Cartographie des souches de PPRV à partir du gène N partiel

Le virus de la peste des petits ruminants

Le PPRV appartient à l’Ordre des Mononegavirales, famille des Paramyxoviridae , sousfamille des Paramyxovirinae qui est divisée en cinq genres distincts (Tableau 2.2). Les Paramyxovirus sont des virus à ARN enveloppé. Ce sont des particules globalement sphériques contenant une enveloppe lipoprotéique externe présentant de multiples projections ; une nucléocapside interne, pelotonnée et filamenteuse, à symétrie hélicoïdale qui entoure le génome viral. Les virus PPRV, RPV,MV, CDV, et PDV sont classés dans le genreMorbillivirus. Tous ces virus sont définis par une communauté morphologique au sein des Paramyxovirus, une grande ressemblance quant aux effets cytopathogènes en culture cellulaire (syncytia, inclusions intra-cytoplasmiques et nucléaires), un aspect histopathologique commun (cellules géantes multinucléées), une forte proximité antigénique (forte homologie entre les protéines des différents membres du groupe), et une certaine spécificité d’hôte. Cette dernière caractéristique est de plus en plus nuancée à mesure de l’avancement des études portant sur les différents virus du groupe.

Une des caractéristiques les distinguant des autres genres (mais commune aux Henipavirus) est l’absence d’activité neuraminidasique ; cette activité neuraminidasique serait toutefois présente chez PPRV et RPV [145]. Sur le plan clinique la forte ressemblance entre la PPR et la RP ainsi que la forte immunité croisée entre leur agent causal, ont souvent conduit à considérer le PPRV comme un variant du virus de la peste bovine (RPV),mieux adapté aux petits ruminants. Cependant, l’isolement du virus en 1962 [62] et les études sur la protection sérologique croisée menées en 1970, ont permis de conclure que le RPV et le PPRV sont deux virus distincts mais très proches [61, 65]. Le PPRV a ainsi été classé en 1979 comme un membre appartenant au genre Morbillivirus dans la famille des Paramyxoviridae. Vers la fin des années 1980, un autre groupe de virus émergents affectant dramatiquement les mammifères aquatiques a été ajouté à ce genre : le virus de la maladie des phoques (PDV), les Morbillivirus des dauphins (DMV), les Morbillivirus des dauphins et marsouins (PMV) [20, 73, 120](Figure 2.2). Récemment, sur la base de données de séquences du génome, un morbillivirus de chat appelé Morbillivirus félin (FmoPV), responsable de la néphrite tubulo-interstitielle chez les chats domestiques a été identifié [169].

Organisation du génome et protéines codées

Organisation du génome Le virus de la peste des petits ruminants (PPRV) est un virus enveloppé, pléomorphe dont la taille varie de 400 à 500 nm. Son génome d’une taille de 15 948 bases, est composé d’une seule molécule d’ARN simple brin de polarité négative étroitement associée à demultiples copies de protéines N, dans une nucléocapside de symétrie hélicoïdale. La réplication du génome est soumise à la « règle de six » qui stipule que les génomes dont le nombre total de nucléotides est un multiple de six sont les mieux répliqués [137]. L’ARN génomique code pour six protéines structurales (N, P,M, F, H, L) et deux protéines non structurales (C et V) (Figure 2.3). Aux extrémités 3’ et 5’ du génome, se trouvent deux régions non codantes de 52 nucléotides (nt) et de 37 nt non traduites (UTR) qui représentent respectivement le ”Leader” et le ”Trailer”.

La transcription et la réplication du virus sont contrôlées par ces deux extrémités. Le leader (positions 1 – 54) et la partie 3’ non codante de la N (positions 55 – 107) constituent le promoteur génomique (107 bases), utilisé par la polymérase virale pour la synthèse des ARNm. La partie 5’ non codante de la polymérase L (positions 15840 – 15908) et le trailer (15909 15948) constituent le promoteur antigénomique (109 bases), utilisé par la polymérase pour la synthèse de l’ARN (+), intermédiaire de réplication du génome viral. Le leader et le trailer ont des séquences inversées complémentaires sur leurs 16 premières bases qui constituent probablement le signal de reconnaissance de la polymérase virale. La région terminale de chaque gène est suivie d’une région conservée de trois nucléotides (GAA) appelée région intergénique (IG). La Région IG est également retrouvée à la jonction des séquences du leader (gène N) et du trailer (gène L). Chaque unité transcriptionnelle est composée d’IG, de séquences non codantes et de séquences conservées qui flanquent la région codante. Elle est synthétisée dans lemode «start-stop»[79].

Protéines codées Les virus à ARN négatif “ARN(-)” (Paramyxovirus,(Orthomyxovirus ,(Rhabdovirus) ont un génome dont la polarité est complémentaire à celle des ARN messagers (ARNm). Les génomes de ces virus ne peuvent donc en aucun cas être utilisés directement par les ribosomes cellulaires pour assurer la traduction. Ces virus utilisent une polymérase codée par le génome viral, il s’agit d’une ARN-polymérase ARN-dépendante qui assure les fonctions de transcription et de réplication du génome. Cette polymérase va synthétiser pour la réplication, un antigénome, l’ARN (+), copie complémentaire de la totalité du génome, qui servira ensuite de matrice pour la production de nouveaux génomes à ARN (-). La transcription quant à elle se fera à partir du génome à ARN (-), la polymérase codée par le virus formera des ARNmsub-génomiques correspondant aux parties codantes de chaque gène. Ces ARNm seront alors pris en charge par les ribosomes cellulaires pour être traduits en protéines.

Le virion de la PPR est composé de 6 protéines structurales : la nucléoprotéine (N), la phosphoprotéine (P), la protéine de matrice (M), la protéine de fusion (F), l’hémagglutinine (H) et l’ARN polymérase ARN dépendante (L). L’ARN génomique est associé à trois protéines virales pour former la ribonucléoprotéine (RNP) : N, P et L, protéines composées respectivement de 525, 509 et 2183 acides aminés (aa). La ribonucléoprotéine (RNP) constitue la structure minimale essentielle pour la transcription et la réplication du génome viral dans le cytoplasme cellulaire. La nucléoprotéine N est la protéine majoritaire de la RNP. Elle forme un manchon protecteur autour de l’ARN génomique et est responsable de la structure hélicoïdale de la nucléocapside. La région centrale de la protéine est engagée dans le processus d’auto-assemblage et d’encapsidation de l’ARN génomique. La phosphoprotéine P interagit avec la protéine N et favorise l’encapsidation des ARN viraux néo-synthétisés. Elle interagit aussi avec la protéine L pour former le complexe de polymérisation de l’ARN polymérase ARN-dépendant, responsable de la synthèse des ARNm et de la réplication de l’ARN viral génomique.

La polymérase L possède toutes les activités enzymatiques nécessaires à la polymérisation de l’ARN, initiation, élongation, terminaison, coiffage, méthylation et polyadénylation. Lors de sa libération, le virus emprunte son enveloppe à celle de la cellule hôte dans laquelle s’insèrent trois autres protéines virales : M, F et H. La protéineM, la plus petite des protéines virales (335 aa) recouvre la face intérieure de l’enveloppe virale et sert de lien entre la nucléocapside et les deux glycoprotéines de surface F et H. Cependant, suite à une étude de cryotomographie électronique Liljeroos et al.,2011 [94] ontmontré que la protéine de matrice deMV forme des hélices de revêtement de la ribonucléocapside plutôt qu’un revêtement du feuillet interne de la membrane comme on le pensait auparavant. Le complexe qui se forme à l’intérieur du cytoplasme est en outre transporté vers la membrane de la cellule hôte dans laquelle les deux autres glycoprotéines d’enveloppe externes, la fusion (F) et l’hémagglutinine (H), sont insérées. La protéine d’hémagglutinine, longue de 609 aa, est une protéine glycosylée qui permet la fixation du virus au récepteur de la cellule hôte. La seconde protéine glycosylée est la protéine de fusion F. Composée de 546 aa, elle est responsable de la fusion entre les membranes du virus et de la cellule hôte. Cette activité n’est acquise qu’à la suite d’un proces- sus dematuration qui aboutit au clivage de F en deux sous-unités F1 et F2. Ce clivage, effectué par une protéase cellulaire, permet de libérer à l’extrémité de F1 un peptide très hydrophobe dit peptide de fusion [104].

Le génome viral code également pour deux protéines non structurales C et V qui ne sont retrouvées que dans les cellules infectées. Leur synthèse est dirigée par le gène de la protéine P. Au cours de la multiplication virale, le gène correspondant à cette protéine est transcrit en deux ARNm. Le premier est une copie exacte du gène. Il est traduit en P (507 aa) à partir du premier codon d’initiation AUG rencontré par les ribosomes de la cellule infectée. Cependant il existe un deuxième codon AUG en aval du premier, en position 23 sur l’ARN, et qui se trouve dans des conditions favorables pour jouer une fonction de codon d’initiation. Il permet la synthèse d’une deuxième protéine C (177 aa) plus petite que P. Le second ARNm du gène P n’est pas une copie exacte du gène car il comporte une base G supplémentaire insérée dans l’ARN au cours de sa synthèse par un mécanisme de bégaiement de la polymérase connu sous le terme « editing ». L’addition de cette base supplémentaire est faite à un point précis de l’ARNm, en position 693. La conséquence de cette insertion est le changement du cadre de lecture de l’ARNm à partir de cette position, générant un nouveau codon stop à la position 894 : ce processus entraîne la synthèse d’une protéine plus courte, la protéine V (298 aa). La protéine C a un rôle dans la transcription et la V, dans la réplication du génome viral. Ces deux protéines interfèrent également avec l’immunité innée en bloquant la réponse interféron (Tableau 2.3) [104].

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Table des matières

Résumé (Français/English)
Liste des figures
Liste des tableaux
Liste des abréviations
1 Introduction
1.1 Contexte justificatif
1.2 Problématique
1.3 Hypothèses et questions de recherche
1.4 Objectifs
1.5 Stratégie d’étude et plan de travail
2 Synthèse bibliographique
2.1 Généralités sur la Peste des petits ruminants
2.1.1 La maladie
2.1.2 Historique – Distribution géographique
2.1.3 Le virus de la peste des petits ruminants
2.1.4 Organisation du génome et protéines codées
2.1.5 Le cycle viral
2.1.6 Signes cliniques – Pouvoir Pathogène
2.1.7 Pathogénie
2.1.8 Diagnostic
2.1.9 Epidémiologie – Hôtes – Transmission
2.1.10 Moyens de lutte
2.2 Répartition géographique
2.3 Filière petits ruminants en Afrique de l’Ouest
2.4 Epidémiosurveillance et contrôle de la PPR en Afrique de l’Ouest
2.4.1 Surveillance épidémiologique en Afrique de l’Ouest
2.4.2 Contrôle de la PPR en Afrique de l’Ouest
2.4.3 Surveillance de la PPR au Sénégal
2.4.4 Contrôle de la PPR au Sénégal
2.5 Etat des connaissances sur l’évolution du génome des virus à ARN
3 Cartographie des souches de PPRV à partir du gène N partiel
3.1 Zone d’étude
3.2 Matériels et méthodes
3.2.1 Collecte du matériel biologique
3.2.2 Analyses de laboratoire
3.2.3 Analyse des séquences et détermination de la lignée géographique
3.3 Résultats
3.3.1 Description des foyers de PPR observés
3.3.2 Description des signes cliniques rencontrés
3.3.3 Isolement du virus à partir d’organes
3.3.4 Profil électrophorétique des produits PCR
3.3.5 Arbre phylogénétique basé sur 255 nucléotides du gène N
3.3.6 Analyse de l’arbre phylogénétique
3.4 Discussion
4 Reconstruction des mouvements géographiques des PPRV
4.1 Introduction
4.2 Matériels et méthodes
4.2.1 Séquençage des gènes N et H
4.2.2 Analyse phylogénétique Bayésienne
4.2.3 Origine et distribution de la lignée II dans l’ouest de l’Afrique
4.3 Résultats
4.3.1 Reconstruction phylogénétique bayésienne
4.3.2 Origine et distribution de la lignée II dans l’ouest de l’Afrique
4.3.3 Phylogéographie
4.4 Discussion
5 Génomes complets et possibilités d’exploitation
5.1 Next generation sequencing of peste des petits ruminants viruses belonging to lineages II, III and IV
5.2 Complete Genome Sequence of a Field Strain of Peste des Petits Ruminants Virus Isolated during 2010-2014 Epidemics in Senegal
5.3 Synthèse
6 Discussion générale – Conclusion Perspectives
Bibliographie
Publications