Caractéristiques opérationnelles de la méthode pour la détection de composés aminés et de l’ammonium

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Spectroscopie de fluorescence

La technique de spectroscopie par fluorescence a l’avantage d’offrir une meilleure résolution des spectres (Hautala et al., 1999), permettant ainsi de fournir d’importantes informations sur les structures, les groupements fonctionnels et les interactions inter- et intramoléculaires des composes organiques (Mobed et al., 1996). Elle offre également une bonne sensibilitéet n’utilise que de petits volumes et permet de doser des faibles concentrations.
Les molécules fluorescentes ne constituent qu’une partie de la MOD (Miano et Senesi, 1992) ; elles se caractérisent principalement par des composés avec des cycles aromatiques condensés, mais également par des groupes carbonyles, hydroxyles, thiols et amines (Miano et Senesi, 1992 ; Senesi, 1990). En effet, pour produire de la fluorescence, les molécules doivent absorber dans le domaine UV-Visible, ce qui n’est possible que lorsqu’on a présence de systèmes d’électron π conjugués (comme dans les molécules polyinsaturéeset aromatiques).
L’acquisition des spectres de fluorescence peut être obtenue de différents façons : soit en mode excitation, soit en mode émission, soit en mode émission/excitation synchrone (Fluorescence EES).
En mode excitation, Zsolnay et al. (1996) ont développé un nouvel indice d’humification, fondé sur le ratio entre l’aire sous pics comprise entre 450 et 500nm et l’aire sous pics comprise entre 360 et 400 nm, après excitation à 254 nm. Cet indice d’humification ne permet pas de caractériser précisément la matière organique mais donne une indication sur la proportion de molécules organiques de faible pois moléculaire par rapport à celle en molécules organiques de haut poids moléculaire.
La spectroscopie de fluorescence synchrone enregistre le spectre d’émission en gardant entre les longueurs d’ondes d’émission et d’excitation un écart constant permettant d’obtenir une bonne résolution des pics des différents types de omposésc organiques (Senesi, 1990). La combinaison des modes excitation/émission donne comme résultat une matrice ou un spectre tridimensionnel. Cette technique de fluorescence à 3 dimensions est aujourd’hui la plus utilisée (Hudson et al., 2007). Par cette technique, il est possible de visualiser le domaine spectral dans son ensemble et de suivre l’évolution de la matière organique par l’étude de l’évolution du nombre de pics de fluorescence et des intensités maximales des fluorophores qui composent l’échantillon. Comme le montre le tableau 6, un certaine nombre de pics peuvent apparaitre sur les spectres 3D, à des inten sités et à des positions diverses en fonction de la nature et d’origine des composés. Ainsi, des différences entre des acides fulviques de différentes origines ont été détectées (Senesi, 1990). Il a également été montré que la forte intensité de fluorescence des composés de types protéiques peut être utilisée comme marqueur de la MOD d’origine anthropique (rejets de stations d’épuration et effluents urbains) (Baker et al., 2003 ; Baker et Spencer, 2004 ; Galapate et al., 1998 ; Reynolds, 2003 ; Reynolds et Ahmad, 1997). Afin d’illustrer les informations que l’on peut obtenir à partir de spectres 3D de fluorescence, l’annexe 4 présente les 5 domaines à considérer lorsque l’expérimentateur souhaite discriminer la Matière Organique Dissoute (Chen et al., 2003).

Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire

La spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire(RMN), particulièrement du 13C, est une technique spectroscopique très utilisée dans lacaractérisation de la MOD (Tableau 7). Bien que les RMN 1H, 15N et 13C ont été utilisées pour analyser les matières organiques de différents sources, seules les RMN 13C et 15N ont été intensivement utilisées (Hatcheret al., 2001) spécialement pour les MOD d’origine terrestre (Stevenson, 1994 ; Kögel-Knabner, 1997 ; Piccolo et al., 1996).
Le principe de cette technique consiste à faire pas ser le noyau d’un atome d’un niveau d’énergie à un autre par absorption d’un photon, etlorsque l’énergie du photon et donc la fréquence de l’onde électromagnétique permettent ttce transition, il y a résonance. Cette transition est provoquée par un champ magnétique intense et constant. Cette technique à l’avantage d’être non destructive et de présenter al possibilité d’analyser les composés organiques dans leurs matrices naturelles, évitantainsi des réactions secondaires occasionnées par des procédures d’extraction (Peuravuori et al., 2003).
L’analyse d’échantillons avec la technique RMN 13C offre des informations sur la structure centrale des composés organiques plutôt que la périphérie comme la RMN 1H. Dans le cas de la RMN 15N, elle a été employée dans le but d’analyser les roupementsg fonctionnels azotés et le cycle de l’azote dans des échantillons (Kögel-Knabner, 1997).

Méthodes classiques de détection

Diverses méthodes de détection sont utilisées pourl’analyse des acides carboxyliques aliphatiques, des composés thiols et des amines. Ces méthodes sont basées principalement sur des techniques classiques de titration acido-basique, des techniques chromatographiques et des mesures ampérométriques.

Titration acido-basique

La titration est une technique utilisée principalement pour la détection des acides carboxyliques. En effet, des techniques simples -comme le dosage par l’acétate de calcium (Masini et al., 1998; Stevenson, 1994)- permettent de mesurer la part de groupements acides de type carboxylique dans une matrice organique solubilisée.
La technique de titration acido-basique a été trèsutilisée dans les contrôles de routine des réacteurs anaérobiques où le suivi de la concentration des AGV est impératif afin d’assurer un bon fonctionnement du réacteur. Dans ce contexte, certains chercheurs ont proposé un système adapté pour l’analyse des AGV sur site en onctionf de la méthode de titration. La première méthode de titrage « en 5 points» a été veloppéedé par Moosbrugger et al. (1993) ; une amélioration de cette méthode a été proposéer paLahav et al. (2002) en utilisant huit points d’observations de pH. Malgré l’utilité de cette méthode dans l’analyse sur site des AGV, ces méthodes de titrage souffrent d’inconvénients liés aux interférences dues à la présence d’ions métalliques qui peuvent former des complexes avec des groupes carboxyliques (Lahav et al., 2005) ou encore, liés à des protocoles jugés tropcomplexes ou trop approximatifs pour une application pratique générale.

Techniques chromatographiques

Diverses techniques d’analyse par séparation ont ét développées pour la détection des différents groupements fonctionnels étudiés. Les chniqueste chromatographiques telles que la Chromatographie en phase Gazeuse (CG) et la Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC) nécessitent des étapes préalables d’hydrolyse et/ou l’ajout d’un réactif de dérivation à l’échantillon et permettent la détection d’une seul famille de composés à la fois.
La Chromatographie Liquide Haute Performance s’est imposée au cours du temps, et plus particulièrement la chromatographie d’échange d’ions ou « chromatographie ionique » qui de nos jours est utilisée pour la séparation et la détection d’ions inorganiques (exemple: Cr3+, N03-, Na+, K+, … ), de quelques acides organiques (citrate, acétate,… ) et de composés aminés (méthylamine, diméthylamine, triméthylamine, … (Meyer,) 1992).
En chromatographie ionique, le mécanisme de séparation se produit par échange d’ions entre une phase stationnaire, qui portent des groupements fonctionnels chargés, et la phase mobile. Dans la solution, les ions séparés quittent la phase stationnaire (colonne de séparation) par groupe d’ions semblables, les uns après les autres,et sont ensuite identifiés par un détecteur du fait de propriétés physico-chimiques qu’ils possèdent.
Divers détecteurs peuvent être couplés aux techniques chromatographiques, ces détecteurs peuvent être classés en deux groupes de détectionméthodes: électrochimiques et méthodes optiques.
Dans les méthodes de détection électrochimique, lamesure de la conductivité est la plus utilisée pour détecter les ions organiques et inorganiques de petite taille ; leur grande mobilité leur confère une conductivité élevée, ce qui permetainsi de détecter des petits acides carboxyliques.
Une autre technique électrochimique utilisée est l’ampérométrie avec courant continu, utilisée pour détecter la plupart des molécules facilement xydéeso ou réduites ou la détection par ampérométrie avec courant alternatif dans laquellele courant est mesuré seulement dans des zones déterminées de la ligne ondulée du potentield’oxydoréduction. Cette méthode est appropriée pour les analytes dont les produits d’oxydation se déposent à la surface des électrodes de mesure. Il s’agit notamment d’hydrates de carbone (sous forme ionique à des valeurs élevées de pH) ainsi que la plupart des composés sulfurés comme les thiols (Johnson et al., 1993).
Le principe de la méthode de détection par photométrie se résume en une mesure directe de l’absorption des analytes dans les zones du visible ou des ultraviolets du spectre électromagnétique. Cette méthode concerne pour lalupart des acides et amines aromatiques ou hétérocycliques comme l’acide benzoïque, l’acidesulfo-benzoïque, l’aniline, la pyridine et leurs dérivés substitués ortho, méta ou para (Reyt al., 1996). Cependant, pour des composés qui ne sont pas aromatiques, la détection par photométrie offre généralement une résolution insuffisante, car la séparation et la détection, sans une méthode de dérivation préalabl,e ne sont ni sélectives ni sensibles.
De ce fait, des réactifs de dérivation pré- ou post-colonne comme par exemple l’o-phtaldialdehyde (OPA) en présence d’un thiol (Saito et al., 1994 ; Campins-Falco et al., 2001), le chloroformiate de 9-fluorénylméthyle (FMOC), la 1,2-naphthoquinone-4-sulfonate (NQS) (Farell et al., 1983), le chlorure de 3,5-dinitrobenzoyle (DNB-Cl) (Herraez-Hernandez et al., 1997), le chlorure de dansyle (DNS) (Cobo et Silva, 1999) peuvent être utilisés pour la qualification et quantification des amines, des thiols et des acides carboxyliques.
Des techniques, comme la chromatographie en phase gazeuse, permettent de détecter des composés (par exemple des acides gras volatils) san ajout de réactif de dérivation. Toutefois, cette technique est difficile à implémenter, est coûteuse et ne permet pas l’analyse sur site des AGV.

Méthodes alternatives

Les méthodes analytiques alternatives s’opposent aux techniques dites de référence, standards ou encore normalisées, et plus généralement aux techniques de laboratoire faisant appel à du matériel analytique difficilement transportable surle terrain. La norme AFNOR XP T 90-210 de janvier 1996 établit une méthode alternative comme « une méthode permettant d’analyser ou d’estimer, pour un type d’échantillon donné, lemême paramètre que celui mesuré par la méthode de référence, mais qui présente des différenc s substantielles par rapport au protocole de la méthode de référence » (Norme AFNOR, XP T 90-210, 1996)
Le développement des différentes méthodes alternatives pour le dosage et la détermination de paramètres physico-chimiques dans différentes matrices peut s’expliquer par le fait que la durée d’analyse et le temps d’obtention des résultats par les méthodes de laboratoire sont généralement assez longs; de plus, aux temps d’analyse et d’interprétation des résultats, il faut ajouter les temps de prélèvements, de stockage, de transport et de prétraitement des échantillons. Ces durées assez longues sont donc incompatibles avec le suivi des composés (exemple : acides gras volatils) en temps réel et les mesures sur site. Enfin, le protocole analytique employé pour une analyse au laboratoire (prélèvement, stockage, transport, prétraitement) induit des biais analytiques.
Contrairement aux analyses d’échantillons en laboratoire, les mesures réalisées avec les méthodes alternatives permettent de prendre en compte la variabilité du milieu, ainsi que d’analyse en temps réel afin de réagir rapidement. De plus, ces méthodes permettent d’augmenter le nombre de fréquences d’analyses. Ces caractéristiques incitent fortement à développer des outils analytiques qui soient automatisés afin de réduire les coûts d’analyse. Parmi les méthodes alternatives automatisées utilisées pour l’analyse des groupements fonctionnels étudiés, nous pouvons citer l’analyseen flux et l’analyse en microplaque.
Les méthodes en flux sont utilisées dans les automates de mesures ou analyseurs automatiques. L’automate reproduit toute la chaîne analytique, depuis le prélèvement de l’échantillon jusqu’à la quantification du paramètre. Les automates permettent de reproduire pratiquement toutes les étapes de prétraitement d’échantillon, de formation de mélanges réactionnels et de détection. Ces méthodes en fluxsont facilement adaptables à tout type de détecteurs, qu’ils soient optiques, électrochimiques ou autres. Pour la détection, l’analyse spectrale (dans le domaine de l’Ultra-violet, du Visible, ou par fluorescence) est une des méthodes les plus appropriées aux mesures sur siteElle. est peu coûteuse, peu encombrante et facilement automatisable.
La méthode en microplaque est composée de multiples«puits» qui peuvent être utilisés pour un des trois objectifs: production, stockage ou analyse de réactifs et/ou échantillons. La microplaque est devenue un outil standard dans la recherche analytique et clinique particulièrement dans le dosage immuno-enzymatique (test ELISA), puisqu’elle permet une analyse multi-échantillon, ainsi que le travail avec des volumes très faibles des réactifs et des échantillons.
L’objet de ce travail de recherche étant de concevoir un système d’analyse en microplaque et/ou en ligne, ces deux techniques seront plus détaillées dans la partie suivante de ce mémoire.

La spectrofluorimétrie UV – visible : Principe

La photoluminescence (fluorescence et phosphorescence) est une caractéristique que possèdent certains composés à émettre de la lumièrelorsqu’ils sont soumis à une excitation par des photons. Ce phénomène a permis l’émergencede plusieurs techniques d’analyse sélectives et très sensibles. Parmi les techniques basées sur ces phénomènes photoluminescents figurent la spectrofluorimétrie qui permet de mesurer la fluorescence en solution de molécules et d’ions, et la phosphorescence, plus rarement employée du fait de la complexité de l’instrumentation.
La phosphorescence et la fluorescence sont deux phénomènes distincts. La phosphorescence représente une photoluminescence retardée, correspondant à l’émission lumineuse d’un objet plongé dans l’obscurité après avoir été exposé quelques temps auparavant à de la lumière ; l’émission lumineuse a donc une duré de vie beaucoup plus grande après la phase d’excitation. Par opposition, la fluorescence décroit de manière exponentielle dès que l’excitation cesse.
Les phénomènes photoluminescents, d’un point de vuefondamental, résultent de l’absorption de la lumière UV/VIS par des molécules ou espècesoniques, générant des états électroniques excités entre les différentes orbitales moléculaires après un apport d’énergie sous forme de photons. Le diagramme de Jablonski (Figure 5) (Jablonski, 1933) représente l’absorption et l’émission de la radiation luminescente entre les niveaux d’énergie d’une molécule photoluminescente typique. D’après la distribution de Boltzman, à température ambiante, les électrons se trouvent au niveau vibrationnel le plus bas, celui de l’état électronique fondamental (S0) ; ainsi, quand une molécule absorbe de l’énergiesous forme de photons, elle passe de son niveau électronique fondamental (S) à un état électronique excité S. Selon le principe de Franck-Condon, il n’y aura ni changement de la position nucléaire ni modification de l’orientation de spin, du fait que l’absorption du rayonnement se produit à très grande vitesse, de l’ordre de la fentoseconde (10-15 sec). Cette transition électronique ne peut se faire que si l’énergie fournie par le photon correspond à la différence d’énergie entre les deux niveaux S0 et S1. D’autre part, certaines molécules excitées peuvent revenir à l’état fondamental par le biais de processus non radiatifs, la molécule retournant à son état fondamental sans émettre de radiation, et par processus radiatifs, où le retour à l’état fondamental (S0) peut se faire par le biais des deux phénomènes photoluminescents – fluorescence et phosphorescence- lesquels ne se différencient que par leur durée.

La fluorescence

La fluorescence correspond au retour d’une molécule de son état excité S vers son niveau fondamental S0 sans changement de multiplicité de spin. Il est admis que la durée de vie de l’état excité est inférieure à 10 seconde. Etant donné que la molécule retombe dansl’état fondamental à un niveau vibrationnel plus élevé qu’avant l’excitation, du fait du phénomène de relaxation vibrationnelle dans l’état excité, laradiation émise par la fluorescence est de plus faible énergie et se situe donc à une longueur d’onde plus élevée que celle absorbée.

La phosphorescence

La phosphorescence est définie comme étant l’émission d’une radiation correspondant à la transition d’un état triplet excité à un état fondamental singulet (S0). En effet, après la phase d’absorption, correspondant au transfert d’électron d’un niveau S 0 à S 1, puis, si la relaxation vibrationnelle est assez lente, on assiste au passage d’un état singulet S1 à un état triplet T1 énergétiquement plus stable car l’énergie vibrationnelle T1 la plus basse est inférieure à celle de S . Les molécules dans l’état T peuvent ensuite retourner directement à leur état fondamental par émission radiative sans repasser par un niveau S1. Ce retour au niveau fondamental est de l’ordre de 10 -4 seconde à plusieurs heures, grâce à la grande stab ilité de l’état triplet.

Exploitation analytique de la spectrofluorimétrie

L’étude spectrofluorimétrique d’une solution est basée sur la mesure de l’intensité de la radiation lumineuse émise, après absorption d’un photon ; ainsi, un spectre de l’intensité de fluorescence est représenté en fonction de la longueur d’onde. En appliquant la loi de Beer-Lambert, on peut donc connaître la résultante totale des fluorescences individuelles (If) des molécules de l’échantillon présente sur le trajetptiqueo du faisceau excitateur : If = Φf I0 ελ L C.
Avec:
I0 = Intensité de la radiation excitatrice.
C = Concentration de la solution (mol.L-1)
L = Longueur de la cuve (cm) ελ -1 cm -1 ).
= Coefficient d’absorption molaire à longueur d’ond e donné (L mol Φf = Rendement de fluorescence de la solution
Pour les solutions, on définit le rendement de fluorescence Φf, comme la fraction des nombre de photons émis (I) sous les nombre de photons absorbés (I).Etant I = I – I où I représente f a a 0 t t l’intensité de la lumière transmise. Φf = If / Ia.
Il est important de noter que l’intensité de fluorescence (If) dépend à la fois de la concentration de l’échantillon (C), de l’intensité de la radiation excitatrice (I0) et du rendement quantique du flurophore, mais également du choix de la longueur d’onde excitatrice, facteur très important si l’on veut obtenir un rendement de fluorescence élevé.
En spectrofluorimétrie, la qualité des spectres dépend fortement des milieux étudiés ; par conséquent, une modification environnementale peut conduire à un changement de configuration ou de structure de la molécule, et donc à une modification de l’intensité de fluorescence. De nombreux facteurs influençant et a ltérant les spectres de fluorescence nécessitent d’être pris en compte et corrigés afind’obtenir de « vrais » spectres. Les différents facteurs d’influence et d’altération peuvent être esd facteurs internes (liés à la nature de l’échantillon) ou des facteurs externes (liés à l’instrumentation).

Facteurs internes

L’intensité de fluorescence varie en fonction de la concentration de la solution (loi de Beer-Lambert). Cependant, pour des domaines de concentrations élevées, la relation établie entre l’intensité de fluorescence et la concentration n’est plus linéaire. Ce phénomène appelé effet de filtre interne, est observé pour des solutions très concentrées où l’intensité de lumière d’excitation n’est pas constante à travers la solution. Ainsi, seul un faible pourcentage de la lumière d’excitation atteint les fluorophores. Un autre effet interne se produit en raison de la réabsorption. La réabsorption se produit lorsqu’uneautre molécule absorbe une partie des longueurs d’ondes émises par le fluorophore. Si c’est le cas, une partie des photons émis par le fluorophore peut être absorbée à nouveau.

Table des matières

CHAPITRE I : Etude Bibliographique
I.1. Typologie de la Matière Organique Dissoute
I.1.1. Typologie selon la composition
I.1.2. Typologie selon la réactivité
I.2. Caractérisation de la Matière Organique Dissoute
I.2.1. Caractérisation physico-chimique
I.2.1.1. Techniques de séparation par taille
I.2.1.2. Techniques de séparation par charge
I.2.1.3. Techniques de séparation par hydrophobicité
I.2.2. Caractérisation fonctionnelle
I.2.2.1. Spectroscopie d’absorbance UV/Vis
I.2.2.2. Spectroscopie Infrarouge
I.2.2.3. Spectroscopie de fluorescence
I.2.2.4. Spectroscopie de résonance magnétique nucléaire
I.2.3. Caractérisation structurelle
I.2.4. Caractérisation élémentaire
I.3. Groupements d’intérêt environnemental
I.3.1. Amines primaires et acides aminés
I.3.2. Thiols
I.3.3. Acides carboxyliques
I.3.4. Méthodes classiques de détection
I.3.4.1. Titration acido-basique
I.3.4.2. Techniques chromatographiques
I.3.5. Méthodes alternatives
CHAPITRE II : Développement Méthodologique
II.1. La spectrofluorimétrie UV – visible : Principe
II.1.1. La fluorescence
II.1.2. La phosphorescence
II.2. Exploitation analytique de la spectrofluorimétrie
II.2.1. Facteurs internes
II.2.2. Facteurs externes
II.3. La dérivation par fluorescence : Principe
II.4. Choix des réactifs pour la dérivation et la détection par fluorescence des groupements fonctionnels
II.4.1. Groupement amine (-NH2)
II.4.2. Groupement thiol (-RSH)
II.4.2.1. Thiols réduits
II.4.2.1.1. Thiols réduits totaux
II.4.2.1.2. Thiols réduits individuels
II.4.2.2. Réduction des thiols oxydés
II.4.2.2.1. Les hydrures
II.4.2.2.2. Les thiols
II.4.2.2.3. Les phosphines
II.4.2.2.4. Les cyanures et les sulfites
II.4.3 Groupement carboxylique (-COOH)
II.5. Méthodes d’optimisation
II.5.1. Plan de criblage
II.5.2. Plan d’expérience
II.6. Introduction aux techniques d’automatisation
II.6.1. Technique d’analyse en microplaque
II.6.1.1. Généralités sur la technique en microplaque
II.6.2. Technique d’analyse en flux
II.6.2.1. Généralités sur les techniques en flux
II.7. Matériels et Méthodes
II.7.1. Matériels
II.7.1.1. Matériel pour les expériences en microplaques.
II.7.1.1.1. Microplaques
II.7.1.1.2. Instrument de mesure de fluorescence pour microplaques
II.7.1.2. Matériel pour les expériences d’analyse en flux.
II.7.1.2.1. Système d’analyse en flux
II.7.1.2.2. Instrument de mesure de fluorescence pour l’analyse en flux
II.7.2. Réactifs
II.7.3. Méthodes et procédures
II.7.3.1. Amines primaires et acides aminés
II.7.3.1.1. Méthode
II.7.3.1.2. Procédure
II.7.3.2. Thiols
II.7.3.2.1. Méthode
II.7.3.2.2. Procédure
II.7.3.2.3. Etape de réduction
II.7.3.2.4. Etape de dérivation
II.7.3.3. Acides carboxyliques à chaine courte
II.7.3.3.1. Méthode
CHAPITRE III : Résultats et Discussions
III.1. Détermination des amines primaires et acides amines par automatisation en microplaque avec détection par fluorescence
III.1.1 Présentation des paramètres influençant la dérivation et la détection des composés aminés
III.1.2. Etude de sélectivité
III.2.3. Etude des interférences
III.1.4. Caractéristiques opérationnelles de la méthode pour la détection de composés aminés et de l’ammonium
III.1.5. Caractéristiques analytiques
III.I.6. Validation de la méthode
III.I.6.1. Validation de la procédure de dosage des composés aminés
III.1.6.2. Validation de la procédure de dosage de NH4 +
III.1.7. Conclusion
III.2. Mise au point d’un kit microplaque pour la détection fluorimétrique des thiols
III.2.1. Présentation des paramètres influençant la dérivation et la détection des thiols.
III.2.1.1. Optimisation de l’étape de dérivation
III.2.1.1.1. Plan de criblage
III.2.1.1.2. Plan d’expériences
III.2.1.1.2.1. Effet du pourcentage de méthanol
III.2.1.1.2.2. Effet de la concentration en aminoéthanol
III.2.1.1.3. Désirabilité
III.2.1.2. Optimisation de l’étape de réduction
III.2.2. Détermination des caractéristiques analytiques de la détection fluorimétrique
III.2.2.1. Limite de détection et limite de quantification
III.2.2.2. Etude des interférences
III.2.3. Validation de la méthode
III.2.3.1. Thiols réduits
III.2.3.1.1. Echantillons de sols et composts
III.2.3.1.2. Echantillons de station d’épuration
III.2.3.2. Thiols oxydés
III.2.4. Conclusion
III.3. Détermination des acides gras volatils par automatisation en flux avec détection par fluorescence
III.3.1. Analyse en microplaque
III.3.2. Analyse en Flux
III.3.2.1. Automate développé
III.3.2.2. Présentation et optimisation des paramètres influençant la dérivation en flux des acides gras volatils
III.3.2.2.1. Optimisation de l’étape d’activation
III.3.2.2.2. Optimisation de l’étape d’amidation
III.3.2.2.3. Optimisation de l’étape d’extraction
III.3.2.2.4. Influence du débit d’extraction
III.3.2.3. Caractéristiques analytiques
III.3.2.3.1. Limites de détection et limites de quantification
III.3.2.3.2. Sélectivité
III.3.2.3.3. Interférences
III.3.2.4. Validation
III.3.2.5. Conclusion
Conclusion Générale
Références Bibliographiques

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