Caractéristiques pré-analytiques et prélèvement des spécimens

Caractéristiques pré-analytiques et prélèvement des spécimens

Analyse des spécimens

Analyses au chevet du patient

Toutes ces analyses ont été effectuées, à température ambiante, par un unique opérateur (Professeure Cathy Trumel) tout au long de l’étude. Les urines macroscopiquement troubles ont immédiatement été exclues de l’échantillon de référence, sans aucune analyse.
L’ensemble des résultats a été reporté sur la feuille de résultats d’analyse d’urine (Annexe 4).
❖ Densité urinaire
La densité urinaire a été mesurée avec un réfractomètre optique Atago T2-NE (Atago Co. Ltd, Tokyo, Japan) en plaçant une goutte de surnageant sur l’appareil. Entre chaque spécimen, le réfractomètre optique était rincé avec de l’eau distillée et essuyé avec précaution.
Avant chaque série de mesures, le réfractomètre était calibré avec une goutte d’eau distillée de densité égale à 1,000. Toutes les mesures ont été effectuées à température ambiante (environ 20°C).
❖ Bandelettes urinaires
Une analyse chimique du surnageant a été réalisée à l’aide de bandelettes réactives. Les bandelettes suivantes ont été utilisées pour chaque spécimen :
– Bandelette UriVet-100® (2 boîtes, n°lot : URS5020076, Kitvia, Labarthe-Inard, France)
– Bandelette Combur 10 Test® strips (n° lot 1 : 12539104, n° lot 2 : 20526701, Cobas, Rotkreuz, Suisse).Deux autres de marques de bandelettes réactives ont été utilisées uniquement sur une partie des spécimens :– Bandelette Multistix® 8 SG (2 boîtes, n° lot : 504084, Siemens, Tarrytown, USA) : sur les spécimens 11 à 128 – Bandelette AUTION MICRO® PU-4010 (n° lot 10PA5F08, Arkray, Koji, Japan) : sur les spécimens 72 à 128
L’ordre, dans lequel les bandelettes étaient testées, a été défini au hasard, préalablement à l’analyse de chaque spécimen.
Les animaux dont les urines donnaient un résultat positif aux corps cétoniques (à partir de 1+ soit 0,15g/L de corps cétoniques) ont été exclus de l’échantillon de référence.
❖ Cytologie urinaire
Une analyse cytologique du sédiment a été réalisée en déposant une goutte (environ 6 µL) du spécimen sur une lame à bords coupés et à plage dépolie (Thermo scientific lame porte-objet, MenzelGläser, Braunschweig, Germany), recouverte d’une lamelle 22 x 22 mm (Menzel-Gläser,
Braunschweig, Germany). Elle a été analysée avec un microscope Nikon Eclipse E200 aux objectifs 10x et 40x.
Une première analyse semi-quantitative du spécimen a été faite au faible grossissement (10x). La surface de la lamelle a été observée dans son intégralité, en faisant varier la vis micrométrique afin d’effectuer un premier tri entre les éléments d’intérêt (cellules, cristaux, cylindres) et les artéfacts de préparation (bulles, débris de verre, fibres ou poils).
L’analyse quantitative a été effectuée au fort grossissement (40x). Dix champs distincts ont été sélectionnés en prenant soin d’éviter leur chevauchement, afin de ne pas compter plusieurs fois le même élément. Sur chacun des champs, les éléments d’intérêt ont été dénombrés individuellement et relevés dans un tableau (Annexe 5 – Résultats de l’analyse d’urine). En fin d’examen, une moyenne sur les dix champs pour chaque élément d’intérêt, a constitué la donnée brute exploitée par la suite. Une hématurie a été définie par une moyenne supérieure à 8 hématies par champs. Une pyurie a été définie par une moyenne supérieure à 5 leucocytes par champs. Les sujets ayant une hématurie, une pyurie ou une bactériurie ont été éliminés de l’échantillon de référence.

Analyses au laboratoire

Les analyses ont été réalisées au laboratoire central de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Toulouse. Le RPCU a été calculé à partir des concentrations mesurées de créatinine et de protéines sur chaque spécimen par un analyseur (Thermo Fisher Scientific, Indiko, Vantaa, Finland) avec des réactifs spécifiques (Creatinine (Enzymatic) et U-CSF Prot, Thermo Scientific, Vantaa, Finland).
La créatinine a été dosée par une méthode dite enzymatique. C’est-à-dire qu’un chromogène est formé par une cascade de réactions enzymatiques. L’intensité de la coloration obtenue est proportionnelle à la concentration en créatinine du spécimen. Les protéines, quant à elles, ont été dosées par une méthode colorimétrique avec du rouge de Pyrogallol. L’absorption mesurée, à 600 nm, est proportionnelle à la concentration protéique du spécimen.
Avant chaque série de mesures, un contrôle de l’analyseur est réalisé, avec 2 réactifs, selon le protocole de routine du laboratoire. De plus, un calibrage de l’appareil est effectué toutes les 2 semaines.
L’ensemble des réactifs utilisés est stocké selon les instructions de conservation du fabricant.

Analyse statistique des données

L’ensemble des résultats expérimentaux a été organisé dans un tableur Excel. Les courbes de distribution des valeurs de référence obtenues, pour le RPCU et la densité, ont été examinées visuellement afin de détecter des mesures anormales. Les résultats ont également été soumis au test de Tukey permettant de détecter les valeurs aberrantes des extrémités. Celles-ci ont été écartées des analyses statistiques.
La normalité des distributions des valeurs non transformées ou après transformation a été testée par le test de normalité d’Anderson-Darling. Les intervalles de référence sont établis sur des données non transformées.
Les intervalles de référence et les intervalles de confiance à 90% des limites des intervalles de référence ont été déterminés par une méthode statistique non paramétrique, conformément aux recommandations de l’IFCC-CLSI (CLSI, 2008) et de l’ASVCP (Friedrichs et al., 2012).
Le partitionnement des valeurs de référence selon le type de production de l’animal, l’alimentation et le stade physiologique a été testé par analyse de variance (ANOVA) multifactorielle. Lors de différence significative, la nécessité de réaliser de nouveaux intervalles de référence pour chaque groupe de partition a été évaluée à l’aide du test Z d’Harris et Boyd (Harris et Boyd, 1990). Pour qu’il soit applicable, les auteurs recommandent de travailler avec des données suivant une loi normale. Une transformation de Box Cox sera appliquée, dans notre cas, afin d’avoir une répartition normale d’après le test d’Anderson-Darling (p > 0,05). Le test Z d’Harris et Boyd est basé sur la moyenne, l’écart-type et le nombre d’animaux de chacun des échantillons. Il fonctionne mieux lorsque le nombre d’individus et les écart-types sont identiques dans les 2 sous-groupes (Harris et Boyd, 1990). Cependant, des intervalles de référence des sous-groupes ne pourront être établis en raison du faible nombre de spécimens par sous-groupe.
Les calculs ont été réalisés avec le tableur Excel et le logiciel d’analyse statistique Reference Value Advisor®, adapté à la détermination des intervalles de référence (Geffré et al., 2011). Les analyses de variances (ANOVA) ont été effectués à l’aide du logiciel Systat®.

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Table des matières

LISTE DES ABREVIATIONS
LISTE DES FIGURES
LISTE DES TABLEAUX
INTRODUCTION
1. Matériel et méthodes
1.1. Sélection des sujets de la population de référence
1.1.1. Critères de partition
1.1.2. Critères d’exclusion
1.1.3. Critères d’inclusion
1.2. Caractéristiques pré-analytiques et prélèvement des spécimens
1.2.1. Collecte des urines.
1.2.2. Conditionnement pré-analytique des spécimens
1.2.3. Conditions de conservation et d’acheminement des prélèvements
1.3. Analyse des spécimens
1.3.1. Analyses au chevet du patient
1.3.2. Analyses au laboratoire
1.4. Analyse statistique des données
2. Résultats
2.1. Caractéristiques de la population de référence
2.2. Intervalles de référence
3 2.2.1. Intervalle de référence de la densité urinaire
2.2.2. Intervalle de référence du RPCU
2.3. Influence des critères de partition sur les intervalles de référence
2.3.1. Influence du type de production sur le RPCU
2.3.2. Influence du stade physiologique sur le RPCU
3. Discussion
3.1. Validité du protocole expérimental
3.1.1. Sélection des sujets de l’échantillon de référence
3.1.2. Facteurs de variations pré-analytiques
3.1.2.1. Facteurs liés au prélèvement
3.1.2.2. Facteurs liés à la conservation du prélèvement
3.1.3. Méthodes de détermination des intervalles de référence
3.2. Influence des critères de partition sur l’intervalle de référence du RPCU
3.2.1. Influence du type de production sur le RPCU
3.2.2. Influence du stade de gestation sur le RPCU
3.2.3. Influence de la ration alimentaire sur le RPCU
3.2.4. Influence du poids sur le RPCU
CONCLUSION
BIBLIOGRAPHIE
ANNEXES