Caractéristiques histologiques et génétiques du LHc

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Extraction d’ADN

Les échantillons de sang ont été prélevés sur des tubes EDTA de 10mL et centrifugés dans les deux heures après la prise de sang, à 2,000g pendant 10 minutes (à 4°C) afin d’isoler le plasma, qui fut ensuite conservé à -80°C. L’ADN a ensuite été extrait à partir d’aliquots de 1-3mL de plasma EDTA à l’aide du QIAmp Circulating Nucleic Acid Kit® (Qiagen, Hilden, Allemagne) en suivant les instructions du fournisseur. L’ADN plasmatique (ADNp) extrait de chaque échantillon de plasma a été élué dans 40µL de tampon AVE et conservé à -80°C. L’ADN double-brin extrait a ensuite été quantifié à l’aide du Qubit® dsDNA HS Assay Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, Etats-Unis). Concernant les échantillons biopsiques, l’ADN génomique a été extrait des noyaux cellulaires selon les méthodes classiques de digestion des membranes à la protéinase K, purification au Chlorure de Sodium et précipitation à l’alcool. Pour l’extraction d’ADN FFPE, les lames ont été systématiquement revues par un hémopathologiste qualifié afin de sélectionner la zone tumorale du bloc de paraffine à extraire à l’aide d’un kit dédié (QIAamp DNA FFPE Tissue Kit, QIAGEN®). Les ADN génomiques ont été conservés à -20°C dans une solution tampon contenant 10mM de Tris-Cl et 1mM d’EDTA (pH 8) (TE 10 :1).

Techniques de PCR digitale

Le manuscrit décrivant la technique de PCR digitale pour la détection de la mutation XPO1 E571K que nous avons précédemment publié est présenté en annexe 7. Brièvement, une première technique de PCR digitale (PCRd) utilisant des puces spécifiques (QuantStudio3D® Digital PCR system; Life Technologies, Carlsbad, CA, Etats-Unis) a été utilisée pour la détection de mutation dans les échantillons ADN des patients. L’analyse du statut mutationnel dans l’échantillon ADN par PCRd est basée sur une technique utilisant des sondes d’hydrolyse oligonucléotidiques TaqMan®-MGB spécifiques de la mutation XPO1 E571K. Le principe de la sonde TaqMan® repose sur l’activité exonucléase 5´–3´ de la Taq polymérase qui clive une sonde marquée lors de son hybridation à la séquence complémentaire permettant l’émission d’une fluorescence mesurable. Les expériences de PCRd ont été effectuées sur l’ADN extrait de tissu tumoral cryopréservé ou FFPE, ainsi que sur l’ADNp obtenu au moment du diagnostic (avant tout traitement) ainsi qu’en fin de traitement.
Les séquences nucléotidiques de nos sondes TaqMan®-MGB ainsi que des amorces de PCR, choisies pour amplifier la région de l’exon 15 du gène XPO1 sur chromosome 2 où est située la mutation E571K, étaient les suivantes :
Amorce sens (F): TCTCTAACAAGACAAAAACATTCATTTATTTTCTTCA
Amorce anti sens (R) : GCTCACTGGAAATTTCTGAAGACTGT
Sonde sauvage avec fluorochrome VIC : AGCTGTTCGAATTCAT
Sonde mutée avec fluorochrome FAM : AGCTGTTCAAATTCAT
En raison de la quantité limitée d’ADNp disponible, nous avons réalisé une étape de pré-amplification de 4ng d’ADNp. Cette étape a été effectuée dans un volume final de réaction de 25µL comportant 12,5µL de TaqMan® Universal PCR Master Mix (sans uracile N-glycosylase), 10,25µL d’eau stérile et 0,25µL d’ « Assay » spécifique de la mutation XPO1 E571K (composé de l’ensemble des primers et sondes TaqMan®-MGB). Le programme de pré-amplification comportait les étapes suivantes : 1 cycle à 95°C pendant 10 minutes, puis 12 cycles de 95°C pendant 15 secondes et 60°C pendant 4 minutes. Les produits de pré-amplification ont ensuite été dilués au 1 :5 dans du TE 10 :1 et par la suite traités comme des échantillons standards pour la PCR digitale. Dans chaque expérience, de l’ADN génomique normal (Promega® Corporation, Madison WI) et de l’ADN normal pré-amplifié étaient utilisés comme témoins négatifs en PCRd.
QuantStudio3D® est un appareil de PCR digitale permettant de partitionner un échantillon d’ADN dans 20.000 puits individuels à l’échelle nanométrique sur une puce dédiée. La réaction de PCR digitale a été réalisée dans 15µL de volume final comportant : 7,5µL de tampon MasterMix® digital PCR 20x (Life Technologies), 0,75µL d’Assay spécifique de la mutation (amorces et sondes TaqMan®) et 6,75µL d’échantillon d’ADN (soit 6,75µL de produit de pré-amplification dilué dans du TE 10 :1 pour l’ADN plasmatique, soit 20ng d’ADN génomique FFPE ou cryopréservé non pré-amplifié dilué dans du TE 10 :1 pour un volume total de 6,75µL). Le volume final de 15µL de chaque échantillon a ensuite été chargé sur une puce de PCR digitale par échantillon à l’aide du QuantStudio® 3D digital PCR Chip Loader® selon les recommandations du fabricant, puis les puces placées dans l’appareil de PCR digitale Gene Amp® PCR System 9700 afin de réaliser l’amplification. La réaction de PCR était constituée des étapes suivantes : 1 cycle à 96°C pendant 10 minutes, puis 39 cycles de 55°C pendant 2 minutes et 98°C pendant 30 secondes, puis un cycle à 60°C pendant 2 minutes. L’amplification se déroule dans chaque puits, et la puce est ensuite soumise à la lecture de fluorescence post PCR. Les données brutes de fluorescence étaient ensuite transmises sur le logiciel d’analyse dédié, QuantStudio® 3D Analysis Software (Life Technologies) pour l’interprétation des données. Chaque puits est classé comme positif ou négatif sur la base du signal de fluorescence émis qui est utilisé pour déterminer l’existence de la séquence d’ADN d’intérêt mutée ou sauvage dans le puits. Chaque puits est ainsi classé de la façon suivante : FAM-/VIC- (apparaissant en couleur jaune) pour un puits ne contenant pas la séquence d’intérêt (absence d’amplification), FAM+/VIC- correspondant à la séquence mutée (couleur bleue), FAM-/VIC+ correspondant à la séquence sauvage (couleur rouge), FAM+/VIC+ (apparaissant en vert) lorsque le puits contient à la fois la séquence mutée et la séquence sauvage. Chaque graphe de fluorescence, pour chaque échantillon, a été revu et interprété manuellement (avec ajustement et correction des résultats de l’analyse automatique faite par le logiciel dédié) pour l’obtention des résultats définitifs dans le cadre de ce travail. La fréquence allélique (FA) de la mutation XPO1 E571K a été estimée pour chaque échantillon par le calcul suivant : FA = n(FAM) / n (FAM+VIC), « n » étant le nombre de puits positifs. Le ratio de réactions positives par rapport aux réactions négatives est appliqué à la loi de Poisson (loi des petits nombres) ce qui a également permis une estimation précise du nombre de molécules d’ADN dans l’échantillon de départ. Nous avons obtenu ainsi une quantification exacte du variant XPO1 E571K dans l’échantillon sans devoir recourir à une courbe standard.
Afin de consolider les résultats obtenus par cette plateforme de PCR digitale, nous avons également analysé l’ensemble des échantillons sur une seconde plateforme de PCR digitale en gouttelettes (« droplets »), le Qx200® droplet digital PCR system, laboratoire BIO-RAD, Hercules, CA, Etats-Unis)., en utilisant le même assay de PCRd pour XPO1, en suivant les recommandations du fournisseur. Les étapes de PCRd avec la technologie BIO-RAD étaient les suivantes : 1 cycle à 95°C pendant 10 minutes, puis 40 cycles de 55°C pendant 1 minute et 94°C pendant 30 secondes, puis un cycle à 55°C pendant 1 minute et un cycle de 98°C pendant 10 minutes. Afin d’établir la spécificité de notre « assay » de PCRd avec la plateforme BIO-RAD, la fréquence allélique de la mutation a été mesurée dans 20 échantillons d’ADNp pré-amplifiés, précédemment établis comme étant négatifs pour la mutation XPO1 E571K par analyse sur un séquenceur haut-débit. Cela a permis d’estimer le bruit de fond associé à cette technique et ce type d’échantillon, et le seuil de 0,1% de « bruit de fond » a été calculé comme celui permettant de discriminer les échantillons « positifs » versus « négatifs » pour la mutation XPO1 E571K.

Séquençage sur Ion torrent personal genome machine™ (PGM)

Dans le but de valider nos résultats obtenus par la technologie de PCRd, nous avons réalisé des expériences de Séquençage de Nouvelle Génération (NGS) à l’aide de l’Ion Torrent Personal Genome Machine™ (PGM, Life technologies, Carlsbad, CA, Etats-Unis). Les librairies ont été préparées à partir de 10ng d’ADN génomique avec les amorces précédemment décrites du Lymphopanel (40,44) utilisé dans notre centre et ciblant le variant d’XPO1 E571K. Les librairies amplifiées (Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0) ont été soumises à la PCR en émulsion avec l’Ion OneTouch™ 200 Template Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, Etats-Unis) en utilisant l’Ion OneTouch™ System (Life Technologies, Carlsbad, CA, Etats-Unis), d’après les recommandations du fournisseur. Les Ion Sphere™
Particles ont été ensuite enrichies à l’aide de l’Ion OneTouch™ Enrichment System puis chargées et séquencées sur une puce Ion 316™ v2 (Life Technologies). Après alignement des séquences obtenues sur le génome humain de référence, la présence de la mutation E571K (chr2:61719472C>T) a été établie par un test exact multinomial, comparant le nombre de reads présentant la base mutée (T) avec le nombre de reads présentant ce qui s’apparente à du bruit de fond (G et A). Pour chaque échantillon testé, un « False discovery rates » (FDR) a été calculé, et les échantillons avec un FDR inférieur strictement à 10% ont été considérés comme mutés. Les échantillons pour lesquels le FDR était supérieur à 10% et pour lesquels une profondeur minimale de séquençage de 1000x n’était pas atteinte, ont été considérés comme non-interprétables (NI).

Evaluation de la réponse au traitement et TEP-FDG

La réponse au traitement a été déterminée en suivant les critères de l’IWG rapportés par Cheson (45). Les images de TEP ont bénéficié d’une relecture par deux médecins nucléaires expérimentés et les résultats ont été rapportés à l’aide de l’échelle visuelle de Deauville 5 points (Annexe 3) et suivant les critères de réponse modifiés IHP 2007 (annexe 4). Le seuil pour définir la positivité de la TEP a été un score de Deauville supérieur ou égal à 4. La Réponse Complète (RC) en fin de traitement a été définie comme la négativité du PET avec ou sans masse résiduelle. Une maladie réfractaire (RD) a été définie comme une maladie stable (SD), en réponse partielle (PR) ou progressive (PD), caractérisée par la persistance de toute masse positive en TEP ou l’apparition de nouvelles lésions positives en TEP.

Analyse statistique

La survie globale (OS) a été calculée depuis la date de diagnostic jusqu’à la date des dernières nouvelles ou la date de décès, toutes causes confondues. La survie sans progression (PFS) a été calculée depuis la date de diagnostic jusqu’à la date de progression de la maladie, de la rechute, du traitement de rattrapage ou de décès, toutes causes confondues. Les courbes de survie ont été construites par la méthode de Kaplan-Meier et comparées par le test des log-rangs. La comparaison entre les paramètres moléculaires et cliniques a été réalisée au moyen de tests non paramétriques appropriés : test U de Mann-Whitney, coefficient de corrélation tau de Kendall et test exact de Fisher. L’ensemble de ces analyses a été réalisé avec le logiciel R (3.0.2), considérant p < 0,05 comme statistiquement significatif.

Mutations d’XPO1 dans le LHc au moment du diagnostic initial

Les principales caractéristiques des 94 patients inclus sont résumées dans le Tableau 1. Les patients étaient considérés comme mutés si la mutation XPO1 E571K était détectée dans l’ADN extrait de la biopsie diagnostique. La mutation a été retrouvée à une fréquence de 24,2% par PCRd dans l’ADN génomique extrait de biopsie (Tableau 1). Dans cette série de 94 patients, l’âge médian est de 32 ans et 56,4% sont des hommes. Les principales caractéristiques cliniques des patients au diagnostic, incluant l’âge, le sex-ratio, le stade de la maladie et la présence ou non d’une atteinte médiastinale, étaient similaires chez les patients mutés ou non mutés (Tableau 1). Les caryotypes réalisés sur biopsie ganglionnaire au diagnostic sont présentés en Annexe 5. Ces caryotypes n’ont été réalisés que pour 82 des 94 patients inclus dans l’étude et le taux d’échec d’obtention de mitoses analysables était de 12/82 (14,6%). On notera 32 caryotypes sans anomalie évidente (39%), et 5 caryotypes présentant un isochromosome 9p, fréquemment décrit dans les LHc et les PMBL. Par ailleurs, on observe une importante proportion de caryotypes hyperdiploïdes (36/82 soit 43,9%), habituels dans les LHc. Un patient (N°10) présentait un remaniement de la région 2p16 où est situé le gène REL, à proximité du gène XPO1, ce patient n’était pas muté au niveau du gène XPO1.

Intérêt de l’ADN plasmatique dans le suivi de la maladie résiduelle (MRD)

L’ADNp en fin de traitement était disponible pour 28 patients de la cohorte « cytokines ». Les 66 patients restant ne disposaient pas de plasma en fin de traitement (n=46) ou n’étaient pas porteurs de la mutation dans la biopsie ou le plasma au diagnostic (n=20). La figure 11 représente schématiquement la variation de la VAF de la mutation XPO1 E571K dans l’ADN plasmatique des 28 patients évaluables entre le prélèvement du diagnostic et celui de la fin du traitement (après la chimiothérapie et la radiothérapie pour les stades localisés, à l’issue des cures de chimiothérapie pour les stades avancés).
La majorité des patients (n=20/28) a présenté une décroissance importante de la fréquence allélique de la mutation dans le plasma entre le diagnostic et la fin du traitement, corrélée à la négativité de la TEP de fin de traitement. La mutation est devenue indétectable (au seuil de 0.1%) pour 16 patients. Par ailleurs, on note que 5 patients avaient une mutation indétectable dans le plasma (alors qu’elle était présente dans la biopsie) à la fois au diagnostic et en fin de traitement (patients avec VAF « négative », Figure 10). De plus, il est intéressant de noter que les patients dont la mutation restait détectable en fin de traitement avaient tendance à rechuter davantage au cours du suivi (PFS à 2 ans : 57,1% [30,1-100]) que les patients avec une mutation indétectable en fin de traitement (PFS à 2 ans : 90,5% [78,8-100%], p=0,0601, Figure 12). Enfin, on observe que les 3 patients dont la VAF XPO1 E571K augmentait dans le plasma entre le diagnostic et la fin du traitement (groupe « increase », Figure 11) semblaient présenter un pronostic plus défavorable en OS et PFS, mais l’effectif est trop faible pour conclure avec certitude (PFS à 2 ans du groupe « increase » : 33,3% [6,7-100%] versus 90% [77,8-100%] pour le groupe « decrease », p=0,0439, données non montrées). Cependant, dans 2 cas sur 3, la TEP était négative au moment de la détection d’une augmentation de la MRD dans le plasma. Dans la cohorte globale de 94 patients, 26 (27.7%) ont présenté une rechute au cours du suivi.
Parmi les 7 patients avec un plasma « positif » en fin de traitement (Figure 12), 4 (57%) patients ont rechuté au cours du suivi, alors que seulement un patient avait une TEP positive en fin de traitement, ce qui pourrait suggérer que notre technique serait plus sensible que la TEP en fin de traitement pour prédire la survenue d’une rechute.

DISCUSSION

Notre étude rapporte pour la première fois la présence de la mutation somatique récurrente XPO1 E571K, identifiée par PCR digitale et séquençage NGS dans une large cohorte d’échantillons de LHc non microdisséqués. Au total, 24,2% des patients inclus présentent la mutation XPO1 E571K. Il existe un continuum physiopathologique entre les PMBL et les LHc du sous-type scléro-nodulaire, et le fait que ces deux pathologies pourraient dériver de cellules thymiques B est actuellement un domaine de recherche et de discussion (53). Le fait que la mutation XPO1 E571K soit retrouvée de manière fréquente et avec une prévalence similaire dans ces deux sous-types renforce l’hypothèse d’une origine ontogénique commune et d’un potentiel rôle oncogénique de ce gène. Des mutations de type substitutions d’un seul nucléotide (SNV)
affectant le gène XPO1 ont précédemment été décrites à de faibles fréquences dans la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) ainsi que dans le carcinome épidermoïde de l’œsophage, suggérant que ces mutations pourraient avoir un rôle important dans différents processus oncogéniques (33,34,54). Il convient de noter que différents variants d’XPO1, incluant ceux localisés au niveau du hotspot de l’exon 15 (24,55–57), n’étaient pas détectables par notre technique de PCRd et nous ne pouvons donc pas écarter l’hypothèse que notre étude a partiellement sous-estimé la prévalence des mutations d’XPO1 dans le LHc. Cependant, le séquençage NGS de 48 biopsies que nous avons réalisé n’a pas permis de retrouver d’autres variant d’XPO1 dans le LHc. A ce jour, le rôle du gène XPO1 et l’impact de cette mutation hautement récurrente E571K dans la pathogénèse du LHc restent totalement inconnus. De nombreuses protéines, décrites pour leur rôle oncogénique dans le LHc telles que STAT1/STAT6, FOXO1 et CIITA, ont également été identifiées comme protéines cargo (58– 60) associées à XPO1. Il reste à déterminer si les mutations d’XPO1 peuvent interférer avec la fonction de la navette régulant la localisation nucléaire/cytoplasmique de ces protéines. L’analyse génétique des LHc a longtemps été considérablement limitée par la rareté des cellules tumorales HRS, entourées par un important infiltrat de cellules inflammatoires non malignes incluant des macrophages, lymphomes réactionnels, plasmocytes et fibroblastes (61). Ces cellules réactionnelles infiltrantes, en particulier les lymphocytes T, peuvent représenter jusqu’à 99% des cellules constituant la masse tumorale (18), ce qui explique les fréquences alléliques très faibles de la mutation XPO1 E571K dans notre série de LHc, avec une probable dilution de l’ADN tumoral dans l’ADN non tumoral provenant des cellules réactionnelles. Nous ne pouvons affirmer avec certitude que la mutation est effectivement présente dans les cellules tumorales et non dans les cellules réactionnelles inflammatoires, ou bien que cette mutation est sous-clonale dans les cellules tumorales, mais le fait que la mutation soit retrouvée dans deux lignées de Hodgkin, et absente dans les cellules mononuclées du sang périphérique, est en faveur de la présence de cette mutation dans les cellules tumorales. Il est intéressant de noter que la mutation XPO1 E571K avait déjà été retrouvée dans la lignée L-1236 par une technique de Whole-exome sequencing (52). Nous pouvons en outre souligner le fait que très peu de mutations somatiques ont été décrites dans le LHc. Quelques études ont rapporté la présence de mutations du gène TP53 dans les cellules HRS (62,63), mais à une fréquence peu élevée probablement liée à de nombreux faux négatifs. Maggio et al. ont cependant décrit des mutations de TP53 avec une fréquence de 11.5% dans leur série de LHc et ont émis l’hypothèse que ces mutations joueraient un rôle dans la résistance des cellules HRS à l’apoptose (64). Dans cette pathologie particulière que constitue le LHc, des techniques d’analyse moléculaire de haute sensibilité comme la PCR digitale et le NGS ciblé sont essentielles pour mettre en lumière des mutations de faible fréquence allélique. Les techniques de séquençage haut débit, comme le whole genome sequencing de faible couverture (« low coverage WGS ») (65), le séquençage ciblé d’ADN plasmatique circulant (41) ou le séquençage ciblé d’exome de cellules HRS triées (21) ont récemment permis d’identifier de nouvelles anomalies moléculaires présentes dans le LHc mais avec des effectifs d’échantillons souvent insuffisants. Toutefois, le séquençage d’exome de cellules HRS isolées a permis récemment d’identifier de nouvelle mutations ponctuelles dans le LHc, incluant des mutations déjà rapportées dans les PMBL, telles que celles affectant les gènes CIITA, SOCS1, STAT6 et B2M (21,66,67). Une étude a par ailleurs rapporté un cas de mutation XPO1 E571K mais était limitée à 10 patients seulement (21), avec une médiane de profondeur de séquençage insuffisance (48X), pouvant potentiellement limiter la découverte de nouvelles altérations génomiques dans le LHc. Le tableau 4 résume les différentes mutations somatiques décrites à ce jour dans le LHc ainsi que les voies de signalisation concernées. Certaines mutations rapportées dans le LHc sont également retrouvées dans différents lymphomes non-hodgkiniens (LNH) de type B et de sous-type GC et dans les PMBL. Cependant, la majorité des gènes mutés dans les LHc sont spécifiques des cas de LHc (52) ce qui indique que les altérations génomiques se produisant au cours de la transformation maligne dans le LHc sont globalement distinctes de celles se produisant dans les autres LNH B de sous-type GC.

Table des matières

GLOSSAIRE
INTRODUCTION
Présentation générale du lymphome de Hodgkin
Prise en charge thérapeutique du LHc
Caractéristiques histologiques et génétiques du LHc
La mutation XPO1 E571K
Principes de la technologie de PCR digitale
PATIENTS ET METHODES
Patients et échantillons
Extraction d’ADN
Techniques de PCR digitale
Séquençage sur Ion torrent personal genome machine™ (PGM)
Evaluation de la réponse au traitement et TEP-FDG
Analyse statistique
RESULTATS
Mutations d’XPO1 dans le LHc au moment du diagnostic initial
Analyse du taux de réponse et de la survie
Analyse de lignées cellulaires de Hodgkin
Intérêt de l’ADN plasmatique dans le suivi de la maladie résiduelle (MRD)
DISCUSSION
ANNEXES
Annexe 1 – Stades de Ann Arbor
Annexe 2 – Index pronostiques dans le lymphome de Hodgkin classique
Annexe 3 – Echelle de Deauville 5 points
Annexe 4 : Critères de réponse modifiés IHP 2007 (45)
Annexe 5 – Caryotype des 94 patients inclus dans l’étude
Annexe 6 – Résultats détaillés de PCR digitale pour les 94 patients
Annexe 7 – Manuscrit publié présentant la méthode de PCR digitale
Annexe 8 – Manuscrit original, en révision dans la revue Haematologica
BIBLIOGRAPHIE

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