Caséines du lait

Caséines du lait

Stabilité des micelles de caséines

Les micelles de caséines présentent une grande stabilité due à deux facteurs principaux :

•La charge de surface : au pH du lait, les micelles de caséines portent de nombreuses charges négatives qui créent des répulsions électrostatiques entre les micelles qui ne s’agrègent pas.

•La forte hydratation : les micelles fixent 3.4 g d’eau par g de protéines, une partie de cette eau, située à la surface de la molécule, la stabilise. Les facteurs de variation de la stabilité des micelles de caséines sont la température et le pH (Vierlling, 2008).

La caséine κ est un agent stabilisateur de la micelle, elle favorise la stabilité de la micelle de deux façons. Tout d’abord, prises individuellement et en présence du calcium, les caséines αs1, αs2 sont insolubles et la caséine β n’est soluble qu’entre 0-4 o C. L’association de ces caséines avec la caséine κ est une condition essentielle à leur dispersion en présence du calcium (Holt et Horne, 1996). Ensuite, la caséine κ possède deux régions qui sont séparées lors de l’hydrolyse du lien Phe105 -Met106 lors de l’hydrolyse par la chymosine. La partie Nterminale se nomme para- CN-κ et est de nature hydrophobe, elle demeure attachée à la micelle, alors que la partie C-terminale de la CN-κ est le caséinomacropeptide (CMP), de nature hydrophile et chargée négativement. La partie CMP s’étend dans le sérum et forme le chevelu micellaire d’une épaisseur de 5 à 10 nm (Dalgleish, 1998). Ce dernier participe à la stabilisation des micelles par répulsion électrostatique et stérique (Brulé et al., 1997). La protéine qui perd le chevelu micellaire par hydrolyse n’a plus la capacité de stabiliser les autres caséines (Amiot et al., 2002). La caséine κ est également la seule caséine à avoir des résidus glucidiques dans sa constitution. La nature et l’emplacement de ces glucides sont responsables de l’hétérogénéité de sa structure. La glycosylation n’a pas de rôle spécifique mais renforce le caractère hydrophile de la partie C-terminale en plus d’augmenter l’encombrement stérique à la surface de la micelle (Brulé et al., 1997). L’grégation des micelles de caséine soit peut-être induite par l’utilisation d’enzymes protéolytiques, les conditions acides, les traitements de chaleur et la gélification causée par le vieillissement (Filion, 2006).

Classification et taxonomie

Depuis la découverte des bactéries lactiques, leur classification a connu plusieurs modifications. La première classification des bactéries lactiques basée sur les propriétés observables à savoir les propriétés morphologiques, biochimiques et physiologiques a été établie en 1919 par Orla-Jensen qui rassembla les membres des bactéries lactiques dans un même groupe. (Stiles et Holzapfel 1997). Les marqueurs chimio-taxonomiques tels que les compositions des acides gras et les constituants de la membrane cellulaire, ont été aussi utilisés pour la classification (Konig et Frohlich, 2009). Les nouveaux outils pour l’identification et la classification des bactéries lactiques remettent couramment et/ou complètent les méthodologies traditionnelles basées sur les phénotypes. La classification s’appuie sur des données moléculaires comme la comparaison des séquences codant pour les ARN16S ribosomiques qui a entrainé des changements importants dans la taxonomie des bactéries lactiques (Salminen et al., 2004 ; Ho et al., 2007; De Vos et al., 2009) . Selon la dernière édition de Bergey’s manual of systematic bacteriology (2009), les bactéries lactiques sont classées dans le phylum des Firmicutes, la classe des Bacilli et l’ordre des Lactobacillales renfermant trente-cinq genres répartis sur six familles. Parmi ces genres , seulement douze sont utilisés dans la biotechnologie alimentaire, il s’agit de : Aerococcus , Carnobacterium , Enterococcus , Lactobacillus , Lactococcus , Leuconostoc , Oenococcus , Pediococcus , Streptococcus , Vagococcus , Tetragenococcus , Weissella (Drider et Privost, 2009).

Rôles technologiques des bactéries lactiques

Certaines bactéries lactiques sont capables de produire des composés d’arômes qui participent aux qualités organoleptiques des fromages. La plupart des composés d’arôme sont issus du métabolisme du citrate (Hugenholtz et al., 2002). Certaines souches ont la capacité de synthétiser et d’excréter, au cours de leur croissance, des polymères de sucre appelés polysaccharides exocellulaires ou EPS, qui permettent d’améliorer la texture et la viscosité du produit fini. En général, la présence de polysaccharides dans des produits fermentés, tels les yogourts, permet d’augmenter l’homogénéité du produit et rend sa présentation plus agréable (Ruas-Madiedo et al., 2002).Les bactéries lactiques jouent également un rôle essentiel dans la conservation des produits alimentaires, elles sont capables de produire une variété de produits inhibiteurs dont les effets peuvent se répercuter sur la flore lactique elle-même mais aussi sur la flore indésirable ou pathogène (florèz et al., 2008). Les acides organiques sont produits lors du processus de fermentation et permettent d’inhiber la croissance des levures et d’autres bactéries qui ne peuvent se développer à pH acide. L’effet inhibiteur de ces acides organiques est principalement provoqué par les molécules non dissociées qui diffusent à travers les couches lipidiques des membranes des microorganismes provoquant ainsi un abaissement du pH dans le cytoplasme qui a pour conséquence la déstabilisation des cellules (Slover et Danziger, 2008). La production et l’accumulation de peroxyde d’hydrogène créent un environnement toxique pour les cellules non équipées de systèmes de protection capable de dégrader ce composé. Son accumulation est inhibitrice vis-à-vis des souches qui génèrent le peroxyde mais aussi vis-à-vis d’autres microorganismes (De Roissart et Luquet, 1994).

Exigences en sels minéraux

Les principaux éléments requis sont le magnésium et le manganèse, ils jouent un rôle important dans la nutrition des Lactobacillus (Mazali, 1992 ; Letrot et Juillard, 2001). Le magnésium est le principal cation divalent des cellules vivantes. Il intervient dans les systèmes de transport intra-membranaires, et serait indispensable pour la croissance de Lb helveticus et essentiel pour celle de Lb lactis et Lb delbrueckii (Desmazeaud, 1992). Le magnésium est un activateur des différentes réactions métaboliques (division cellulaire, stabilisation des acides nucléiques ou hydrolyse peptidique) (Corrieu et Luquet., 2008). Le manganèse est nécessaire à la structure et le fonctionnement des enzymes, et à la détoxification des cellules mises en présence de l’oxygène, notamment chez Lb plantarum (Desmazeaud, 1992). Le fer n’a pas d’action générale sur la croissance ou sur la production d’acide lactique (Boyaval, 1989). Le calcium intervient au niveau membranaire, lors de l’efflux de lactate formé lors de la fermentation lactique, il y a formation d’ATP par une ATPase membranaire dépendante du complexe Ca2+ / Mn2+ (Konings et Otto, 1983). Le potassium joue un rôle important dans la régulation du pH intracellulaire. Cet ion est exigé pour la croissance de Lb helveticus, Enterococcus faecalis et Lb casei. Le sodium exerce un effet sélectif sur les différentes espèces de bactéries lactiques. Des souches résistantes au sel peuvent être isolées de laits crus salés (jusqu’à 120 g/l) ou de fromages salés comme le Domiati Egyptien : elles appartiendraient aux genres Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus (El-Gendy et al., 1983). Le zinc présente un effet positif pour la croissance de certains lactobacilles, mais il est toxique à forte concentration (Corrieu et Luquet, 2008).

Table des matières

Liste des abréviations
Liste des figures
Liste des tableaux
Introduction
Synthèse bibliographique
1.1. Caséines du lait
1.1.1. Constitution de la caséine totale
1.1.1.1. La caséine αS1
1.1.1.2. La caséine αS2
1.1.1.3. La caséine β
1.1.1.4. La caséine κ
1.1.2. Propriétés Générales Des Caséines
1.1.2.1. Polymorphisme génétique
1.1.2.2. Composition en acides aminés
1.1.2.3. Phosphorylation
1.2. La Micelle De Caséine
1.2.1. Composition et propriétés
1.2.2 Structure
1.2.2.1. Modèle avec sous-unités
1.2.2.2. Modèle à dualité des liens
1.2.3. Caractéristiques physicochimiques de la micelle de caséine
1.2.3.1. Diamètre micellaire
1.2.3.2. Hydratation
1.2.3.3. Minéraux
1.3. la stabilité des micelles de caséines
1.4. Généralités sur les bactéries lactiques
1.4.1. Caractéristiques générales des bactéries lactiques
1.4.2. Habitat
1.5. Classification et taxonomie
1.5.1. Le genre Lactobacillus
1.5.2. Le genre Lactococcus
1.6. Intérêt des bactéries lactiques
1.6.1. Dans l’industrie alimentaire
1.6.2. Dans le domaine thérapeutique
1.6.3. Rôles technologiques des bactéries lactiques
1.7. Exigences nutritionnelles des bactéries lactiques
1.7.1. Exigences en acides aminés
1.7.2. Exigences en vitamines
1.7.3. Exigences en bases azotées
1.7.4. Exigences en glucides
1.7.5. Exigences en sels minéraux
1.8. La protéolyse chez les bactéries lactiques
1.8.1. Métabolisme azoté des bactéries lactiques ans le lait
1.8.2. Le système protéolytique des bactéries lactiques
1.8.2.1.Les protéases de paroi
1.8.2.1.1. Les propriétés biochimiques et génétiques
1.8.2.1.2. Classification des protéases de paroi
1.8.2.1.3. Intérêt technologique des protéases de paroi
1.8.2.2. Les protéases intracellulaires
1.8.2.3. Les systèmes de transport des acides aminés et des peptides chez les bactéries lactiques
1.8.2.3.1. Les systèmes de transport des acides aminés
1.8.2.3.2. Les systèmes de transport des di/tripeptides
1.8.2.3.3. Les systèmes de transport des oligopeptides
1.8.2.4. Les peptidases
1.8.2.4.1. Classification et propriétés des peptidases
1.8.2.4.2. Intérêt technologique des peptidases
1.8.3. La régulation du système protéolytique
1.9. Intérêt de l’activité protéolytique des bactéries lactiques
1.10. Peptides générés par la caséinolyse et leurs activités biologiques
1.10.1.Peptides à activité antihypertensive
1.10.2. Peptides à activité antithrombotique
1.10.3. Peptides à activité antimicrobienne
1.10.4. Peptides à activité antioxydante
1.10.5. Peptides à activité antidiabétique
1.10.6. Peptides à activité opiacée
1.11. Méthodes d’obtention de peptides bioactifs
1.12. Fractionnement, purification et identification des peptides bioactifs
1.13. Applications commerciales des peptides bioactifs
Matériel et méthodes
2.1. Souches bactérienne utilisées
2.2. Milieux de culture
2.3. Conditions de culture
2.4. Vérification de la pureté des souches et leur appartenance au groupe des bactéries Lactiques
2.5. Conservation des souches pures
2.6. préparation des caséinesa partir du lait cru
2.7. Confirmation de l’aptitude des bactéries à la protéolyse
2.7.1. Recherche de l’activité protéolytique en milieu solide
2.7.2. Recherche des protéases extracellulaires dans le surnageant de culture
2.7.2.1. Préparation des surnagents de culture
2.7.2.1.1. En absence de lait
2.7.2.1.2. En presence de lait
2.7.2.1.3. En présence de caséines
2.7.2.2. Extraction des protéases
2.7.2.2.1. Incubation des cellules en absence d’ions calcium
2.7.2.2.2. Incubation des cellules en présence d’un chélateur d’ions EDTA 15 mm
2.8. Techniques utilisées pour l’étude des protéases
2.8.1. Précipitation des protéases au sulfate d’ammonium
2.8.2.Dialyse
2.8.3. Dosages des protéines par la méthode de Bradford (1976
2.9. Préparation des hydrolysats de caséines
2.9.1. Par les fractions enzymatiques
2.9.2. Hydrolyse acide des caséines
2.10. Evaluation de la protéolyse par méthodes biochimiques
2.10.1. Dosage des produits de dégradation
2.10.1.1. Méthode de Folin et Ciocalteu (1927
2.10.1.2. Méthode de BCA (Bicinchoninic Acid ProteinAssay
2.10.2. Calcul du degré d’hydrolyse
2.11. Techniques d’étude des hydrolysats
2.11.1. Electrophorèse en conditions dénaturantes (SDS-PAGE
2.11.2. Identification des séquences peptidiques des hydrolysats par Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse tandem Spectrométrie de Masse
2.12. Recherche d’activités biologiques liées aux peptides générés
2.12.1. Recherche in-vitro de l’activité inhibitrice sur l’enzyme ECA (enzyme de conversion de l’angiotensine)
2.12.2. Détermination in-vitro de l’activité antioxydante par le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
2.12.3. Détermination in-vitro de l’activité inhibitrice de l’enzyme DPP-IV (dipeptidyl peptidase IV
2.12.4. Recherche de l’activité antibactérienne des hydrolysats
2.13. Analyse statistique
Résultats et discussion
3.1. Vérification de la pureté des caséines totales préparées au laboratoire
3.2. Vérification de la pureté des souches bactériennes
3.3. Confirmation du caractère protéolytique des souches
3.3.1. Activité protéolytique en milieu solide
3.3.2. Détection des protéases extracellulaires dans les surnageants de culture
3.3.2.1. Mise en évidence de l’activité protéolytique sur milieu MA
3.3.2.2. Influence des ions calcium et de l’EDTA sur les protéases liées à la paroi
3.4. Purification partielle des protéases extracellulaires par précipitation au sulfate d’ammonium
3.5. Mise en évidence et caractérisation des peptides dans les hydrolysats de caséines
3.5.1. Mise en évidence des produits d’hydrolyse des caséines par dosage au réactif de Folin-ciocalteu
3.5.2. Mise en évidence des produits d’hydrolyse des caséines par dosage au BCA (Bicinchoninic Acid Protein Assay)
3.5.3. Caractérisation des hydrolysats par le degré d’hydrolyse DH
3.5.4. Analyse des hydrolysats par électrophorèse SDS-PAGE
3.6. Identification et caractérisation des peptides issus de l’hydrolyse des caséines par Chromatographie liquide à haute performance en phase inverse couplée à la Spectrométrie de Masse (RP-HPLC-MS/MS
3.6.1. Séquences peptidiques identifiées dans les hydrolysats de la caséine de brebis
3.6.2. Séquences peptidiques identifiées dans les hydrolysats de la caséine bovine
3.6.3. Séquences peptidiques identifiées dans les hydrolysats de la caséine de chamelle
3.7. Mise en évidence in-vitro des activités biologiques liées aux hydrolysats
3.7.1. Mise en évidence de l’inhibition de l’enzyme ECA (enzyme de conversion de l’angiotensine)
3.7.2. Mise en évidence de l’activité antioxydante
3.7.3. Mise en évidence de l’inhibition de l’enzyme DPP-IV (dipeptidyl peptidase IV
3.7.4. Activité antibactérienne des hydrolysats
Conclusion et perspectives
Références bibliographiques
Annexes

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