilizumab dans le syndrome de relargage des cytokines
5.5 Collaboration avec le service de réanimation et de neurologie
5.6 Organisation d’un test à blanc
III – Quelles conséquences pour les autres centres hospitaliers ?
1. Problématique et objectif
2. Matériel et méthode
3. Résultats
3.1 Résultats des questionnaires destinés aux médecins
3.1.1 Indication de cellules CAR-T
3.1.2 Aphérèse des cellules
3.1.3 Production des cellules CAR-T par le laboratoire pharmaceutique
3.1.3 Administration du traitement
3.1.4 Gestion des effets indésirables
3.1.5 Suite de prise en charge
3.2 Résultats des questionnaires destinés aux pharmaciens
3.2.1 Commande du médicament
3.2.2. Réception des cellules CAR-T
3.2.3 Cryoconservation des cellules CAR-T
3.2.4 Décongélation des cellules CAR-T
4. Discussion
Conclusion
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
ANNEXES
