Carcinomes pulmonaires non à petites cellules (NSCLC)

Carcinomes pulmonaires non à petites cellules (NSCLC)

Matériel et méthodes

Prélèvement des échantillons De 1 à 4 tubes Streck « Cell-Free DNA BCT® CE » ont été utilisés pour les prélèvements de sang, tant sur les volontaires sains que pour les patients atteints de NSCLC, grâce à une collaboration avec le service d’oncologie de l’Hôpital du Valais. Selon les recommandations de la commission cantonale d’éthique de la recherche sur l’être humain (CER-VD), tous les tubes ont été anonymisés, et les patients, ainsi que les volontaires, informés du but du prélèvement (mise au point d’une analyse). Les tubes ont été centrifugés à 4000g pendant 10 minutes à 4°C, puis le plasma a été transféré dans des tubes Falcon 15 mL, et centrifugé à nouveau aux mêmes conditions. L’ADN des volontaires a été utilisé afin de comparer le rendement et la qualité des différents kits d’extraction. Seuls les ctDNA de patients ont par la suite été séquencés, ceci afin d’éviter des découvertes fortuites. Tous les échantillons ont été traités dans un délai maximal de 48h après le prélèvement. Le nombre et le choix des kits testés pour les échantillons s’est fait majoritairement en fonction du volume de plasma obtenu. 2.2. Extraction du ctDNA Un volume de 4 mL de plasma a été utilisé avec les kits « AmoyDx Circulating DNA kit » (Réf : ADx-BL03) de la firme Amoy Diagnostics et « Maxwell RSC ccfDNA Large Volume » (Réf : AX1115) de la firme Promega (sur le robot « Maxwell® RSC Instrument » (Réf : AS4500)). Pour les 2 kits de la firme Qiagen : « QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit » (Réf : 55284) et « QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit » (Réf : 55114), les volumes ont été de 3 à 5 mL selon la quantité de plasma à disposition. Les protocoles complets des kits sont en annexe. Arcioni S. 8/27 Le nombre d’ADN de volontaires, respectivement de patients, extraits avec chacun des kits est le suivant : 14 et 6 avec chacun des kits de Qiagen, 10 et 4 avec le kit d’Amoy Diagnostics, L’ADN circulant a été remis en suspension selon les prescriptions du fabriquant de chaque kit, soit dans un tampon fourni (« QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit », « AmoyDx Circulating DNA kit » et « Maxwell RSC ccfDNA Large Volume ») soit dans de l’eau ultrapure (« QIAamp MinElute ccfDNA Midi Kit »). 2.3. Quantification du ctDNA Plusieurs méthodes ont été appliquées afin de déterminer la quantité d’ADN présente après l’extraction. Dans un premier temps, une quantification de l’ADN avec les kits « Qubit™ dsDNA HS Assay Kit » (Réf : Q32851, limites de détection : 0.010 à 100 ng/µL), pour l’ADN double brin, et « Qubit™ ssDNA Assay Kit » (Réf : Q10212, limites de détection : 0.050 à 200 ng/µL), pour l’ADN simple brin, de la firme Invitrogen a été effectuée en ajoutant 2 à 5 µL d’échantillon au mélange réactionnel, afin de lire la concentration sur un Qubit® 2.0 avec le programme adéquat, selon le protocole du fournisseur. Arcioni S. 9/27 Puis, afin de quantifier ainsi que de déterminer la taille de l’ADN obtenu, 5 µL de chacun des échantillons, mélangés à 15 ou 20 µL de tampon Tris-EDTA, ont été passés sur le Fragment Analyzer™ Automated CE System de la firme Advanced Analytical, avec le kit « dsDNA 905 Reagent Kit » (Réf : DNF-905), et le « Long Array » (Réf : A2300-1250-5580) pour une résolution de 3-5 pb et une LLOD de 0.5 ng/µL. La quantité d’ADN circulant étant très variable, notamment entre les patients en rémission et ceux en récidive, la médiane a été utilisée préférentiellement à la moyenne lors de l’analyse des résultats. 2.4. Détermination de la qualité du ctDNA Afin de connaître également la qualité de l’ADN extrait, deux tests par qPCR ont été réalisés,

Résultats

Après centrifugation et décantation du sang prélevé, l’ADN circulant présent dans les plasmas a été extrait avec l’un des 4 kits à disposition (« QIAamp MinElute ccfDNA », « QIAamp Circulating Nucleic Acid », « AmoyDx Circulating DNA » ou « Maxwell RSC ccfDNA »). 3.1. Quantification du ctDNA Le dosage de l’ADN circulant, simple et double brin, a été réalisé selon plusieurs méthodes, afin d’en déterminer la concentration. 3.1.1. Qubit™ dsDNA HS Assay Kit Tout d’abord, la quantification avec le kit dsDNA HS a donné, pour les volontaires, une médiane entre 0.196 ng/µL (kit « Maxwell RSC ccfDNA ») et 0.919 ng/µL (kit « QIAamp Circulating Nucleic Acid »). Les valeurs extrêmes se sont situées entre 0.434 et 1.29 ng/µL pour le kit « QIAamp MinElute ccfDNA », entre 0.459 et 2.10 ng/µL pour le kit « QIAamp Circulating Nucleic Acid », entre 0.149 et 0.439 ng/µL avec le kit « AmoyDx Circulating DNA » et entre 0.104 et 0.552 ng/µL pour le kit « Maxwell RSC ccfDNA ». En ce qui concerne l’ADN circulant des patients, les médianes ont été déterminées avec les mêmes kits et se sont établies entre 0.369 ng/µl (kit « AmoyDx Circulating DNA ») et 1.01 ng/µL (kit « QIAamp Circulating Nucleic Acid »). Les valeurs minimales ont été semblables aux valeurs obtenues dans le plasma des volontaires. Par contre les valeurs maximales se sont révélées bien plus élevées, s’établissant à 10.7, 17.7, 1.93 et 3.83 ng/µL (kits « QIAamp MinElute ccfDNA », « QIAamp Circulating Nucleic Acid », « AmoyDx Circulating DNA » et « Maxwell RSC ccfDNA », respectivement). Les valeurs obtenues sont récapitulées dans le tableau 5 et illustrées dans les figures 7 et 8 (volontaires sains, respectivement patients). Qubit™ ssDNA Assay Kit La méthode permettant le dosage de l’ADN simple brin détecte également tout l’ADN double brin. Les résultats obtenus ont donc montré des valeurs de concentration médiane plus élevées. La différence a été de l’ordre de 7x plus d’ADN simple brin que la valeur mesurée pour l’ADN double brin. Cela quel que soit le kit d’extraction utilisé. Le test de répétabilité effectué avec 2 à 3 extraits pour chacun des kits (tableau 6), a donné un coefficient de corrélation de Pearson de 99.1% pour les 9 échantillons quantifiés à double.

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Table des matières

Abréviations
1. Introduction
1.1. Carcinomes pulmonaires non à petites cellules (NSCLC)
1.2. Le gène EGFR
1.3. ADN tumoral circulant dans le sang (ctDNA)
1.4. Techniques de détection des mutations
1.4.1. NGS
2. Matériel et méthodes
2.1. Prélèvement des échantillons
2.2. Extraction du ctDNA
2.3. Quantification du ctDNA
2.4. Détermination de la qualité du ctDNA
2.5. Concentration du ctDNA extrait avec Promega
2.6. Séquençage à haut-débit
2.6.1. Amplification d’une partie de l’exon 20 d’EGFR
2.6.2. Amplification des exons 18 à 21 avec le kit Agilent
2.6.3. Amplification d’une partie des exons 20 et 21 d’EGFR
2.6.4. Utilisation de 4 ctDNA synthétiques
2.6.5. Analyse des résultats
3. Résultats3.1. Quantification du ctDNA
3.1.1. Qubit™ dsDNA HS Assay Kit
3.1.2. Qubit™ ssDNA Assay Kit
3.1.3. Fragment Analyzer™ Automated CE System
3.2. Qualité du ctDNA
3.3. Comparaison inter-kits de la quantité absolue de ctDNA
3.4. Amplifiabilité du ctDNA
3.5. Concentration du ctDNA extrait avec Promega
3.6. Séquençage à haut-débit
3.6.1. Amplification des exons 18 à 21 avec le kit Agilent
3.6.2. Détection de la mutation de résistance (p.T790M
3.6.3. Détection de la mutation de référence
3.6.4. Utilisation de 4 ctDNA synthétiques
4. Discussion
4.1. Extraction de l’ADN circulant
4.1.1. Kit « AmoyDx Circulating DNA
Arcioni S.
4.1.2. Kit « Maxwell RSC ccfDNA »
4.1.3. Kits Qiagen
4.1.4. Méthode de quantification
4.2. Séquençage à haut-débit
4.2.1. Amplification des exons 18 à 21 avec le kit Agilent
4.2.2. Détection de la mutation de résistance (p.T790M
4.2.3. Détection de la mutation de référence
4.2.4. Utilisation de 4 ctDNA synthétiques
5. Conclusions et perspectives
6. Remerciements
7. Bibliographie
8. Annexes