Soutenance mémoire
Contaminations des produits cosmétiques et alimentaires
Contaminations bactériennes
Définitions
Découvertes en 1677 par le microscopiste hollandais Antoine Van Leeuwenhoek, les bactéries sont des micro-organismes unicellulaires appartenant au règne des procaryotes (cellule sans noyau). Une cellule bactérienne est constituée d’un chromosome habituellement circulaire et formé d’une double hélice d’acide désoxyribonucléique (ADN) située dans le cytoplasme. Elle est également pourvue d’une enveloppe rigide (paroi) ; c’est un élément essentiel qui assure par exemple sa forme et le maintien de la pression osmotique interne.
D’autres éléments facultatifs peuvent également être présents mais ne sont pas retrouvés chez toutes les bactéries comme par exemple la capsule, le flagelle ou encore le chromatophore. Un schéma simplifié d’une cellule bactérienne est fourni Figure A-1.
Il existe plusieurs types de bactéries qui peuvent être classifiés selon des critères variés tels que : la morphologie, le mode respiratoire, la température de croissance et autres. L’un des critères couramment utilisé repose sur la différence de composition au niveau de la paroi de ces êtres vivants. Elle est mise en avant par la méthode de la coloration de Gram. Les bactéries à Gram négatif (Gram-) possèdent une paroi composée d’une membrane externe (lipopolysaccharides) et d’une fine couche de peptidoglycane (glucides et peptides). Celles à Gram positif (Gram+) se différencient par une paroi dense constituée d’une couche épaisse de peptidoglycane et d’acide téichoïque.
L’une des particularités de ces microorganismes est leur capacité à se reproduire de façon autonome, de manière asexuée et par scissiparité. C’est une division binaire qui s’effectue à partir d’une cellule mère et qui va conduire à la formation de deux cellules filles qui lui sont identiques (matériel génétique, morphologie). Chaque nouvelle cellule pourra également être dupliquée. Ainsi de suite, il y aura croissance et multiplication de colonies (plusieurs cellules) de bactéries dans des milieux propices à leur survie.
Ces organismes unicellulaires vivent principalement selon deux modes. Ils peuvent être retrouvés à l’état planctonique (sous forme de colonies libres), mobiles en milieu liquide.
Mais par ailleurs, ils prolifèrent également sur des surfaces naturelles ou synthétiques, agrégés en micro-colonies au sein d’une matrice polymère extracellulaire : on parle dans ce cas de biofilm. Aparna et al. mentionnent cinq étapes requises pour le développement d’un biofilm : (a) l’attachement réversible, (b) l’adhésion irréversible, (c) la maturation primaire, (d) la maturation et (e) le détachement.
Les facteurs physico-chimiques influençant le développement et la survie de ces espèces sont : la température, le pH, la présence d’eau, la teneur en oxygène ou encore la composition du milieu (apport en nutriments). A titre d’exemple, certaines bactéries (mésophiles) croissent à une température proche de celle du corps humain 37°C. D’autres appelées psychrophiles prolifèrent mieux à des températures de croissance plus faibles (proches de 0°C). Les thermophiles au contraire utilisent des températures plus élevées (45-70°C). Par conséquent, les bactéries sont des espèces ubiquitaires, retrouvées dans toutes les niches écologiques, notamment chez les animaux et les hommes ; précisément elles vivent à l’intérieur de ces êtres vivants (intestins, voies respiratoires) ou encore sur leur peau. Dans les endroits colonisés, ces êtres vont pouvoir jouer des rôles bénéfiques et/ou induire des maladies en tant qu’agents pathogènes.
Par exemple, chez l’humain, le microbiote intestinal apparait comme un élément essentiel de l’organisme avec lequel il vit en symbiose. Il est défini comme « un écosystème complexe » composé d’un ensemble d’êtres unicellulaires, principalement de bactéries mais aussi de virus, de champignons et d’archées . Ces êtres sont hébergés dans l’appareil digestif. Cet écosystème joue des rôles majeurs pour la santé de l’hôte dans lequel il est présent. Plus précisément, il exerce des fonctions physiologiques bénéfiques en participant au développement et à la maturation du système immunitaire . Il contribue également à de nombreuses activités métaboliques dans l’organisme par des processus de dégradation et/ou de fermentation de divers composés (glucides, protéines) . Une diversité des métabolites ainsi créés sera pour la plupart absorbée et utilisée par l’hôte par exemple comme source d’énergie.
Cependant, de nombreuses études mettent en avant l’implication du microbiote intestinal dans diverses pathologies. Parmi ces dernières, il est à noter des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin mais également le cas de cancers, l’obésité et certaines maladiescardiovasculaires.
En s’intéressant plus particulièrement aux bactéries dites pathogènes, ces dernières peuvent contaminer des milieux et des surfaces variées dans de nombreux domaines. Elles sont responsables de maladies plus ou moins graves chez l’homme et représentent un défi majeur de santé publique. De plus, elles peuvent être à l’origine de problèmes techniques dans de nombreux secteurs industriels.
Contaminations dans divers domaines
Divers secteurs industriels tels que le maritime, le pétrole, l’industrie du papier, les entreprises de traitement et de distribution de l’eau ou encore le secteur alimentaire sont fortement impactés par le développement de biofilm au sein de leurs équipements . Cela entraîne de lourdes conséquences techniques au niveau des matériaux utilisés ainsi qu’auniveau des coûts et des rendements de production.
Dans les secteurs maritimes et pétroliers, les surfaces d’équipements telles que : les coques de navires, les capteurs océanographiques, les plateformes offshore sont en contact avec l’eau au cours de leur utilisation. Elles sont ainsi sujettes à la colonisation sous forme de biofilm de macro et micro-organismes marins dont les bactéries. Ces bio-salissures peuvent entraîner des effets négatifs sur les performances des appareillages utilisés ou encore en accélérant leur processus de corrosion. Dans les travaux de C. Compere , il a été observé que le coefficient d’échange de transfert de chaleur d’un tube de titane exposé à de l’eau de mer (pendant 30 jours) diminuait de 50%. Cette baisse d’échange thermique a été provoquée suiteà la formation d’un biofilm de 100 µm d’épaisseur à l’intérieur du tube.
Par ailleurs, les contaminations bactériennes sont également la cause de maladies chez l’homme. Dans le domaine médical, il existe de nombreuses infections dites « nosocomiales » . Elles sont contractées dans des hôpitaux le plus souvent suite à des interventions chirurgicales (pose d’implants par exemple) ou des soins et traitements en service de réanimation . Elles constituent une préoccupation primordiale de santé publique.
En France, « une enquête nationale de prévalence des infections nosocomiales et des traitements anti-infectieux » datant de 2012 a montré que chaque année, un patient hospitalisé sur vingt (soit 5%) contracte une infection dans un établissement de soin. Cela représente environ 800 000 infections par an, qui seraient la cause directe de 4 000 décès. De plus, les traitements et les moyens de lutte contre ces infections entrainent des coûts importants . Lesresponsables sont les germes pathogènes (bactéries, virus, levures) dont majoritairement les bactéries. Les trois agents infectieux le plus souvent identifiés sont : Staphylococcus aureus (S.aureus) (Gram+), Escherichia coli (Gram–), et Pseudomonas aeruginosa (Gram–). A titre d’exemple, Staphylococcus aureus est impliqué dans de nombreuses pathologies nosocomiales telles que des infections de plaies chroniques, respiratoires (pneumopathie), oculaires ou encore des endocardites . Ces maladies sont contractées suite à la formation de biofilm sur les surfaces de dispositifs médicaux invasifs tels que les cathéters veineux ou encore des valves cardiaques mécaniques.
Nous allons maintenant nous intéresser aux contaminations de produits quotidiennement utilisés par les humains, précisément dans les domaines alimentaires et cosmétiques.
Les bactéries dans les formulations aqueuses cosmétiques et alimentaires
Les aliments consommés par les hommes sont variés et se divisent en sept grands groupes : les produits laitiers et sucrés, les féculents, les fruits et légumes, les viandes et poissons, les lipides et les boissons. Dans le but d’innover et de s’adapter à la demande des consommateurs, de nombreuses industries développent et commercialisent des produits comestibles à partir de divers aliments par exemple sous forme de formulations aqueuses. Ces dernières se présentent comme des mélanges liquides homogènes ou des émulsions stables présentant des textures variées (crèmes pâtissières, cocktails de fruit, soupes).
La plupart des aliments comestibles, dont les formulations aqueuses, sont sujets à des contaminations biologiques d’origine bactérienne. Ces dernières peuvent survenir lors de la production, du traitement industriel, du conditionnement et de la distribution, de l’utilisation ou encore de la conservation des produits . Elles sont favorisées par la présence d’éléments minéraux (l’eau, le sel) et organiques (les glucides, acides aminés) à l’intérieur des produits alimentaires. En effet, ces composés sont essentiels à la nutrition des bactéries et influencent leur croissance au sein des produits . Selon la revue de W. H. Sperber , d’une manière générale une réduction de l’activité de l’eau est néfaste à la croissance des bactéries. L’activité de l’eau (aw ) se définit comme un paramètre caractérisant la disponibilité d’eau libre dans un produit. C’est une valeur sans unité comprise entre 0 (sécheresse absolue) et 1 (100% humidité relative). Comme illustré sur la Figure A-2, l’auteur précise que dans un premier temps, la diminution de a w(<1), entraine un accroissement bactérien dans le milieu.
Un taux maximum de développement est ensuite atteint pour des valeurs d’aw comprises entre [0.990-0.995] dans le cas de nombreuses bactéries. En second lieu, pour des valeurs de a w de plus en plus faibles, le taux de croissance diminue jusqu’à ce que le minimum d’activité d’eau (variable selon les espèces) soit atteint.
A titre d’exemple, S.aureus (Gram+) présente un maximum a w = 0,99 et un minimum a w = 0,83. Salmonella (Gram -) présente un awmaximal (> 0,99) et un minimum égal à 0,94.
Toxicité des conservateurs et des antioxydants
Depuis quelques années, l’utilisation de certains conservateurs et d’antioxydants synthétiques est un sujet controversé. En effet, de nombreuses études mettent en avant la possible toxicité de ces molécules vis-à-vis de la santé humaine.
En prenant l’exemple des parabènes, ces composés sont soupçonnés d’être des perturbateurs endocriniens . Darbre et al. précisent que les composés de la famille des parabènes exercent une activité oestrogénique. Ces molécules vont pouvoir agir comme des ligands en se liant aux récepteurs des œstrogènes (hormones sexuelles) puis imiter les actions de ces dernières dans le corps. L’auteur indique que ces propriétés oestrogéniques ont largement été démontrées dans la littérature suite à de nombreux essais in vitro (24 sur un total de 25) et in vivo (23/30) réalisés sur des animaux (souris, rats) ou des tissus humains. Il met également en relation ces activités et leur possible influence sur le développement decancers du sein ou de la peau. Les antioxydants tels que le BHA et le BHT sont suspectés d’être cancérigènes. Ito et al. ont testé le pouvoir cancérigène du BHA sur des rats mâles et femelles. Ces derniers ont suivi un régime alimentaire contenant du BHA (forte dose) pendant plusieurs semaines. Ils ont été comparés avec des rats témoins, ayant consommés des nourritures dépourvues de BHA. Au bout de 112 semaines, tous les rats encore vivants ont été tués et examinés. Les auteurs ont observé dans le cas des animaux dont les aliments contenaient du BHA, la présence de tumeurs (hyperplasie, carcinome, papillome) dans leur pré-estomac. Dans le cas des rats témoins (mâles ou femelles), aucun changement n’a été observé au niveau de leur pré-estomac.
Un autre problème récurrent et concernant les conservateurs et les antioxydants est leur caractère allergène. Gultekinet et al. expliquent que la consommation d’aliments contenant du BHA et du BHT pourrait conduire au déclenchement de l’urticaire. Le contact direct de la peau avec des produits contenant ces molécules entrainerait l’eczéma de contact.
Les formaldéhydes ainsi que les produits libérateurs de formaldéhyde (ex : le quaternium 15, la diazolidinyl urée, le 2-Bromo-2-nitropropane-1,3-Diol (Bronopol)) sont également connus comme des allergènes.
Résistance aux antibactériens
Par ailleurs, de nombreux secteurs sont touchés par le problème de la multi-résistance des bactéries face aux antimicrobiens. Depuis longtemps, l’usage abusif et/ou les prescriptions incorrectes d’antibiotiques dans le domaine médical ainsi que la forte utilisation de ces derniers (agents préventifs) dans l’alimentation animale au sein des élevages contribuent à une augmentation de la résistance des bactéries aux antibiotiques . Parmi les pathogènes Gram+, les exemples de S.aureus résistant à l’antibiotique méticilline ou encore les espèces Entérocoques résistantes à plusieurs antibiotiques dont la vancomycine peuvent être cités. Les Gram– tels que P.aeruginosa ou Acinetobacter représentent des menaces encore plus sérieuses car ils ont acquis des résistances à presque tous types d’antibiotiques actuellement disponibles. Par conséquent, les traitements de nombreuses maladies infectieuses deviennent inefficaces. Cela entraine des taux de mortalité et des coûtséconomiques importants. Ces caractères d’adaptation des bactéries s’étendent également à des molécules biocides qui sont utilisées comme conservateurs ou désinfectants dans les domaines cosmétiques et alimentaires. Selvaraj et al. démontrent le caractère de résistance de 9 souches testées Gram– (ex : E.coli) et Gram+ (ex : S.aureus) sur un total de 12 souches faces aux composés de la famille des parabènes (méthyle, éthyle, propyle et butyle parabène). Sundheim et al. mettent en avant la résistance de S.aureus et de P.aeruginosa face au chlorure de benzalkonium. Au vu des raisons évoquées, de toxicité des conservateurs d’une part et de la résistance des bactéries d’autre part, les scientifiques sont à la recherche d’alternatives aux molécules synthétiques dans divers domaines, dont la cosmétique et l’alimentaire. Il existe d’autresméthodes de conservation d’aliments et de produits cosmétiques qui seront décrites par la suite.
Alternatives aux conservateurs synthétiques
La stabilité microbiologique d’un produit cosmétique ou alimentaire peut être assurée par différentes méthodes autres que l’utilisation de conservateurs chimiques. Ce sont pour la plupart des traitements physiques qui sont employés au cours de la production afin d’éliminer la quasi-totalité des microorganismes des produits finis. Ils reposent sur différentes techniquesnotamment : l’élimination de l’eau, la conservation par la chaleur, par le froid, l’ionisation et autres. Certains de ces procédés sont présentés par la suite.
Elimination partielle ou totale de l’eau
Comme abordé dans les parties précédentes, la présence d’eau dans les aliments et les produits cosmétiques favorise les contaminations bactériennes. Une solution pour empêcher ces dernières est d’abaisser la teneur en eau (déshydratation partielle), autrement dit, de diminuer l’activité de l’eau (a w ). Pour ce faire, certaines molécules humectantes telles que les glycols ou encore la glycérine sont parfois ajoutées dans les produits cosmétiques car elles permettent d’abaisser leur a w . De plus, certains produits peuvent être fabriqués sans eau (déshydratation totale) comme par exemple des boissons en poudre, la purée, des soupes, du café ou encore du thé lyophilisé. Néanmoins, la déshydratation n’est pas toujours applicable.
En effet, l’eau reste un élément important, naturellement présent dans la plupart des aliments.
Elle influence leur structure, leur apparence et leur goût. Elle est également le constituant majeur de tous les cosmétiques et joue la plupart du temps le rôle de solvant.
Conservation thermique
On peut également citer comme autre méthode de conservation, les procédés de stérilisation par la chaleur tels que l’UHT (Ultra Haute Température) et la pasteurisation. Dans le cas de l’UHT par exemple, un chauffage est réalisé entre 135 et 150°C pendant 1 à 5 s, suivi d’un refroidissement rapide et d’un conditionnement aseptique. Il est souvent utilisé pour les produits laitiers, des jus de fruits et des cosmétiques sous forme de fluides. Comme autre exemple de procédé utilisant la chaleur, on peut citer l’appertisation (mise en conserve) quis’applique dans le domaine alimentaire. Les aliments (légumes, fruits, viandes et autres) sont placés dans des récipients étanches aux liquides ou aux gaz. Ils sont chauffés à des températures élevées (>100°C) afin de détruire la présence de microorganismes. Ces produits se conservent sur une longue durée (plusieurs années). Cependant, il faut noter que ces procédés ayant recours à l’utilisation de températures élevées peuvent entrainer des modifications de la composition chimique des produits traités ou encore altérer leur qualité sensorielle (l’odeur, le goût).
La conservation par le froid permet d’inhiber ou de bloquer la croissance des bactéries.
L’exemple de la surgélation consiste à refroidir rapidement les aliments (ex : fruits, légumes) qui viennent d’être fraichement cueillis à des températures très basses (-18 à -30°C). Cette technique présente l’avantage de ne pas altérer les éléments nutritionnels (vitamines, minéraux) des produits alimentaires. Cependant, une fois que les aliments sont décongelés, les micro-organismes qui ne sont pas détruits peuvent croitre à des températures qui leur sontfavorables.
Conservation non-thermique
Par ailleurs, d’autres techniques non-thermiques peuvent être choisies telles que le traitement à haute pression (400 – 600 MPa) . Il est utilisable uniquement sur des aliments solides ou liquides possédant une teneur importante d’humidité (environ 40% d’eau libre). Ce procédé peut conduire à la dénaturation des protéines des aliments.
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Table des matières
INTRODUCTION GENERALE
Chapitre A : Etude bibliographique
1 Contaminations des produits cosmétiques et alimentaires
1.1 Contaminations bactériennes
1.1.1 Définitions
1.1.2 Contaminations dans divers domaines
1.1.3 Les bactéries dans les formulations aqueuses cosmétiques et alimentaires
1.2 Les radicaux libres
1.2.1 Définition
1.2.2 Effets des radicaux libres sur la santé humaine
1.3 Les moyens de lutte
1.3.1 Les conservateurs et les antioxydants
1.3.2 Toxicité des conservateurs et des antioxydants
1.3.3 Résistance aux antibactériens
1.3.4 Alternatives aux conservateurs synthétiques
2 La nature : source de molécules aux propriétés variées
2.1 Origines, propriétés et applications
2.1.1 Animaux
2.1.2 Microorganismes
2.1.3 Minéraux
2.1.4 Algues
2.2 Dérivés des plantes et utilisations
2.2.1 Familles chimiques variées et propriétés
2.2.2 Utilisation actuelle des dérivés des plantes
2.2.3 Inconvénients des dérivés des plantes
2.3 Polysaccharides
2.3.1 Définitions
2.3.2 Propriétés et utilisations des polysaccharides
2.3.3 Modification des polysaccharides
3 Incorporation de molécules dérivées de plantes au sein de structures polymères
3.1 Polymérisation
3.1.1 Exemple du gaïacol
3.1.2 Exemple de l’eugénol
3.2 Encapsulation au sein de capsules de polymères
3.3 Incorporation au sein de films polymères
3.4 Greffage chimique sur des polysaccharides .
4 Conclusion
Chapitre B : Matériels et Méthodes
1 Synthèses chimiques
1.1 Réactifs et solvants
1.2 Protocoles des synthèses chimiques
2 Techniques de caractérisations du greffage chimique
2.1 Spectroscopie Ultra-Violet –Visible (UV-Visible)
2.2 Spectroscopie Infra-Rouge (IR) …
2.3 Spectroscopie de Résonance magnétique nucléaire (RMN)
3 Techniques de caractérisations physico-chimique
3.1 Couplage SEC/MALLS/DRI/Visco
3.2 Rhéologie
3.2.1 Définitions
3.2.2 Viscosimétrie
3.2.3 Etude en mode écoulement
3.3 Fluorescence
4 Tests antioxydants
4.1 Principe de la méthode avec le radical DPPH
4.2 Principe de la méthode avec le radical cation ABTS
5 Tests antibactériens
5.1 Définitions CMI et CMB
5.2 Détermination des activités antibactériennes (Cas de notre étude)
6 Cytocompatibilité
6.1 Live/Dead
6.2 Alamar Blue
Chapitre C : Carboxyméthylpullulane greffé aminogaïacol
1 Le choix des réactifs
1.1 Le composé naturel
1.2 Le polysaccharide
2 Greffage de l’aminogaïacol sur le CMP
2.1 Greffage de l’aminogaïacol en milieu organique (DMSO)
2.1.1 Réaction de greffage
2.1.2 Conditions de réaction
2.1.3 Caractérisations du greffage
2.1.4 Conclusion sur la caractérisation du greffage
2.1.5 Tests de solubilité de l’aminogaïacol
2.2 Greffage de l’aminogaïacol en milieu aqueux
2.2.1 Réaction de greffage
2.2.2 Conditions de réactions
2.2.3 Caractérisation du greffage
2.2.4 Conclusion sur la caractérisation du greffage
2.3 Conclusion générale sur les synthèses des CMP greffés aminogaïacol
3 Etudes physico-chimiques
3.1 Milieu dilué et semi-dilué
3.1.1 Couplage SEC/MALLS/DRI/Visco
3.1.2 Etude viscosimétrique
3.1.3 Fluorescence
3.2 Mesures rhéologiques : Etude en écoulement
3.3 Conclusion sur les propriétés physico-chimiques
4 Propriétés antioxydantes
4.1 Aminogaïacol vs radical DPPH
4.2 CMP et dérivés CMP-Gx vs radical DPPH
4.2.1 CMP vs radical DPPH
4.2.2 CMP-Gx vs radical DPPH
5 Propriétés antibactériennes
5.1 Aminogaïacol vs S.aureus
5.1.1 Dilutions et ensemencements
5.1.2 Lecture des densités optiques (DO)
5.1.3 Dénombrement sur boites de gélose
5.2 CMP et dérivés CMP-Gx vs S.aureus
5.2.1 CMP vs S.aureus
5.2.2 CMP-Gx vs S.aureus
5.3 Conclusion et discussion sur les propriétés antioxydantes et antibactériennes
6 Cytocompatibilité
6.1 Test Live/Dead : mise en évidence de la viabilité des cellules
6.2 Test Alamar Blue® : mise en évidence de l’activité métabolique des cellules
7 Conclusions générales
Chapitre D : Solutions proposées pour améliorer les propriétés visées
1 Synthèses de nouveaux dérivés greffés
1.1 Stratégie 1 : diminution du taux de greffage (polysaccharide CMP)
1.2 Stratégie 2 : diminution de la masse molaire (polysaccharide CMP dégradé)
1.2.1 Synthèse du dCMP
1.2.2 Synthèse des d CMP-Gx
1.3 Stratégie 3 : rigidification de la chaîne (polysaccharide Alginate)
1.4 Conclusion sur les synthèses chimiques
2 Caractérisation du greffage
2.1 Spectroscopie UV– Visible
2.2 Spectroscopie IR
2.3 Spectroscopie RMN 1 H
2.4 Conclusion sur la caractérisation du greffage
3 Etudes physico-chimiques
3.1 Stratégie 1 : diminution du taux de greffage (CMP et CMP-G)
3.1.1 Couplage SEC/MALLS/DRI/Visco
3.1.2 Etude viscosimétrique
3.1.3 Fluorescence
3.1.4 Mesures rhéologiques : Etude en écoulement
3.1.5 Conclusion sur les propriétés physico-chimiques
3.2 Stratégie 2 : diminution de la masse molaire ( d CMP et d CMP-G)
3.2.1 Couplage SEC/MALLS/DRI/Visco
3.2.2 Fluorescence
3.3 Stratégie 3 : rigidification de la chaîne (Alginate et Alg-G)
3.3.1 Couplage SEC/MALLS/DRI/Visco
3.3.2 Etude viscosimétrique
3.3.3 Fluorescence
3.3.4 Mesures rhéologiques : Etude en écoulement
3.4 Conclusion sur la partie physico-chimique
4 Propriétés antioxydantes
4.1 Stratégie 1 : diminution du taux de greffage (CMP et CMP-G)
4.2 Stratégie 2 : diminution de la masse molaire ( d CMP et d CMP-G)
4.3 Stratégie 3 : rigidification de la chaîne (Alginate et Alg-G)
4.4 Conclusion sur les propriétés antioxydantes
5 Propriétés antibactériennes
5.1 Stratégie 1 : diminution du taux de greffage (CMP et CMP-G)
5.1.1 CMP vs S.aureus
5.1.2 CMP-G0.05 vs S.aureus
5.2 Stratégie 3 : rigidification de la chaîne (Alginate et Alg-G)
5.2.1 Alginate vs S.aureus
5.2.2 Alg-Gx vs S.aureus
5.3 Conclusion sur les propriétés antibactériennes
6 Cytocompatibilité
6.1 Test Live/Dead : mise en évidence de la viabilité des cellules
6.2 Test Alamar Blue® : mise en évidence de l’activité métabolique des cellules
7 Conclusions générales
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
ANNEXE 1
ANNEXE 2
ANNEXE 3
